胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的 从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。 方法 利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。 结果 分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。 结论 从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 。

微管相关蛋白Doublecortin在成年大鼠神经元前体细胞发生中的表达

目的:探索神经元前体细胞的微管相关蛋白Doublecortin(DCX)在成年大鼠神经元前体细胞发生中的表达,为神经元前体细胞的增殖和迁移研究提供理论及实验基础。方法:将大鼠脑组织行冰冻切片,采用免疫组化在光镜下观察DCX免疫阳性细胞的表达部位和形态特点。结果:神经元前体细胞的标志物DCX主要分布在4个神经发生相关区域:室下区、齿状回的粒下层、吻侧迁移流和嗅球。然而在皮质等无神经发生的区域只有极少量的DCX免疫阳性细胞。DCX免疫阳性细胞在形态上均呈梭形的胞体和单个的前导突起。结论:DCX免疫阳性细胞的形态符合神经元前体细胞的形态特征。DCX作为神经元前体细胞的标志物可以用来研究神经元前体细胞的增殖和迁移。

成年大鼠局灶性脑梗死后神经元前体细胞的迁移研究

目的探讨成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注后梗死灶周神经元前体细胞的迁移特征。方法建立一侧大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型,应用免疫组化及细胞记数检测缺血再灌注后1、7、14、21 d梗死灶周神经元前体细胞的变化。结果各个时相点的梗死灶周均可见神经元前体细胞;在缺血再灌注后第7天阳性细胞的数量达到高峰,随后逐渐下降;但在梗死区域的镜像区域未见到阳性细胞的表达。结论成年大鼠大脑中动脉栓塞缺血再灌注可激活神经元前体细胞的发生,并诱导神经元前体细胞朝着梗死区域迁移。

正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移

目的探讨正常成年大鼠脑中神经元前体细胞的迁移路径和迁移特征,为病理状况下的神经元迁移研究提供理论和实验基础。方法将成年大鼠脑组织按冠状位和矢状位行冰冻切片(片厚20μm),采用免疫组织化学染色技术观察Doublecortin(DCX)免疫阳性细胞的迁移路径以及DCX阳性细胞的迁移特征。结果正常成年大鼠神经元前体细胞的迁移主要有两条路径:一条是从室下区到嗅球的吻侧迁移流,另一条是位于皮层和胼胝体之间的胼胝体周围迁移流。吻侧迁移流中的DCX免疫阳性细胞较规则的有序排列,形态上呈梭形的胞体和单个较长的前导突起,前导突起基本朝向嗅球,细胞大小基本一致:而胼胝体周围迁移流中的DCX免疫阳性细胞胞体呈类圆形,突起的大小、数目和方向多样。结论研究神经元前体细胞的迁移不仅有助于明确其迁移的具体机制,而且有助于控制神经元的迁移和设计有效的治疗策略。

成年大鼠局灶性脑梗死后齿状回神经元前体细胞的发生研究

目的初步探讨脑缺血后神经元前体细胞的发生机制。方法建立一侧大脑中动脉缺血再灌注模型,应用神经元前体细胞的标志物DCX(Doub lecortin)检测缺血再灌注后不同时相点海马齿状回神经元前体细胞的增殖情况。结果再灌注后第7天梗死侧及非梗死侧齿状回DCX阳性细胞数达到最高峰,与相应假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05);同时各个时相点梗死侧与非梗死侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05);再灌注后第21天双侧齿状回DCX阳性细胞数基本恢复至正常水平。结论局灶性脑缺血可以诱导成年大鼠神经元前体细胞的发生,这对于脑缺血后的神经修复可能起关键性作用;其机制可能是缺血区域产生的一些神经发生调节因子弥散到神经发生区域所致。

GDNF对PD模型大鼠黑质神经祖细胞和神经元前体细胞增殖及分化的影响

目的探讨胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)对帕金森病(PD)模型大鼠黑质内神经祖细胞和神经元前体细胞增殖和分化的影响。方法大鼠右侧纹状体内注射6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)建立模型,行为学分析筛选PD动物模型。将动物模型分为4组:动物模型对照组(右侧黑质内不注射);PBS组(右侧黑质内注射PBS);GDNF组(右侧黑质内注射GDNF);EGF+GDNF组(右侧黑质内注射EGF+GDNF)。动物继续存活21天。免疫组织化学染色方法检测黑质内酪氨酸羟化酶(TH)、Ⅲ型β-微管蛋白(Tuj1)、巢蛋白(Nestin)免疫反应阳性细胞,光镜下观察并进行细胞计数,统计学分析处理数据。用Western blot方法分析黑质TH、Tuj1、Nes-tin蛋白的表达,蛋白条带用图象处理仪扫描,用LabWorks软件分析处理。结果在GDNF组及EGF+GDNF组大鼠出现显著的行为学功能恢复的同时,其TH反应阳性神经元数量和TH蛋白表达均显著高于对照组,且能同时检测到这里有Tuj1反应阳性细胞及Tuj1蛋白表达。但仅在EGF+GDNF组检测到Nestin反应阳性细胞及Nestin蛋白表达。结论GDNF能促进PD模型大鼠黑质内神经元前体细胞向多巴胺能神经元方向分化。

成年大鼠局灶性脑缺血对颗粒下层区神经元前体细胞增殖的影响

目的探讨成年大鼠局灶性脑缺血后齿状回颗粒下层(SGZ)神经元前体细胞的增殖改变。方法大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO/R),术后第1天、第2天腹腔注射Brdu,第3天、7天、14天和28天取脑,每个时间组6只SD大鼠,冷冻切片,免疫荧光三标检测SGZ区5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)、DCX、ki67、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及CNP的表达。结果 (1)MCAO/R后,SGZ区增殖细胞聚集成簇,细胞簇计数从3d开始增加,7d时最多,随后下降;(2)细胞簇内细胞计数从3d开始增加,7d时最多,随后下降;(3)细胞簇中ki67(+)细胞比例从3d开始到28d逐渐下降。结论 MCAO/R引发SGZ区神经元前体细胞经多次分裂以成簇方式增殖,部分子代细胞向神经元分化,部分子代细胞仍保持增殖能力。

神经干细胞向神经元前体细胞分化过程中NMDA受体介导的电流变化

背景:NMDA受体是脑内主要的兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性受体,参与中枢神经系统许多重要的生理和病理过程。目的:观察体外培养的SD大鼠海马区的神经干细胞及神经前体细胞在发育过程中NMDA受体介导的全细胞电流的变化情况。方法:应用细胞免疫化学方法观察神经干细胞的nestin以及分化1,3,7d神经前体细胞的βⅢ-tubulin表达情况。应用全细胞膜片钳技术在-60mV钳制电压下记录神经干细胞和神经前体细胞电流。将神经干细胞和神经前体细胞和分为对照组和实验组,对照组加入无Mg2+的细胞外液;实验组加入10,20,50,100μmol/LNMDA。结果与结论:神经干细胞的NMDA受体未检测到介导电流产生;分化1,2d的神经元前体细胞未检测到电流;分化3,7d的神经元前体细胞能够检测到电流,随着NMDA剂量的增加电流也在增大;分化7d的神经元前体细胞在相同剂量的NMDA诱导产生的电流较分化3d的产生的电流大。提示:①实验中未检测到神经干细胞的NMDA介导电流产生。②神经前体细胞第3天时检测到NMDA介导电流。③随着神经前体细胞分化的进展,NMDA介导电流在增大。

无血清培养条件下神经元前体细胞的增殖

目的:建立新生大鼠大脑皮层细胞原代培养体系并进行神经元前体细胞的增殖研究。方法:原代混合培养新生大鼠大脑皮层细胞;混合培养体系用血清培养基培养6d后换用无血清培养基培养,免疫细胞化学显色鉴定此培养过程中不同时间点的细胞类型,并在不同时间段加入BrdU,用于分析神经元前体细胞的增殖状况。结果:换用无血清培养基培养后,出现明显的细胞分层现象;神经元及其前体细胞的比例逐渐上升,而神经干细胞和星形胶质细胞的比例缓慢下降;增殖细胞的比例在0～24h、24～48h、48～72h时间段里逐渐增加,而在72～96h、96～120h时间段里逐渐减少。结论:新生大鼠大脑皮层细胞混合培养体系在无血清培养条件下促进神经元前体细胞的增殖。

离体培养的生后大鼠脑室下层神经元前体细胞免疫细胞化学和形态学研究

为了探讨生后大鼠脑室下层神经元前体细胞离体培养时的神经活性物质特征和形态学特征 ,本研究以细胞特异性的抗体进行免疫细胞化学反应并测量了这些细胞的形态学指标胞体平均直径和胞体椭圆率 (胞体最小径与最大径的比值 )。取脑室下层细胞接种于覆有多聚赖氨酸的 2 4孔培养板 ,培养液为 Neurobasal Medium( Gibco) /B2 7,培养条件为 5 % CO2 ,3 7℃。结果如下 :在培养 1d时 ,绝大多数 (大于 90 % )脑室下层源细胞呈 β-3型微管蛋白阳性 ,且这些细胞也都表达多唾液酸神经粘连分子。此时 ,大多数β-3型微管蛋白阳性细胞胞体呈椭圆形 (胞体平均直径为 8.42± 1.0 3μm;胞体椭圆率为 0 .5 7± 0 .12 ) ,且在其两极各长出一短的、无分支的突起 ;并有近 2 0 %者为球形无突起细胞 (胞体平均直径为 7.2 0± 1.0 4μm) ,且它们大多呈细胞与细胞相连接状态。随着培养时间的延长 ,这些细胞亦呈上述椭圆形有突起样细胞变化 ,但仍可见它们呈串珠样连接。培养至第 3～5 d,这些脑室下层源细胞的体积增大 (胞体平均直径为 9.0 7± 1.0 7μm)、突起较前增长但仍几无分支。免疫细胞化学反应显示 ,此时培养中的脑室下层源细胞仍大多呈β-3型微管蛋白阳性和多唾液酸神经粘连分子阳性。至培养的第 7d。

碱性成纤维细胞生长因子对脑室下层神经元前体细胞的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对离体培养的生后大鼠前脑脑室下层 (SVZ)神经元前体细胞增殖、分化的影响。方法 取体重 10 0～ 15 0g雄性SD大鼠SVZ细胞进行离体培养 ,培养液分别为NeurobasalMedium/B2 7和NeurobasalMedium/B2 7+bFGF。倒置显微镜下观察其生长变化的形态学特征 ,并作细胞计数 ;免疫细胞化学染色观察其神经化学性质。结果 ①培养液中添加bFGF者 ,其SVZ源神经细胞的数目明显多于未添加bFGF者 ;②在该 2种培养液条件下 ,SVZ源神经元前体细胞都能分化为成熟神经元 ,且其中的大多数神经元是γ-氨基丁酸能神经元 ,只有少量神经元是谷氨酸能或多巴胺能神经元。结论 ①bFGF能促进离体培养的生后大鼠SVZ源神经元前体细胞的增殖 ;②在特定的培养条件下 ,生后大鼠SVZ源神经元前体细胞能分化为不同性质的神经元。

大鼠脑室下层神经元前体细胞的离体研究

：目的 观察生后大鼠前脑侧脑室脑室下层（ＳＶＺ） 神经元前体细胞离体培养时的化学特征和形态学特征。方法 以细胞特异性的抗体作免疫细胞化学染色和通过测量每个ＳＶＺ源的培养的神经元前体细胞的形态学指标（胞体平均直径和胞体椭圆率），来分析这些ＳＶＺ源细胞的特征。结果 离体培养的绝大多数ＳＶＺ源细胞（大于９０％ ）呈３ 型β－ 微管蛋白（ＴｕＪ１）阳性，且它们亦都表达多唾液酸神经细胞粘连分子（ＰＳＡ－ Ｎ－ ＣＡＭ）。随着培养时间的延长，这些ＴｕＪ１ 阳性的ＳＶＺ源细胞表现出显著的形态学变化：呈典型的神经细胞表型，其胞体增大、突起长且分支明显。结论 在出生后大鼠的前脑侧脑室脑室下层确含有神经元前体细胞，且其在离体条件下仍呈ＰＳＡ－ Ｎ－ ＣＡＭ阳性，并能增殖、分化为新的神经细胞。

小鼠大脑皮层中ADAM17表达的降低对神经元前体细胞外向迁移的抑制作用

在发育过程中神经元前体细胞的外向迁移对于大脑皮层的多层结构建立有着重要作用.金属蛋白酶家族的成员ADAM17(A Disintegrin And Metalloprotease 17)对于多种膜蛋白的成熟释放有着重要作用,包括多个表皮生长因子受体的配体以及Notch等蛋白.这些底物中有多个对神经干细胞的增殖、分化、迁移都有重要作用.为了探讨ADAM17在大脑皮层发育过程中的生理作用,结合RNAi和IUE的技术,降低小鼠大脑发育阶段中ADAM17的表达.结果显示:用RNAi降低ADAM17在小鼠大脑皮层发育14—18d中的表达,会造成神经元前体细胞的外向迁移障碍,使得细胞停留在脑室下区.

中间神经元前体细胞株GE6在不同分化条件下小RNA的表达

本研究通过分析小RNA(microRNAs)在大鼠大脑中间神经元前体细胞株GE6体外分化中的表达,筛选出在中间神经元前体细胞系分化成熟过程中特异性表达的小RNA,并预测分析其可能在此过程中的功能。实验中,将GE6在三种不同条件下培养,即:不加入任何其他生长因子,正常分化培养4天的GE6(Ge6_4d);加入骨形态发生蛋白-2(BMP2)后分化培养4天的GE6(Ge6_bmp2);以及加入音猥因子(SHH)后分化培养4天的GE6(Ge6_shh)。设阴性对照组为未分化的GE6(Ge6_u)。四组GE6细胞进行细胞免疫荧光染色、qRT-PCR以及小RNA芯片检测分析。通过四组细胞的两两比较、筛选及分析发现,多种小RNA在GE6细胞的分化过程中含量有明显变化。miR-710、miR-290-5p和miR-3473等在加入分泌因子BMP2的GE6细胞中含量显著上调。这些小RNA可能对大鼠中间神经元分化起到重要的调控作用。

嗅球在神经元迁移过程中的导向作用研究进展

嗅球中的中间神经元来源于从哺乳动物前脑室下区迁移而来的神经元前体细胞,以往众多的研究均发现嗅球在神经元迁移过程中没有任何导向作用。最近的研究发现嗅球能分泌一种对神经元前体细胞具有吸引性导向作用的物质,从而吸引神经元前体细胞朝嗅球迁移。嗅球具有吸引性导向作用的发现解释了神经元前体细胞在头端迁移渠道中能有序迁移的部分机制,但至今仍不明确此种物质的分子特性。

γ-分泌酶抑制剂DAPT对神经前体细胞系分化的作用研究

本研究目的为探究γ-分泌酶抑制剂DAPT(3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S苯基甘氨酸t-丁酯)对神经元前体细胞系分化的影响,检验经DAPT诱导产生更多可用于移植的神经元的可能性。培养神经元前体细胞系GE6时,以培养基中加入4μmol/L DAPT的为实验组,不加DAPT的为对照组,分化4d,采用免疫荧光染色的方法分别检测两组细胞Tuj1、GFAP、O4的阳性率,采用qRT-PCR分别检测两组细胞Tuj1mRNA、GFAP mRNA相对表达量。免疫荧光染色表明实验组Tuj1阳性率较对照组增加,而GFAP和O4的阳性率较对照组减少,这些差异均有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR中两组Tuj1和GFAP mRNA的变化趋势与免疫荧光染色结果一致。结果提示DAPT能促进神经元前体细胞系向神经元分化,抑制其向胶质细胞分化,可以用DAPT诱导产生更多的可用于移植的神经元。

脑室下层细胞形态及分布的研究

目的 观察侧脑室脑室下层细胞的形态及分布。方法 制作成年大鼠侧脑室脑室下层的超薄切片和全脑连续石蜡切片。结果 脑室下层细胞主要分布在侧脑室外侧壁 ,从侧脑室出现平面延续到尾壳核消失平面。其中的神经元前体细胞胞质游离核糖体较多 ,核大 ,核内的染色质疏松。结论 脑室下层细胞和尾壳核及伏隔核相邻 。

嗅茎切断对脑室下层细胞迁移的影响

为探讨嗅茎切断对大鼠前脑侧脑室脑室下层细胞迁移的影响 ,本实验在嗅球后切断嗅茎 ,手术后 30 d、6 0 d后灌注固定处死 ,制作脑的连续石蜡切片 ,计量嗅球后份平面吻侧迁移流的细胞密度 ,计算机图象分析吻侧迁移流横截面积 ,用免疫组织化学技术对吻侧迁移流内的细胞进行定性分析。结果发现 ,手术切断嗅茎导致手术侧吻侧迁移流细胞在切断平面的尾侧细胞密度增加 ,吻侧迁移流的横截面积增大 ,积聚的细胞为多唾液酸 -神经细胞粘附分子阳性的神经元前体细胞。结果提示 。