禽脑脊髓炎病毒结构蛋白VP3基因真核表达载体的构建及其免疫

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒(AEV)1 143株结构蛋白VP 3基因的序列,设计1对特异性引物,经PCR从原核表达载体pET-VP 3中扩增出VP 3基因片段,克隆入T载体经测序证明所扩增的序列正确。从T载体切下目的片段,定向克隆入pcDNA 3.1(+)载体,转化大肠杆菌DH 5α,鉴定后大量提取质粒,转染CO S-1细胞,用间接免疫荧光检测到目的基因的表达。将重组载体对BALB/c小鼠进行免疫,结果2次免疫后就检测到特异性抗体,表明该载体在动物体内有较高的表达水平,可用于动物体内免疫,为进一步研究AEV的核酸疫苗打下了基础。

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avianencephalomyelitisvirus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列。该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得。基因组全长为7059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴。与已发表的AEV疫苗株1143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97 6%。结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小。与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守。从而进一步确认了AEV的分子特性。

禽脑脊髓炎油乳剂灭活疫苗的研究

选用ＡＥＶ－ＮＨ９３７株Ｅ８－１２为制苗种毒，接种易感鸡胚制备抗原，经甲醛溶液灭活制成的禽脑脊髓炎油乳剂灭活疫苗，物理性状检验、无菌检验、安全检验、效力检验合格，疫苗ＰＤ５０≥３２，疫苗免疫期成鸡至少一年，雏鸡至少半年，疫苗稳定性好，４℃－８℃保存期为１２个月，１０℃－２４℃保存期为６个月。田间试验、中间试制和区域试验安全、有效，反应良好，该疫苗能够预防禽脑脊髓炎的发生。

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

选用AEV(VR株 )CEF适应毒制备抗原 ,免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术以间接ELISA方法筛选获得一株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞。制备细胞上清及腹水进行单抗特性鉴定 ,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS PAGE电泳 ,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于 90～ 110之间 ,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子量为 142KD ,ELISA测定细胞上清效价为 1∶1× 10 4 ,腹水效价为 1∶1× 10 6,与其它病原无交叉反应 ,抗体分泌稳定。

“全胚双氟碳法”制备禽脑脊髓炎琼扩抗原的研究

用禽脑脊髓炎病毒 (AEV) Van Rockel毒株接种 6日龄 SPF鸡胚 ,感染 11d后 ,分别收集鸡胚、绒毛尿囊膜及尿囊液 ,鸡胚剔除羽毛、眼球、爪和喙后与绒毛尿囊膜一起 ,制成匀浆 ,反复冻融 3次。通过 2次氟碳 (三氯三氟乙烷 )从全胚匀浆中萃取制备 AE琼扩抗原 (AGP- Ag)。用进口标准 AE AGP试剂进行标化 ,结果发现 :制备的 AE AGP- Ag与标准阳性血清之间有清晰、致密的沉淀线 ,并与标准 AE AGP- Ag的沉淀线完全吻合 ,表明两者的沉淀反应一致 ,从而建立了 AE AGP- Ag制备新方法——“全胚双氟碳法”。其制备 AEAGP- Ag有如下特点 :1产量高 ,平均每 3个 SPF鸡胚可获得 1m L AE AGP- Ag;2特异 ,与类症阳性血清无交叉反应 ;3敏感 ,AGP试验中毋需重复加样 ,普通琼脂板即可出线 ;4稳定性好 ,保存期长 ;5与标准 AEAGP- Ag阳性检出符合率均达 10 0 %。本研究表明用“全胚双氟碳法”制备的 AEAGP- Ag达到了进口标准 AEAGP- Ag质量 ,可用于 SPF鸡 AE抗体的监测 ,且生产成本低 ,也可用于商品鸡

禽脑脊髓炎的病理学研究

禽脑脊髓炎的病理学研究赵振华，林曦，禹旺盛，郝先谱，顾玉芳，马学恩，李润清，赵心力，王风龙，吉仁泰（内蒙古农牧学院禽脑脊髓炎课题组，呼和浩特０１００１８）禽脑脊髓炎（ＡｖｉａｎＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＡＥ）是由禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）引起...

禽脑脊髓炎油乳剂灭活疫苗免疫效果及免疫机理的研究

用禽脑脊髓炎病毒 (AEV)不同毒株分别接种易感鸡胚所制作的油乳剂灭活疫苗 ,分别给 4组正常 1周龄雏鸡接种免疫 ,另设 1组SPF雏鸡作空白对照。对免疫前后及攻毒后的雏鸡 ,以琼脂扩散试验 ,淋巴因子的提取 ,血清IgG的分离、纯化及检测 ,鸡胚敏感试验 ,病理学观察为检验手段 ,以期对本油乳剂灭活疫苗的免疫效果作出综合评定 ,同时根据各试验的结果对免疫机理作初步的探讨。结果表明 ,各组试验用疫苗均安全有效 ,雏鸡免疫后体内抗体持续保持高水平 ,雏鸡免疫期至少达 37周 ,子代鸡胚敏感试验保护率≥ 92 .3%以上。免疫机理方面 :以IgG为主的体液免疫在抵抗感染过程中起关键作用 ;细胞免疫也同时存在 ,并与日龄的增长存在一定的相关性 。

禽脑脊髓炎病毒YL株的分离鉴定

为弄清陕西杨凌某鸡场种鸡产蛋量突然下降,种蛋孵化率降低,死雏、弱雏增多的原因,通过采集发病鸡脑组织进行SPF鸡胚连续传代、琼脂扩散试验（AGP）、人工感染试验、VP1基因的克隆及序列分析等对病原进行鉴定.结果显示,分离毒YL株与AEV标准阳性血清之间出现特异的沉淀线;在人工感染试验中可见雏鸡有震颤、共济失调等症状,剖检大脑有轻微的水肿和软化;成功克隆出AEV YL株的VP1基因,全长810 bp,编码270个氨基酸残基;与AEV参考毒株VP1基因核苷酸同源性92.0％～99.8％,氨基酸同源性为89.3％～99.3％;进化树分析表明,YL株与1143株、L2Z株和SX株亲缘关系较近,与VR株、HB株、SD株和NH937株亲缘关系较远.结果表明,分离毒株为禽脑脊髓炎病毒,与AEV已知毒株在进化方面存在一定程度的差异.

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。

禽脑脊髓炎病毒的分离鉴定

通过ＳＰＦ鸡胚连续、快速传代，从自然发病雏鸡脑组织中分离出一株禽脑脊髓炎病毒．暂命名为ＡＥＶ－ＮＨ９３７株，该病毒在发病鸡胚的肠上皮细胞、胰岛细胞和大脑神经细胞的胞浆中呈颗粒状，直径２５～３０ｎｍ，对盐酸、氯仿、胰蛋白酶具有抵抗力，在二价镁离子保护下可抵抗热效应（５０℃），病毒滴度６．１６（即ＥＩＤ（５０）＝６．１６），中和指数２４５。

禽脑脊髓炎琼脂扩散沉淀抗原制备与应用的研究

应用禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株和内蒙古禽脑脊髓炎（ＡＥ）自然病鸡分离毒株（ＡＥＶ－ＮＨ９３７株）分别接种鸡胚，制出ＡＥ琼扩沉淀抗原。经实验室和部分鸿场应用结果表明，该抗原具有良好的特异性。抗原效价为１：３２，可检出不同日龄、品种和不同发病期的人工感染鸡和自然发病鸡血清中的ＡＥ抗体，结果可靠，方法简便，可以推广应用。

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体制备

禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）在患鸡体内含量很低，且细胞培养的复制水平也很低，故对该病毒的研究一直不够深入，国外有关ＡＥＶ单克隆抗体的报告首见于１９９４年［１］。本研究制备了３株抗ＡＥＶ单克隆抗体，为ＡＥＶ的实验室诊断提供了一种简单、快速、可靠的方法，同时...

禽脑脊髓炎病毒VP1基因的克隆及表达

应用RT-PCR方法,扩增出AEV Van-roekel株结构蛋白基因VP1,测序结果表明VP1基因全长810 bp,编码270个氨基酸;和AEV 1143株相比,核苷酸同源性为94.2%,氨基酸同源性为99.26%。将VP1基因定向克隆到pGEX-6p-1载体谷胱苷肽转移酶基因的下游,并把重组质粒转入宿主菌BL21中,经IPTG诱导后,VP1基因得以表达。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,确定表达的融合蛋白大小约为58 Ku,且具有良好的反应原性。将表达产物纯化后免疫试验兔,琼脂扩散试验显示免疫血清能与禽脑脊髓炎琼脂扩散标准阳性抗原呈特异反应,表明重组VP1蛋白保留了天然蛋白的部分活性。

禽脑脊髓炎油佐剂灭活疫苗免疫效果观察

将感染了ＡＥＶ－ＶａｎＲｏｃｋｅｌ株的ＳＰＦ全胚磨制的乳剂离心分离，取上清液制成抗原含量不同的两种灭活疫苗。将两种疫苗各接种３月龄的ＳＰＦ鸡，未见接种鸡出现症状。４周后以强毒ＡＥＶ攻击，所有疫苗接种鸡皆被保护，组织学检查进一步证明了疫苗的效力。抗原含量较高的疫苗引起的保护力更好，作者认为攻击时经过脑内接种更适合于临床评价疫苗效力。

双向凝胶电泳分析感染禽脑脊髓炎病毒鸡脑组织蛋白表达图谱

本研究采用双向凝胶电泳分离接毒组(感染AEV)和对照组(不接毒)的鸡脑组织全蛋白,经过银染后,用Image ScannerⅡ光密度扫描仪获取凝胶图像,并用Image Master 2D Platinum软件进行差异蛋白分析。对蛋白斑点编辑后,接毒组中检测到793个蛋白点,对照组中检测到827个蛋白点,两张图谱的匹配蛋白点数为614个,凝胶匹配率为75.8%。差异蛋白分析后,发现在接毒组中有16个蛋白点表达量显著下调,这些蛋白质成份可能与组织细胞病变有关,它们将为认识禽脑脊髓炎的发病机理提供线索。

禽脑脊髓炎病毒不同批次毒种致病性的研究

[目的]探讨不同批次的鸡源及胚源毒种致病性，为有效控制禽脑髓炎（AE）的发生提供参考。[方法]将AEV Van Roekel（VR）株毒种用雏鸡及鸡胚进行繁殖与传代，制备了不同批次的鸡源及胚源毒种，将这些毒种以不同接毒剂量经脑内接种8～10周龄的SPF鸡，进行致病性试验。[结果]不同批次的鸡源毒种致病性均很强，接种后可引起SPF鸡出现严重的禽脑脊髓炎症，不同批次的胚源毒种致病性存在明显差异，有强有弱。[结论]P080603和170807012个批次胚源毒种可以用作AE攻毒效检毒种。