嘌呤核苷磷酸化酶/嘧啶核苷磷酸化酶共表达及固定化催化合成阿糖核苷

将嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和尿苷磷酸化酶(UP)进行共表达和双酶固定化,提高生物法合成阿糖核苷过程中底物转化率和催化剂稳定性。首先,构建大肠杆菌内源(PNP)和(UP)过表达工程菌,考察工程菌催化不同阿糖核苷之间转化的效率。将PNP和UP双酶固定化,并对固定化双酶进行回收利用,考察重复使用过程中固定化双酶的催化效率。结果表明:工程菌催化阿糖尿苷和腺嘌呤生成阿糖腺苷的反应最高转化率可达93.6%。固定化双酶催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷的最高转化率可达99.8%。重复回收使用固定化双酶19次后对底物的转化率达到60.6%,累计有效催化时长可达684 h。PNP和UP的双酶耦合体系能高效催化阿糖核苷之间的转化,固定化修饰有利于延长酶的使用寿命,为生物法生产核苷类似物提供重要科学参考。

C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响

为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后,构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E.coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达,并对其酶学性质进行了表征。结果表明,ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时,ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg,较TsGP提高1.3倍。在50~65℃的工业酶催化条件下,ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当,且酶活力更高。此外,ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性,最小底物为麦芽三糖,且随着底物链长的增加,比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物,ΔTsGP的kcat值为37.09 s^(−1),比TsGP提高了1.21倍,但底物亲和力(K_(m)=3.30 mmol/L)降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴,并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。

蔗糖磷酸化酶的异源表达及合成蜜二糖条件优化

为挖掘蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,SPase)合成蜜二糖的潜力、降低蜜二糖制备的工业成本,该研究利用大肠杆菌对SPase基因进行异源表达,通过镍柱纯化后表征其酶学性质,采用响应面试验优化合成蜜二糖的最佳反应条件,成功将芒果源肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的SPase基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得可溶性SPase。酶学性质研究结果表明其比酶活为78 U/mg,最适反应温度和pH值分别为40℃和6.0。以此为基础利用SPase进行蜜二糖的合成优化,结果表明,在40℃条件下,添加200 g/L蔗糖、400 g/L D-半乳糖和390 U/L的SPase,反应24 h最高可获得浓度为(34.20±0.92)g/L的蜜二糖。

长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质

为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷(isopropylthio⁃β⁃D⁃galactoside,IPTG)浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到(730.35±0.58)U/mL,比酶活达到(95.22±2.45)U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为(266.80±23.76)mmol/L,Vmax值为(0.2350±0.0099)mmol/(L·min)。

纤维二糖磷酸化酶表达条件的优化及其酶学性质研究

纤维二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase,CBP)磷酸化裂解纤维二糖为葡萄糖-1-磷酸,它是木质纤维素转化淀粉的关键酶。该研究将来源于Clostridium thermocellum YM4的cbp基因通过表达载体pET-28a(+)构建重组菌Rosetta(DE3)/pET-28a-CBP用于表达CBP。对其诱导表达条件进行优化,结果显示当诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度和诱导时间分别为15℃、0.2 mmol/L和12 h时CBP酶活力最高,为0.47 IU/mL。进一步利用Ni柱分离纯化出带有His标签的CBP,结果表明该重组酶分子质量为95 kDa,比酶活1.03 IU/mg;最适反应温度60℃,最适反应pH 6,半失活时间为60 min;金属离子Cu^(2+)显示出对该酶有强烈的抑制作用,然后依次是Zn^(2+)、Fe^(3+)、Ca^(2+)、Mn^(4+)(P<0.05);而K^(+)、Mg^(2+)和Na^(+)对该酶活力无显著性影响(P>0.05);最后对重组CBP的动力学参数进行了表征,K_(m)值为19.61μmol/mL,V_(max)值为1.19μmol/(mL·min)且K_(cat)值为21.38 s^(-1)。

甲硫腺苷磷酸化酶、组蛋白赖氨酸三甲基转移酶蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)、组蛋白赖氨酸三甲基转移酶(SETD2)蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法将2018年11月至2019年11月在苏州市中西医结合医院进行手术治疗并经术后病理学检查证实的86例结直肠癌病人作为研究对象,并收集齐其癌组织标本以及对应的癌旁组织标本。采用免疫组织化学染色法检测所有标本MTAP、SETD2蛋白表达水平。采用χ^(2)检验和多因素Cox回归法探讨MTAP、SETD2蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征、预后的关系。结果结直肠癌组织中MTAP、SETD2阳性表达率(30.23%、27.91%)分别低于癌旁组织(58.14%、62.79%)(P<0.05)。MTAP、SETD2阳性表达水平随着TNM分期越晚、分化程度越低、伴有淋巴结转移而降低(P<0.05)。MTAP阳性3年生存率(73.08%)明显高于阴性(43.33%)(P=0.011);SETD2阳性3年生存率(70.83%)高于阴性(45.16%)(P=0.011)。单因素、多因素分析得出,TNMⅢ~Ⅳ期、伴淋巴结转移、低分化、MTAP阴性、SETD2阴性表达均为影响结直肠癌预后的危险因素(P<0.05)。结论直肠癌组织中MTAP、SETD2蛋白均呈低表达,其表达水平可能参与疾病发展,可成为评估病人预后不良的有效生物学指标。

血清高迁移率族蛋白B1、糖原磷酸化酶同工酶BB与脓毒症患儿心肌损伤指标及预后相关性分析

目的 探讨血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB)与脓毒症患儿心肌损伤指标及预后相关性。方法 回顾性选取2020年6月至2023年6月电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院收治的100例脓毒症患儿,参考有无心肌损伤分为有损伤组(n=50)与无损伤组(n=50)。比较两组患儿心肌损伤指标[心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白]与血清HMGB1、GPBB水平,采用Pearson相关系数分析对心肌损伤指标与HMGB1、GPBB相关性;同时,参考有损伤组患儿1个月预后状况将其划分为存活组和死亡组,经单因素和多因素Logistic回归分析影响脓毒症患儿预后的因素。结果 有损伤组患儿血清cTnI、CK-MB、肌红蛋白、HMGB1、GPBB水平分别为(0.24±0.04)μg/L、(23.19±5.52) U/L、(99.64±13.15)μg/L、(152.54±29.23) pg/mL、(24.34±2.79) ng/mL,均明显高于无损伤组[(0.09±0.03)μg/L、(13.23±4.69) U/L、(31.05±8.78)μg/L、(137.26±24.25) pg/mL、(9.83±1.98) ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。cTnI、CK-MB、肌红蛋白水平与HMGB1、GPBB水平呈正相关(P<0.05)。单因素分析显示,性别、年龄、体重指数、病因、白蛋白、总胆红素、白细胞计数等与患儿预后无关,差异均无统计学意义(P>0.05);脓毒症休克比率、APACHEⅡ评分、SOFA评分、血肌酐、尿素氮、前白蛋白、cTnI、HMGB1及GPBB水平均与患儿预后显著相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,cTnI水平过高、HMGB1水平过高、GPBB水平过高、伴发脓毒症休克和APACHEⅡ评分过高是影响脓毒症患儿预后的危险因素(P<0.05)。结论 脓毒症心肌损伤患儿血清HMGB1、GPBB水平均显著上升,高水平HMGB1、GPBB与脓毒症心肌损伤密切相关,且是脓毒症心肌损伤患儿预后不良的危险因素。及时、精准监测HMGB1、GPBB水平变化有益于防治脓毒症心肌损伤及改善预后。

OsPHR2对小麦酸性磷酸化酶活性和根系土壤有机酸含量的影响

为了明确水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2对小麦酸性磷酸化酶活性、根系土壤有机酸含量和根系活力的影响,以转OsPHR2小麦纯合株系和受体对照为试验材料,在不施磷(低磷)、施易溶性磷(0.200 g·kg^(-1),KH_(2)PO_(4)为磷源)和施难溶性磷(0.200 g·kg^(-1),以AlPO_(4)为磷源)3个处理下开展转OsPHR2小麦酸性磷酸化酶活性、根际土壤有机酸含量和根系活力的研究。结果表明,拔节期、抽穗期和灌浆期,在低磷和施AlPO_(4)处理下2个转OsPHR2小麦株系旗叶和根部酸性磷酸化酶活性均显著高于受体对照;施KH_(2)PO_(4)处理下,2个转基因株系旗叶酸性磷酸化酶活性在抽穗期和灌浆期均显著高于对照,根部在抽穗期显著高于对照,其他时期差异均不显著。随着小麦生育进程,小麦根际土壤草酰乙酸、草酸、乙酸、丙二酸和柠檬酸等有机酸含量逐渐增加。拔节期和抽穗期,在低磷、施AlPO_(4)和施KH_(2)PO_(4)处理下转基因系OsT5-28根际土壤五种有机酸含量均显著高于对照。转基因小麦根际土壤有机酸含量较对照的提高幅度在拔节期或抽穗期较大。三种处理下转基因系OsT5-28根系TTC还原力在三个时期均显著高于对照。这说明低磷胁迫下OsPHR2可提高小麦酸性磷酸化酶活性和根系活力,促进根系有机酸的分泌,增加分泌量,从而提高小麦磷素吸收效率。

香港牡蛎糖原合酶与糖原磷酸化酶基因多态性研究及糖原含量性状相关分子标记挖掘

香港牡蛎是我国南方沿海地区的主要经济贝类,糖原含量是衡量其品质高低的重要指标之一。本研究在转录组测序基础上,以三墩群体(SD,60只个体)和大风江群体(DFJ,90只个体)为研究对象,采用ELISA方法检测每个香港牡蛎糖原含量,并利用片段长度差异等位基因特异性PCR(Fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)技术开展糖原合酶和糖原磷酸化酶基因多态性研究,开发单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记。结果共开发25个SNPs,其中4个SNPs(Ch_GS680,Ch_GS1248,Ch_GP992和Ch_GP1962)在实验群体中分型成功,SPSS关联分析显示SNP位点Ch_GS680与糖原含量显著关联(P<0.05),暗示其可作为香港牡蛎糖原含量性状的潜在分子标记,研究结果为高糖原含量香港牡蛎新品种的分子标记辅助选育奠定了基础。

雌激素对宫腔粘连子宫整合素αvβ3及胸苷磷酸化酶表达的影响

目的揭示整合素αvβ3及胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TYMP)在治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)中的作用,探索雌激素改善IUA大鼠子宫内膜组织容受性的可能机制,为临床上治疗IUA提供方法。方法将18只SD雌性大鼠适应性喂养后,取6只做体外实验,其余12只随机分为模型组和治疗组,每组6只。所有大鼠于动情期以95%乙醇损伤双侧宫腔造模,造模成功后第14天,模型组开始予以生理盐水2 ml灌胃,治疗组予以雌激素2 ml灌胃。造模28天后处死模型组及治疗组大鼠,取出子宫经甲醛固定后行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,观察各组大鼠子宫内膜组织形态,行免疫组织化学法观察整合素αvβ3及TYMP在各组宫腔中的表达情况。体外实验组大鼠于造模成功后第14天处死,将子宫取出分为2 cm大小一段,将子宫组织置于雌激素培养液中,在处理后的0min、30 min、45 min、60 min行Western blot检测整合素αvβ3及TYMP的蛋白表达水平。选取行宫腔镜检查发现宫腔形态正常的患者及IUA患者各15例,通过宫腔灌洗收集宫腔灌洗液,将采集的临床标本采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time-polymerase chain reaction,qPCR)检测临床标本中整合素αvβ3及TYMP mRNA的相对表达量。结果HE染色发现,与模型组相比,治疗组的宫腔形态得到了一定程度的改善,内膜厚度增加,间质中有大量排列整齐的腺体,可见新生血管。免疫组织化学染色结果提示,与模型组相比,治疗组的整合素αvβ3及TYMP的表达水平均明显升高。大鼠子宫体外实验雌激素处理30 min后TYMP的表达显著高于雌激素处理0min,差异具有统计学意义(P<0.05);雌激素处理30 min、45 min、60 min后整合素αvβ3的表达显著高于雌激素处理0min,差异均有统计学意义(P<0.05)。粘连子宫内膜中的整合素αvβ3及TYMP mRNA表达水平明显低于正常宫腔患者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论整合素αvβ3及TYMP蛋白可作为子宫内膜容受性的评价指标。雌激素可能通过上调整合素αvβ3及TYMP蛋白的表达,促进子宫内膜生长,有效缓解IUA情况,改善子宫内膜容受性。

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。

乳腺癌组织内缺氧诱导因子-1α、胸苷磷酸化酶、血管内皮生长因子表达水平及其与淋巴结转移的关系

目的探讨乳腺癌组织内缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、胸苷磷酸化酶(TP)及血管内皮生长因子(VEGF)表达水平及其与淋巴结转移的关系,以期为临床提供参考。方法选取2017年9月至2022年9月于青岛市城阳区人民医院接受手术治疗的80例乳腺癌患者为研究对象进行回顾性分析,检测患者乳腺癌组织和癌旁乳腺组织中HIF-1α、TP及VEGF水平,探讨其与临床病理特征的关系。结果乳腺癌患者癌组织中HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。导管浸润组与非导管浸润组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高分化组、中分化组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率低于低分化组(P<0.05);高分化组与中分化组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。I期组和Ⅱ期组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率低于Ⅲ期组(P<0.05);I期组与Ⅱ期组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。有转移组患者HIF-1α、TP及VEGF阳性表达率高于无转移组(P<0.05)。结论HIF-1α、TP及VEGF在癌组织中均呈阳性表达,且与淋巴结转移密切相关。

用定位突变方法对兔肌肉糖原磷酸化酶活性调控的研究

糖原磷酸化酶的活性可以通过酶分子中Ser14的磷化及去磷酸化进行调控。X -射线衍射结构的结果已经推测在兔肌肉糖原磷酸化酶分子中Arg69对该酶磷酸化构型的改变至关重要。定位突变这氨基酸残基 ,得到突变体Arg69→Glu ,酶动力学分析显示磷酸化酶的活性 ,突变型酶比野生型酶大大降低 ,这与X -射线衍射结构的推测完全一致 ,也说明了Arg69在糖原磷酸化酶别构开关的分子构型上的重要作用。

新型糖原磷酸化酶抑制剂熊果酸衍生物的合成及其生物活性

目的:通过研究五环三萜类新型糖原磷酸化酶抑制剂的构效关系,发现新型降血糖药物。方法:以熊果酸为先导化合物,对其进行结构修饰和抑制兔肌肉糖原磷酸化酶活性的测试。结果:共合成15个熊果酸衍生物,其结构经IR、1H NMR、MS和元素分析确证;生物活性测试显示:熊果酸(IC50=9μmol/L)是一个中等强度的糖原磷酸化酶抑制剂,大部分合成衍生物都显示出一定的抑制糖原磷酸化酶的活性。结论:抑制肝糖原降解是熊果酸的降血糖作用机制之一,对熊果酸C-28位的结构改造值得进一步研究。

糖原磷酸化酶抑制剂山楂酸对小鼠血糖和肝糖原的影响(英文)

目的:考察糖原磷酸化酶抑制剂山楂酸对正常和实验性高血糖模型小鼠的降血糖作用及对肝糖原的影响,初步探讨其降糖机制。方法:山楂酸灌胃7天,分别以皮下注射肾上腺素,口服葡萄糖造成小鼠高血糖模型,与正常组一起测定静脉血糖和肝糖原含量。结果:山楂酸可显著对抗肾上腺素、葡萄糖引起的血糖升高,对抗肾上腺素引起的肝糖原降解,增加葡萄糖致高血糖小鼠肝糖原含量;可增加正常小鼠肝糖原储备,但不影响正常血糖。结论:山楂酸具有降血糖作用,机制与其抑制肝糖原分解有关。

电针对家兔缺血心肌糖原、磷酸化酶的影响

结扎５０只家兔冠状动脉左心室支３０分钟，结扎即时给予电针“内关“１０分钟，计算心室肌糖原和磷酸化酶减少和耗竭的面积，电针组存在较多的糖原和酶，与非针组之间具有显著差别。说明电针改变了缺血边缘区心肌糖原和酶的含量，因而有益于缺血的心肌。缺血后左心室腔明显扩张，而结扎后电针组左心室腔多数相似于假手术组，证明电针可加强心肌收缩力。

长牡蛎糖原磷酸化酶基因SNPs与生长性状和糖原含量的相关性分析

为研究糖原磷酸化酶基因多态性与长牡蛎(Crassostrea gigas)生长和糖原含量的相关性,本研究对长牡蛎糖原磷酸化酶基因(Cg-GPH)编码区单核苷酸多态性(SNPs)与来自5个家系322个长牡蛎个体的生长性状(包括壳高、壳长、壳宽、总体质量以及软体部质量)和糖原含量进行了关联分析。结果表明,在1 940 bp的长牡蛎糖原磷酸化酶基因中共检测到82个SNPs位点,其中63个SNPs位点位于外显子区域,1个SNPs位点位于5′-UTR区,18个SNPs位点位于3′-UTR区,编码区SNPs平均密度为1/25 bp;5个SNPs位点与生长性状存在显著相关(P<0.05),未检测到与糖原含量相关SNPs。根据以上5个SNPs位点共构建得到6个SNP单倍型,其中,Cg-GPH基因的H6(CTGAT)单倍型在总体质量性状方面均显著高于其他5种单倍型(P<0.05),表明H6单倍型可能是对长牡蛎体质量增加最有利的单倍型。研究结果为今后长牡蛎生长性状的遗传改良提供了基础资料。

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌 (Enterobacteraerogenes)突变株EAM Z1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶 (UPase)。经测定这种Upase的分子量为 1 2 .8× 1 0 4,亚基分子量为 4 .3×1 0 4,由 3个同型亚基组成。N端氨基酸序列为 :MRMVDLIATKRDGGE。等电点为 4 .46。对尿苷的Km为 0 .2 9mmol L。酶反应的最适pH为 7.8,最适温度为 50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5 氟尿苷、2′ 脱氧 5 氟尿苷及尿嘧啶 β D 阿拉伯呋喃糖 ,且具有较高的转移酶活性 ,能将尿苷和 5 氟尿嘧啶转化成 5 氟尿苷 (一种抗癌药物的中间体 ) ,其转化率为 47%。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。

蔗糖磷酸化酶制备及应用的研究进展

蔗糖磷酸化酶作为一种葡萄糖基转移酶,具有广泛的底物特异性,能够催化合成α型熊果苷、低聚糖等多种物质,在食品、化妆品、医药行业具有广泛的应用。该文综述了蔗糖磷酸化酶的结构等生化特性及其催化特性,并介绍了目前高产蔗糖磷酸化酶的主要生产菌株,以及该酶的应用及市场前景,并结合国外研究的热点及其研究进展,提出了国内开展课题研究方向。

高血压大鼠不同血管平滑肌肌球蛋白磷酸化和脱磷酸化酶的变化

本文比较了正常和高血压大鼠不同动脉血管肌球蛋白轻链激酶（MICK和依赖Ca2+的钙调素磷酸酶（Ca2+／CaM－PP）活性的变化。结果表明：在自发性高血压大鼠（SHR）不同血管MLCK的活性不同，依次为主动脉（A）＞尾动脉（CA）＞肠系膜动脉（MA）；而在WKY大鼠，该酶在不同血管的活性依次为A＜＜CA＜＜MA。在WKY大鼠，MACa+／CaM-PP活性明显高于SHR．在肾性高血压大鼠（RHR）的不同血管Ca2+／CaM－PP活性与Wistar大鼠比较，无明显差异。上述结果表明：MLCK活性升高或／和Ca2+／CaM－PP活性（或水平）降低可能与血管收缩及高血压发病有关。