穗花杉双黄酮对人胃癌细胞株增殖、侵袭、迁移、粘附的影响及作用机制探讨

目的观察研究穗花杉双黄酮(AMF)在体外对人胃癌细胞株增殖、侵袭、迁移、粘附的影响,并探讨其作用机制。方法选择BGC-823人胃癌细胞株进行相关试验,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AMF对BGC-823细胞增殖的影响,Transwell侵袭试验观察AMF对BGC-823细胞侵袭的影响,细胞划痕试验观察AMF对BGC-823细胞迁移的影响,细胞粘附试验观察AMF对BGC-823细胞粘附能力的影响,并采用Western bol法检测AMF对与BGC-823细胞侵袭、迁移、粘附相关的基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)表达,以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达的影响。结果MTT试验结果显示,50、100、200、400μmol/L浓度的AMF对BGC-823细胞增殖均有抑制作用,与1‰二甲基亚砜(DMSO)组及空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),且随AMF浓度的增加抑制率逐渐升高,呈现浓度依赖性关系(P<0.05)。Transwell侵袭试验结果显示,与空白对照组相比,AMF 100、200、400μmol/L浓度组侵袭过去的细胞数目均明显低于空白对照组(P<0.05),且随AMF浓度的增加侵袭细胞数目逐渐减少(P<0.05),呈显浓度依赖关系。细胞划痕试验结果显示,与空白对照组相比,AMF 100、200、400μmol/L浓度组迁移至划痕区域内的BGC-823细胞数目均少于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度增加迁移细胞数目逐渐减少(P<0.05),呈浓度依赖关系。细胞粘附试验结果显示,AMF 100、200、400μmol/L浓度组的AMF作用于BGC-823细胞20、40、60、80 min后,各浓度组在各时间点粘附于纤维粘连蛋白(FN)胶上的细胞数均低于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度的增加,细胞粘附抑制率越大,随着作用时间的增加,细胞粘附抑制率亦越大,呈浓度、时间依赖关系(P<0.05)。Western bolt条带分析显示,与空白对照组比较,AMF 100、200、400μmol/L浓度组的RECK蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05),MMP-2及MMP-9蛋白表达量均低于空白对照组(P<0.05),且随着AMF浓度的增加RECK蛋白表达量明显增高,MMP-2及MMP-9蛋白表达量明显降低,呈浓度依赖关系(P<0.05);与空白对照组比较,AMF 100、200、400μmol/L浓度组的p-Akt及p-PI3K蛋白表达量均低于空白对照组(P<0.05),且随AMF浓度的增加表达量明显降低,呈浓度依赖关系(P<0.05)。结论AMF能抑制BGC-823人胃癌细胞株的增殖、侵袭、迁移、粘附能力,其机制可能与促进RECK蛋白表达,下调MMP-2及MMP-9蛋白表达,并抑制PI3K及Akt蛋白磷酸化从而抑制PI3K/Akt信号通路表达有关。

穗花杉双黄酮调节cGAS-STING信号通路对哮喘幼年大鼠气道炎症的影响

目的探讨穗花杉双黄酮(AF)对哮喘幼年大鼠气道炎症的影响并初步探讨其机制。方法采用腹腔注射联合雾化吸入卵白蛋白(OVA)法诱导幼年SD大鼠建立哮喘模型,将大鼠随机分为哮喘模型(M)组、地塞米松(DXMS)组、AF低(AF L)、中(AF M)、高(AF H)剂量组和正常对照(CT)组。给药结束后,无创肺功能仪检测气道反应性,通过吉姆萨(Giemsa)染色分析支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞类型并计数,使用苏木素-伊红(HE)染色评价肺组织和支气管组织病理特征,酶联免疫吸附剂实验(ELISA)检测血清炎症因子的含量,Western blot检测肺组织GMP-AMP合酶(cGAS)、干扰素基因刺激物(STING)、磷酸化-干扰素调节因子3(p-IRF3)和干扰素调节因子3(IRF3)蛋白表达。结果与CT组相比,M组幼年大鼠肺组织和支气管组织可见明显病理损伤,气道反应性、肺组织、支气管组织病理评分、BALF中炎性细胞总数及单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量显著增加、血清炎症因子以及肺组织c GAS、STING、p-IRF3/IRF3蛋白表达显著增加(P<0.05);与M组相比,DXMS和高剂量AF治疗哮喘大鼠后肺、支气管组织病理损伤缓解,气道反应性、肺组织、支气管组织病理评分、BALF中炎性细胞总数显著降低、血清炎症因子以及肺组织c GAS、STING、p-IRF3/IRF3蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论AF可缓解哮喘幼年大鼠的气道炎症,其可能是通过抑制cGAS-STING信号通路实现的。

穗花杉双黄酮通过NF-κB通路在放射性肠炎中的消炎、抗纤维化和抗菌作用

目的探讨穗花杉双黄酮(Amentoflavone,AF)在放射性肠炎中的消炎、抗纤维化和抗菌作用。方法选取雄性SD大鼠45只,随机分3组:空白组、辐射组(IR组)、辐射后AF干预组(IR+AF组)。采用高能X射线照射建立急性放射性肠炎大鼠模型,IR+AF组予60 mg·kg-1·d-1AF腹腔注射,空白组和IR组予生理盐水腹腔注射,分别于不同时段留取大鼠小肠组织、血清与粪便,观察肠黏膜组织病理学,采用ELISA法检测血清炎性因子TNF-α和IL-1β水平,qPCR检测组织NF-κB表达,应用16S rRNA测序方法对粪便样本进行测序及生物统计分析。另建立TNF-α诱导IEC6细胞损伤模型,采用qPCR法检测上皮细胞间质转化相关标志物:E-cadherin和Vimentin,采用划痕实验观察AF的修复作用。结果IR组大鼠肠上皮结构及黏膜屏障均被破坏,IR+AF组未见明显的肠道结构破坏,胶原纤维增生明显减少。与空白组、IR+AF组相比,IR组的菌群α-多样性更低,β-多样性更显著,而血清TNF-α和IL-1β的分泌增加(P<0.05)。AF干预后NF-κB表达下降,炎性因子明显减少(P<0.05),且大肠杆菌志贺菌、类杆菌的丰度下降,趋势一致,而普雷沃菌、乳酸杆菌属的丰度升高。TNF-α刺激后IEC6间质化,而AF可逆转这种变形,伴E-cadherin恢复、Vimentin表达下降。划痕实验提示AF促进上皮细胞修复。结论AF可抑制NF-κB信号通路,减少TNF-α等炎性因子刺激,抑制IEC6间质化,促进肠黏膜愈合,恢复肠道菌群多样性,起到消炎、抗纤维化和抗菌的多重作用。

穗花杉双黄酮对小鼠神经母细胞瘤细胞增殖及增殖相关蛋白表达的影响

目的 探究穗花杉双黄酮(AF)对小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a)及增殖相关蛋白表达的影响。方法 复苏、培养Neuro-2a细胞,取传代后的Neuro-2a细胞用于本研究,CCK-8实验分为5组:0、25、50、75、125μmol/L AF组,细胞处理24 h。细胞流式实验检测AF(75μmol/L AF)对Neuro-2a细胞周期中G1期和S期的百分比的影响,使用荧光定量PCR和Western blot法检测AF(75μmol/L AF)对Neuro-2a细胞增殖相关m RNA和蛋白表达的影响。结果 CCK-8检测结果显示,25、50μmol/L AF组对Neuro-2a细胞活性无显著影响(P>0.05),而75μmol/L AF组则显著降低Neuro-2a细胞活性,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,75μmol/L AF组Neuro-2a细胞G1期细胞百分比升高,差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,75μmol/L AF组Neuro-2a细胞S期细胞百分比降低,差异有统计学意义(P<0.05),但75μmol/L AF组对Neuro-2a细胞G2期细胞分布无明显作用。荧光定量PCR和Western blot结果显示,75μmol/L AF组可抑制Neuro-2a细胞β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E和Survivinm RNA和蛋白表达,促进p21和p16 m RNA和蛋白表达(P<0.05)。结论 75μmol/LAF通过抑制β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E和Survivin的表达,促进p21和p16等增殖相关蛋白的表达,进而抑制Neuro-2a细胞进一步增殖。

穗花杉双黄酮对急性心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

目的探讨穗花杉双黄酮对急性心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、穗花杉双黄酮低、高剂量组(50、100 mg/kg),每组15只;采用左前降支冠状动脉结扎法建立心肌梗死模型,待大鼠清醒后灌胃给药,连续28 d,模型组与假手术组给予同等剂量生理盐水。应用心脏超声仪进行心功能分析;利用苏木精-伊红(HE)和Masson染色观察心肌纤维化程度;利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNT)表达水平;利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测心肌纤维化相关生物标志物基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达水平;利用Western blotting检测MMP-2、TGF-β1蛋白水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠的左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)明显降低,左心室收缩末期内径(LVESD)、舒张末期内径(LVEDD)显著升高,心肌细胞少量残存、结构紊乱、纤维化程度高,血清中PⅠCP和PⅢNP表达升高,心肌组织中MMP-2、TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高;与模型组比较,穗花杉双黄酮低、高剂量组大鼠的LVEF和LVFS升高,LVESD和LVEDD降低,心肌细胞坏死数量减少,纤维化程度减轻,血清中PⅠCP和PⅢNP表达降低,心肌组织中MMP-2、TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低。结论穗花杉双黄酮能够改善急性心肌梗死大鼠心肌纤维化,进而改善心功能,其作用可能与抑制MMP-2和TGF-β1的表达有关。

穗花杉双黄酮通过影响caspase-3和β-catenin表达诱导结肠癌细胞SW480凋亡

目的观察穗花杉双黄酮对人结肠癌细胞SW480增殖及凋亡相关因子caspase-3、β-catenin的影响,初步探讨其诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法 MTT细胞增殖试验检测穗花杉双黄酮对SW480细胞活力的影响,流式细胞术检测其对SW480细胞凋亡的诱导作用,Western blot法检测穗花杉双黄酮作用细胞后caspase-3、β-catenin蛋白的表达。结果穗花杉双黄酮对SW480细胞生长有抑制作用,具有剂量依赖性。150μmol/L穗花杉双黄酮明显促进其凋亡,凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。Western bolt结果表明,穗花杉双黄酮干预可以使caspase-3表达明显增强,β-catenin表达明显减弱。结论穗花杉双黄酮可诱导人结肠癌细胞SW480凋亡,并影响凋亡相关因子caspase-3、β-catenin的表达,从而达到抗肿瘤作用。

穗花杉双黄酮在大鼠体内的药动学研究

目的建立测定大鼠血清中穗花杉双黄酮含有量的方法,并计算其药动学参数。方法血清样品甲醇液HPLC分析采用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相为乙腈-水（含0.1%三氟乙酸）,梯度洗脱;体积流量1.0m L/min;检测波长330 nm;柱温30℃;进样量20μL。大鼠灌胃给予穗花杉双黄酮（60 mg/kg）后,在不同时间点取血,测定血清中该成分的含有量,并计算其药动学参数。结果穗花杉双黄酮在0.010 04~0.803 2μg/m L范围内的线性关系良好（r^2=0.999 1）,血清中该成分在各质量浓度下的回收率均大于80%,Tmax为90 min,Cmax为（0.469±0.046）μg/m L,AUC0-t为（27.731±1.128）mg/（L·min）,AUC0-∞为（24.944±1.093）mg/（L·min）,t1/2为（57.008±2.765）min,V/F为（198.36±17.422）L/kg,CL/F为（2.408±0.103）L/（min·kg）。结论该方法准确、可靠,可用于大鼠血清中穗花杉双黄酮的测定及药动学研究。

HPLC法测定11种卷柏属药材中穗花杉双黄酮的含量

采用HPLC法测定11种卷柏属药材中穗花杉双黄酮的含量。色谱柱：Kromasil（250×4．6mm，5μm）；流动相：甲醇旬．05mol／L磷酸二氢钠溶液系统，梯度洗脱，0～28min，甲醇50％～58％，30～35min，甲醇58％～70％；柱温：400C；流速：1．0ml／min；检测波长：330nm。结果表明，穗花杉双黄酮在153～767ng范围内峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为97．03％，RSD为0．80％（n=5）。

穗花杉双黄酮抑制人脐静脉内皮细胞血管形成的实验研究

为探讨穗花杉双黄酮(Amentoflame,AF)对人脐静脉内皮细胞ECV304血管形成及机制的影响,从而为穗花杉双黄酮治疗肿瘤及其他血管增生性疾病提供理论基础,采用MTS检测AF对ECV304血管内皮细胞增殖的作用,细胞划痕实验观察AF对ECV304细胞迁移的影响,体外血管形成实验观察AF对ECV304血管形成的影响,Western blot检测AF对ECV304细胞血管形成相关信号通路及蛋白如磷酸化AKT(p-AKT)、金属基质蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、促血管生成素2(angiopoietin 2,Ang 2)表达影响。结果表明AF能够抑制ECV304细胞的增殖作用,并呈梯度依赖性;AF具有抑制ECV304细胞迁移的作用,并且能够抑制ECV304体外血管样结构的形成;Western blot结果显示100μmol/L的AF能够降低ECV304细胞p-AKT、MMP-9、Ang-2的蛋白表达。

微波辅助离子液体提取石上柏穗花杉双黄酮工艺的优化

目的优化微波辅助离子液体提取石上柏穗花杉双黄酮工艺。方法以微波功率、提取时间、提取温度为影响因素,穗花杉双黄酮提取率为评价指标,响应面法优化提取工艺。结果最佳条件为提取溶剂2.0 mmol/L[C6mim][PF6]溶液,料液比1∶15,微波功率500 W,提取时间39 min,提取温度46℃,穗花杉双黄酮提取率0.65%。结论该方法简便、准确、高效,可用于微波辅助离子液体提取石上柏穗花杉双黄酮。

2种卷柏药材中穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚含量测定研究

目的建立同时测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚含量的方法,并在此基础上比较这2种成分在翠云草和卷柏中的含量差异。方法采用岛津VP-ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%醋酸水溶液,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长为338 nm,柱温为30℃。结果在此条件下,穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚得到完全分离,均在0.600～12.00μg与峰面积线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率分别为99.8%和97.7%,RSD分别为0.85%和1.1%(n=6)。结论该含量分析方法操作简单、快速、准确、灵敏度高、重现性好,为卷柏类药材中双黄酮类化合物含量测定提供参考。

穗花杉双黄酮罗伯斯特双黄酮质谱裂解特征研究

采用负离子检测模式下的电喷雾多级串联质谱(ESI-MS)方法对穗花杉双黄酮和罗伯斯特双黄酮的质谱行为进行研究,讨论C3′—C8″与C3′—C6″连接的双黄酮类化合物结构特征与质谱裂解行为之间的异同。实验结果表明:2种C—C连接的双黄酮类化合物在相同的质谱条件下均可以在C环发生0,4键断裂,生成质荷比m/z=375的碎片离子。此离子峰为C—C连接的双黄酮类化合物共有的特征离子峰;但是由于C—C连接位置的不同,这一对同分异构体的裂解途径也存在着明显差异。C3′—C6″连接的罗伯斯特双黄酮,由于空间构型的影响,在质谱条件下,C4′位的羟基更易于与C5″或者C7″位上的羟基发生分子内脱水,生成丰度响应值较高的碎片离子m/z为519和309。这2个碎片离子是罗伯斯特双黄酮的特征碎片离子,可用于区分穗花杉双黄酮和罗伯斯特双黄酮。

HPLC法测定卷柏及其炮制品中穗花杉双黄酮的含量

采用HPLC方法测定卷柏及炮制品中穗花杉双黄酮的含量。方法:Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸水(65∶35);流速:0.8 mL/min;检测波长:337 nm;柱温:25℃。实验结果表明,卷柏生品中穗花杉双黄酮的含量为0.84%,焦卷柏为1.07%,卷柏炭为0.53%。不同的炮制方法对穗花杉双黄酮的含量产生不同的影响。

卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱及穗花杉双黄酮的含量测定研究

目的建立卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱分析方法并进行穗花杉双黄酮的含量测定。方法采用HPLC方法测定24批不同产地的卷柏及垫状卷柏药材,分析两者的指纹图谱特征及穗花杉双黄酮的含量。结果以穗花杉双黄酮为主的不同的7个特征峰分别共同构成卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱概貌,卷柏及垫状卷柏中穗花杉双黄酮的含量分别为1.77～3.82%和0.45～0.85%。结论卷柏及垫状卷柏的HPLC指纹图谱相似,主要成分穗花杉双黄酮的含量相差较大。

深绿卷柏中的穗花杉双黄酮和橡胶树双黄酮的反相高效液相色谱法同时测定

目的测定深绿卷柏中穗花杉双黄酮和橡胶树双黄酮的含量。方法采用梯度洗脱的反相高效液相色谱法,选用Agilent ZORBAX-SB C18(5μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,以乙腈-0.1%冰醋酸为流动相,在25℃柱温,检测波长为254nm时检测,建立了深绿卷柏药材的质量评价标准。结果穗花杉双黄酮、橡胶树双黄酮分别在0.33～3.3μg/ml和0.27～2.7μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,相关系数分别为r=0.993和r=0.990;回收率分别为:95.36%(n=6,CV=1.79%)和95.49%(n=6,CV=2.61%)。结论 RP-HPLC法同时测定深绿卷柏中穗花杉双黄酮和橡胶树双黄酮的含量,方法灵敏、简便、准确;可用于评价深绿卷柏药材的品质。

RP-HPLC法测定垫状卷柏 中穗花杉双黄酮的含量

本文用反相高效液相色谱法测定垫状卷柏药材中的穗花杉双黄酮。选用Purospher star RP-C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm），以甲醇-0．1％磷酸水溶液（65：35）为流动相，流速为O．8mL／min，检测波长337nm，柱温25℃进行检测。结果显示，穗花杉双黄酮的含量在0．038—0．342μg范围内时进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，r=0．9999，平均回收率为101．2％，RSD为2．3％（n=6）。该方法测定垫状卷柏药材中的穗花杉双黄酮含量灵敏、准确、重现性好。

穗花杉双黄酮大鼠在体肠吸收动力学的研究

采用大鼠在体单向肠灌流实验模型,用HPLC-UV法测定灌流液中药物浓度,研究穗花杉双黄酮肠吸收动力学。结果表明穗花杉双黄酮在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收速率常数(Ka)、药物表观渗透系数(Papp)差异无统计学意义(P>0.05),提高药物浓度的吸收速率常数基本保持不变。在大鼠各肠段均有吸收,无特定吸收部位,吸收机制为被动扩散。

基于反溶剂冻干技术穗花杉双黄酮的制备和分析表征

目的采用反溶剂冻干法制备穗花杉双黄酮微粉,以解决该药水溶性差的问题,提高药物口服生物利用度。方法通过考察反溶剂冻干法反应溶剂与水的比例、药物溶液浓度、反应温度、搅拌速度和搅拌时间对颗粒粒径的影响,得到适宜的微粉化条件。在此基础上分别利用激光粒度分析、扫描电镜、傅立叶转换红外光谱、粉末X线衍射和体外溶出实验对原料药和微粉进行分析表征。结果最佳处方制备的微粉颗粒粒径在0.08μm左右,冻干后样品为无定形。结论本方法制备的穗花杉双黄酮微粉溶解度和溶出速率显著提高,为改善药物的口服生物利用度提供了基础。

HPLC法测定江南卷柏片中穗花杉双黄酮的含量

目的：建立高效液相色谱法测定江南卷柏片中穗花杉双黄酮的含量。方法：C18柱（250mm×4．6mm，51μm）；流动相：乙腈（A）-0.5％冰醋酸溶液（B），梯度洗脱；检测波长：338nm；流速：1ml/min。结果：穗花杉双黄酮在5.25～262．5μ/ml间，峰面积与其质量呈良好的线性关系，回归方程为A=62621C＋39、79，r^2=1；平均回收率为97．1％，RSD为1．9％。结论：该方法可以用来控制江南卷柏片的质量，方法简便、准确。

不同产地、不同采收期新疆圆柏叶中穗花杉双黄酮的含量测定

目的测定不同产地、不同采收期新疆圆柏叶中穗花杉双黄酮的含量。方法采用高效液相色谱法,以穗花杉双黄酮为指标,色谱条件为Phenomenex ODS-A C_(18)柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸,梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0mL/min,检测波长337nm。结果在0.4~40μg/mL范围内穗花杉双黄酮峰面积与进样浓度呈良好的线性关系,回归方程:Y=43 837 X+6 797.6(r=0.999 9);平均回收率为100.83%,RSD为1.37%;不同产地新疆圆柏叶中穗花杉双黄酮平均含量为1.44mg/g,不同采集时间新疆圆柏叶中穗花杉双黄酮平均含量为1.42mg/g。结论该方法灵敏准确,重现性好,可用于新疆圆柏叶中穗花杉双黄酮的含量测定,为新疆圆柏叶药材的开发利用提供理论依据。