一种新型的定量测定特异性体液免疫功能的溶血空斑试验

根据补体经典途径激活时，可通过“旁立损伤”机制使邻近正常细胞溶解破坏的原理，该种溶血空斑试验不仅可以用来定量检测分泌ＩｇＭ的抗体形成细胞，也可直接用来定量检测分泌ＩｇＧ的抗体形成细胞。与传统溶血空斑试验相比，其最大的优点是可用来检测机体对任何一种可溶性抗原的特异性体液免疫应答能力，从而扩展了应用范围。

SARS-CoV细胞空斑试验

目的建立适用于生物安全三级实验室操作的SARS-CoV空斑试验方法。方法SARS-CoV10倍系列稀释接种Vero-E6细胞,用0.6%琼脂糖覆盖中性红着色(琼脂糖-中性红法)或覆盖1%甲基纤维素,4%甲醛固定,结晶紫染色(甲基纤维素-结晶紫法),空斑计数。结果琼脂糖-中性红法病毒滴度为6.14 Lg pfu/mL,甲基纤维素-结晶紫法病毒滴度为6.57 Lg pfu/mL。结论二种空斑试验方法相比,病毒滴度无明显差异。甲基纤维素-结晶紫空斑试验法形成的空斑比琼脂糖-中性红法清晰、操作简单安全、结果可长期保存。

登革病毒速成甲基纤维素半微量空斑试验的建立

目的：建立一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术。方法：以登革Ⅱ型病毒为代表，对速成法和常规法的实验条件、可靠性、敏感性、重复性等作系统研究。用方差分析和ｔ检验对实验结果进行统计学处理。结果：速成法重复性好，简单快速，敏感稳定，速成法空斑平均水平高于常规法（α１＞α２）。结论：速成甲基纤维素半微量空斑技术是一种可靠易行的病毒空斑新技术，可用于鉴定和滴定病毒，具有较大的实用和推广价值。

基于琼脂糖-中性红法的简易空斑试验应用研究

目的 建立一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)滴度的简易空斑试验方法。方法 应用琼脂糖覆盖细胞单层、中性甲醛固定及中性红染色的试验流程检测病毒滴度,并比较试验组和空白对照组的检测效果。结果 试验组形成典型合胞病变,即感染细胞发生融合后形成多核巨细胞,直径为1.5~2.5mm,合胞形态不规则,细胞界限不清。空白对照组未见典型细胞病变。试验组有绿色荧光表达,且可见细胞核聚集现象。空白对照组未检测到非特异性的荧光标记。中性红染色后,正常Hep-2细胞呈红色,而RSV感染的Hep-2细胞不能染色,形成空斑。镜下空斑形态与RSV形成的合胞病变一致。空斑肉眼清晰可见,为类圆形或圆形,大小1.5~2.5mm,边缘不规则。随着病毒稀释度的增高,空斑数目逐渐较少。通过简易空斑试验可计算出病毒滴度为7.5×10^(8) PFU/mL。结论 基于琼脂糖-中性红法的简易空斑试验可直接观察空斑计算病毒滴度,不需要进行免疫荧光染色和显微镜检查,且检测结果可无限期保存,具有方法简单、经济等优点。

一种改良的溶血空斑试验

一种改良的溶血空斑试验首都医学院微生物学教研室李郁英，李玉兰，安云庆溶血空斑试验（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｐｌａｑｕｅｔｅｓｔ）是由Ｊｅｒｎｅ和Ｎｏｒｄｉｎ创立的一种体外检测抗体形成细胞（浆细胞）的方法［１］，又称空斑形成细胞测定法（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉ...

空斑试验在微生物实验教学中的改进及应用

目的通过更换侵染病毒来改进制作“空斑试验”示教板,以得到更鲜明的“空斑试验”结果,使其更好地服务本科实验教学。方法用不同滴度的寨卡病毒和登革病毒感染培养于12孔细胞培养板的Vero细胞,置37℃吸附2 h。吸附后,用1%甲基纤维素Eagle氏覆盖液进行覆盖步骤,置细胞于37℃培养6~7 d将细胞固定和染色后,用自来水冲洗,待干。结果感染寨卡病毒的未死亡脱落的Vero细胞被结晶紫染色,紫色背景明显。肉眼可看到寨卡病毒感染细胞产生的无色空斑,空斑呈圆形,清晰完整,边缘整齐。空斑数量随着病毒浓度的升高而增加,复孔产生空斑数量趋势一致。感染登革病毒的未脱落Vero细胞被染成紫色,形成较鲜明的紫色背景,登革病毒感染细胞产生了无色空斑,但是空斑的形成数量较少,且不是所有复孔都产生了空斑。随着病毒稀释倍数增加,产生的空斑数量无明显减少趋势。结论用寨卡病毒感染Vero细胞能得到更典型的空斑试验结果,该方法更适用于本科教学制作示教结果用。

新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化

目的:建立新分离呼肠病毒(reovirus)的空斑技术,进行病毒纯化,为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础.方法: 4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代,当产生细胞病变后进行空斑试验,加营养琼脂培养6 d后加中性红,24 h内挑取空斑,扩增一次后做PCR鉴定.取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化.结果:4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代,均能观察到明显的细胞病变.用10-3和10-4接种L929单层细胞,第6～7天均能产生空斑,空斑呈圆形,直径为0.2～1.0 mm,并分别测定其空斑滴度(PFU/ml).两次纯化后进行PCR检测,呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性.结论:4株呼肠病毒的空斑出斑规律,通过两次克隆,获得纯化的病毒.

5种虫媒病毒的细胞培养及空斑试验

目的 :选择一株对 5种虫媒病毒 :马雅罗病毒 (MAY)、西门利克病毒 (SFV)、墨累谷脑炎病毒 (MVE)、伊利乌斯病毒 (ILH)和布尼安姆韦拉病毒 (BUN)敏感的细胞用于这 5种病毒生物学性状的研究。方法 :将不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液接种到BHK2 1 ,LLC_MK2 ,A549和C6 36传代细胞上 ,进行这 5种病毒的敏感性试验 ,选出一株对 5种病毒较敏感的细胞株 ;对敏感细胞株进行三因素三水平正交试验 ,探索细胞的最佳培养条件 ;进行 5种病毒的空斑试验。结果 :BHK2 1 细胞对 5种病毒细胞病变特征明显 ,出现时间较早 ,滴度较高 ,适用于 5种病毒的培养。在合适条件下 ,BHK2 1 细胞单层可以维持 7d以上 ,5种虫媒病毒在BHK2 1 细胞上出现了大小、形态都不相同的空斑。结论 :BHK2 1 细胞在 6 0 %DMEM培养液、30 %的 0 .5 %水解乳蛋白、10 %小牛血清、常量青、链霉素和 5 0 μg ml卡那霉素 ,保持pH 7.2条件下生长最好 ,能够满足 5种虫媒病毒生物学性状研究的需要。

应用型特异性血清对肾综合征出血热毒株进行空斑减少中和试验分型

本文应用特异性出血热抗血清对国内外１４株出血热病毒进行空斑减少中和试验分型，结果不同毒株对两型持异性血清的中和效价大多相差８－１６倍，可以明显确定为出血热血清Ⅰ型或Ⅱ型。该方法用以出血热新分离株的分型不必制备分离株免疫血清，使鉴定更简便，并缩短时间。

基孔肯雅病毒空斑中和试验的研究

基孔肯雅(Chikungunya 简称 CHIK)热是一种由蚊媒传播的病毒性传染病。在非洲及东南亚地区常有流行。临床症状与登革热相似,以发热和关节疼痛为主,有时伴有出血现象。

空斑试验在鼻病毒定量中的应用

目的 探讨空斑试验在鼻病毒定量过程中的应用.方法 Hela细胞单层在24孔板中融合达90％以上时,接种RV-1B,用琼脂作为半固体培养基孵育3-5 d后,甲醛固定、结晶紫染色,计算空斑.结果 利用Hela细胞进行空斑试验可以对RV-1B进行准确定量.结论 空斑试验为RV-1B定量提供一种相对有效方法,其中温度、PH、Mg2＋等可能影响实验结果的因素不可忽视.

应用空斑减少中和试验法对我国流行性出血热病毒进行血清学分型

应用空斑减少中和试验对分离自不同动物宿主和病人血液的流行性出血热病毒进行病毒抗原性分型,以不同株的家兔免疫血清对国际上血清1型和2型参考毒株进行试验。结果表明,3株来自黑线姬鼠的毒株,其免疫血清对血清1型(76-118株)的效价较血清 2型(UR株)高≥16倍,而6株来自家鼠和大白鼠的毒株中,有5株对2型的血清效价高于1型2～16倍。提示来自黑线姬鼠的毒株符合国际上的血清1型,来自褐家鼠的毒株基本与国际上的血清2型一致,但个别毒株例外。以上结果表明,空斑减少中和试验特异性高,可用于流行性出血热病毒的准确血清学分型。 本文还发现,J10株(分离自锦州市褐家鼠)和HB55诛(分离自河南出血热病人)的血清型与过去文献报道的不符。经反复用不同免疫血清和型特异性单克隆抗体做空斑减少中和试验,均表明这两株病毒的分型与血清1型相同。以上结果为我国首次应用空斑减少试验对我国出血热不同毒株进行准确分型的报道。

西尼罗病毒空斑形成试验方法的建立与应用

目的建立西尼罗病毒的空斑形成试验方法,应用于病毒滴度测定和实验感染蚊虫及来亨鸡血液样本中病毒的定量检测。方法将稀释的样本接种常规制备的Vero细胞单层,用琼脂糖凝胶覆盖,孵育一定时间后,加中性红染色,计数空斑数,计算空斑形成单位。结果在琼脂糖凝胶中西尼罗病毒可形成直径大约1～3mm的圆形或类圆形空斑。20%病毒鼠脑悬液的病毒滴度为107空斑形成单位。感染蚊虫样本和来亨鸡血液样本也出现典型的空斑。结论建立了西尼罗病毒的空斑形成试验方法,该方法可应用于病毒滴度测定和实验感染蚊虫及来亨鸡血液样本中病毒的定量检测。

空斑减少中和试验测定血清抗乙脑病毒抗体

目的 对比空斑减少中和试验与反向被动血凝抑制试验在评价人血清抗乙脑病毒抗体时测定结果的异同。方法 对 4 5 0名 6～ 10岁儿童接种灭活乙脑疫苗前后的血清样本用两种方法进行了测定。结果 两种方法在测定免前人血清抗乙脑病毒抗体时存在显著性差异 ,在测定免后人血清抗乙脑病毒抗体时两者没有差异。结论 空斑减少中和试验比反向被动血凝抑制试验在测定人血清抗乙脑病毒抗体时灵敏。

SARS冠状病毒空斑技术的建立和应用

目的 建立SARS病毒空斑形成试验 ,用于病毒滴定和中和抗体检测。方法 用Vero E6细胞接种6孔塑料细胞培养板 ,加两层含琼脂糖培养基 ,以中性红为染色剂建立空斑试验 ,以能减少 5 0 %的空斑为标准 ,测定抗SARS中和抗体。结果 应用空斑试验能稳定清晰地形成SARS病毒特异性空斑 ,可用于病毒滴定、抗SARS病毒抗体的测定和疫苗效力的检定。结论 为正确滴定病毒、检测中和抗体。

MTT分析法、空斑减数法及CPE观察法评估药物体外抗病毒效果的比较与分析

目的:比较MTT分析法、空斑减数试验及细胞病变效应(CPE)观察3种方法在评估药物体外抗病毒效果分析中的优劣,为选择适宜的药物体外抗病毒效果的检测方法提供实验依据。方法:分别采用 CPE法、MTT分析法和空斑减数试验法评价大黄素于体外抗疱疹病毒 1 型、疱疹病毒 2 型和柯萨奇病毒增殖的效果,比较 3 种检测方法的结果,并分析该方法的实用性与利弊。结果:在抗疱疹病毒增殖的检测中,MTT法与空斑减数法所测结果具有显著性差异,空斑减数法比MTT法更准确,但对抗柯萨奇病毒增殖的检测,MTT法与空斑减数法无明显差异。结论:MTT法与 CPE法结合,可广泛用于对抗病毒药物的筛选,但对于疱疹病毒类非杀细胞病毒,使用空斑减数法较好。

应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性

目的:建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成方法,并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性.方法:将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五种细胞,分别覆盖三种不同的培养物,孵育一定时间后固定染色,比较出斑效果;以新建空斑形成法测定五种细胞感染EV7124-96h后培养液滴度,计算空班形成单位(pfu).结果:在五种细胞中,BGM和VeroE6覆盖琼脂糖凝胶的EV71可形成针尖样空班;覆盖1%甲基纤维素的EV71可形成直径大约1mm圆形或类圆形空班,形成空斑单位最多,病毒滴度分别达2.87×109pfu/L和1.65×109pfu/L;覆盖1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直径大约0.5mm类圆形空斑,在VeroE6细胞中形成针尖样空斑;其他细胞均形成针尖样空斑.结论:空斑形成方法可对肠道病毒进行定量检测,BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞.

有机锗恢复带瘤小鼠溶血空斑的观察

本实验观察了有机锗对带瘤小鼠(ICR/JCL)溶血空斑(PFC)的影响。结果显示,适量的有机锗(10mg/日/鼠)能明显提高带瘤鼠的PFC数(P【0.05),但不能提高正常小鼠的PFC数。说明有机锗对于因肿瘤所致的免疫反应低下具有一定程度的恢复作用。

呼肠孤病毒空斑检测方法建立

目的建立呼肠孤病毒空斑检测方法,为进一步研究该病毒奠定基础。方法通过Western Blot、免疫荧光检测纳尔逊海湾正呼肠孤病毒Miyazaki病毒株感染L929细胞和BSR细胞情况,病毒RNA水平凝胶电泳验证Miyazaki病毒株核酸成分。建立呼肠孤病毒空斑检测方法,计算病毒滴度。结果Miyazaki病毒株能成功感染L929细胞和BSR细胞,水平凝胶电泳验证病毒株核酸成分正确,病毒株感染的L929细胞出现空斑,计算得出病毒滴度结果为2.2×108 PFU/mL。结论呼肠孤病毒空斑检测方法成功建立,该方法可以形成清晰可见的空斑,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究呼肠孤病毒提供帮助。

一种新的病毒空斑技术

本文报道了一种不同于 Dulbecco 细胞单层法和 Cooper 琼脂细胞悬浮法的病毒空斑技术—速成单层法病毒空斑试验。用24孔细胞培养板,不经预先制备细胞单层,将 Vero 细胞和水泡性口炎病毒 Indiana 株同时加入培养孔内。