HPLC双波长法测定四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量

建立HPLC双波长法同时测定四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。采用XBridge C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以甲醇-水(52∶48)为流动相,流速1.0 mL·min^(-1);柱温25℃;进样量10μL,检测波长分别为225 nm(穿心莲内酯)和254 nm(脱水穿心莲内酯)。穿心莲内酯浓度在12.7375μg·mL^(-1)~509.5μg·mL^(-1)范围内,线性良好(r^(2)=0.9996);脱水穿心莲内酯浓度在3.4μg·mL^(-1)~136μg·mL^(-1)范围内,线性关系良好(r^(2)=0.9997)。穿心莲内酯加样回收率平均为98.8%,RSD为1.0%;脱水穿心莲内酯回收率平均为99.9%,RSD为08%。该方法快捷、灵敏、准确、可靠,可用于四味穿心莲散中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯2个有效成分的同步测定,为四味穿心莲散的质量控制和评价提供科学依据。

穿心莲内酯调节Nrg-1/ErbB4信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡的影响

目的探讨穿心莲内酯(Andro)调节神经调节蛋白1(Nrg-1)/表皮生长因子受体4(ErbB4)信号通路对缺血性脑卒中(IS)大鼠神经元凋亡的影响。方法采用线栓法建立IS大鼠模型。将60只造模成功的大鼠随机分为模型组(Model组,生理盐水)、Andro低剂量组(Andro-L组,50 mg/kg)、Andro高剂量组(Andro-H组,100 mg/kg)和Andro-H+Dacomitinib组(100 mg/kg Andro+7.5 mg/kg Nrg-1/ErbB4信号通路抑制剂Dacomitinib),每组15只;另取15只大鼠为Sham组(生理盐水)。灌胃给药/生理盐水,每天1次,连续7 d。给药结束后,评估大鼠神经功能;检测大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-10、神经生长因子(NGF)水平;测定大鼠脑梗死面积;观察大鼠海马组织病理变化;检测大鼠海马神经元凋亡率和海马组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平及基质金属蛋白酶9(MMP-9)、剪切型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、Nrg-1蛋白表达水平和磷酸化ErbB4(p-ErbB4)/ErbB4比值。结果与Model组比较,Andro-L组、Andro-H组大鼠Zea-Longa评分,逃避潜伏期,血清中LDH、TNF-α、IL-1β水平,脑梗死面积百分比,海马神经元凋亡率,海马组织中MDA水平和MMP-9、cleaved-caspase-3蛋白表达水平均显著降低/缩短(P<0.05);滞留时间、穿越平台次数,血清中IL-10、NGF水平,海马组织中CAT、SOD水平和Nrg-1蛋白表达水平、p-ErbB4/ErbB4比值均显著延长/增加/升高(P<0.05);海马神经组织结构损伤程度明显降低。Dacomitinib可减弱高剂量Andro对IS大鼠神经元损伤的改善作用(P<0.05)。结论Andro可减轻IS大鼠炎症反应、氧化应激和海马组织损伤,改善神经功能;其作用机制可能与激活Nrg-1/ErbB4信号通路有关。

穿心莲内酯对胰岛素抵抗大鼠的影响及可能作用机制分析

目的 探讨穿心莲内酯对胰岛素抵抗大鼠的影响及可能作用机制。方法 获得SPF级健康成年Wistar大鼠48只,随机选择36只大鼠经高脂高糖饲料喂养建立实验性Wistar大鼠IR模型,按照随机数字分配法分为空白对照模型组(HFD组)、穿心莲内酯高剂量组(High组)和穿心莲内酯低剂量组(Low组),选择12只大鼠接受普通饲料喂养作为正常对照组(NC组),High组大鼠予以经腹腔注射穿心莲内酯200 mg/(kg·d),Low组大鼠予以穿心莲内酯腹腔注射100 mg/(kg·d),HFD组以及NC组仅予以等量生理盐水腹腔注射,连续14 d。应用葡萄糖氧化酶法对空腹血糖值(FBG)水平进行监测,应用ELISA法检测空腹胰岛素(Fasting insulin, FINS),计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance, HOMA-IR);油红O染色制片检测肝脏的病理变化;应用联苯三酚自氧化法对超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力,应用硫代巴比妥酸法对丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平进行监测;免疫组化法检测大鼠肝脏组织内核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 kinase, S6K1)及p-胰岛素受体底物-1(p-insulin receptor substrate-1,p-IRS-1)(Tyr632)蛋白表达水平,Westernblotting法检测肝脏组织内S6K1及p-IRS-1(Tyr632)表达水平。应用SPSS 23.0软件包进行分析。结果 相比NC组比较,HFD组、High组、Low组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR水平明显升高(P<0.05);与HFD组相比,其余3组FBG、FINS、HOMA-IR水平较低(P<0.05);与穿心莲内酯Low组相比,High组FBG、FINS、HOMA-IR水平较低(P<0.05)。相比NC组,HFD组光密度平均值增加(P<0.05);相比HFD组,穿心莲内酯High组与Low组脂滴面积/肌纤维总面积、光密度平均值均下降(P<0.05);与穿心莲内酯Low组相比,High组脂滴面积/肌纤维总面积、光密度平均值较低(P<0.05)。与NC组相比,HFD组SOD活性与MDA含量增加(P<0.05);相比HFD组,穿心莲内酯High组与Low组SOD活性与MDA含量均下降(P<0.05);与穿心莲内酯Low组相比,High组SOD活性与MDA含量较低(P<0.05)。与NC组相比,HFD组FAT/CD36蛋白相对表达量增加,CPT-1蛋白相对表达量下降(P<0.05);相比HFD组,穿心莲内酯High组与Low组FAT/CD36蛋白相对表达量下降,CPT-1蛋白相对表达量增加(P<0.05);与穿心莲内酯Low组相比,High组FAT/CD36蛋白相对表达量较低,CPT-1蛋白相对表达量较高(P<0.05)。与NC组相比,HFD组FAT/CD36mRNA相对表达量增加,CPT-1mRNA相对表达量降低(P<0.05);相比HFD组,穿心莲内酯High组与Low组FAT/CD36mRNA相对表达量下降,CPT-1mRNA相对表达量增加(P<0.05);与穿心莲内酯Low组相比,High组FAT/CD36mRNA相对表达量较低,CPT-1mRNA相对表达量较高(P<0.05)。结论 穿心莲内酯能够改善胰岛素抵抗大鼠胰岛素抵抗状态,显著改善IR大鼠的IR状态,其治疗机制与改善氧化应激状态,与下调S6K1的表达及提升IRS-1酪氨酸磷酸化水平具有密切相关性。

金属有机框架MIL-101吸附穿心莲内酯研究

用水热法合成MIL-101(Cr),通过PXRD、SEM表征其物相结构及微观形貌,制备出BET达2800 m^(2)/g的MIL-101吸附剂。静态吸附实验表明,MIL-101在60%甲醇水溶液中,对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的饱和质量吸附率分别达到8.36%,7.05%;将MIL-101负载于层析硅胶,制成制备色谱柱(4.6 mm×250 mm),分别测定其对两种内酯的穿透曲线及对内酯混合物的在线分离性能,结果表明,实验制备色谱柱对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯分离度达1.9,分离效率>99%,可实现在线高效分离。

基于转录组学探讨穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的抗菌增效机制

目的:基于前期研究结果,探索穿心莲内酯(Andrographolide,Andr)对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的抗菌增效作用机制。方法:利用illunima二代测序平台,比较PA标准菌株ATCC27853在有无Andr干预下的细菌转录组改变,采用基因组比对、差异鉴定、通路和表型分析确定核心靶标;考察在不同浓度穿心莲内酯(100、50、25μg·mL^(-1))干预下ATCC27853绿脓毒素(Pyocyanin,PYO)的分泌量;结合Andr可能的作用机制,RT-q PCR检测其对PA代谢过程中关键基因phz M、phz H、phz S和pvd I表达的影响;尾静脉注射临床分离耐药PA(PA2019-32)构建小鼠急性细菌感染模型,分别给予左氧氟沙星(阳性对照组)、左氧氟沙星联合Andr(联合用药组),观察记录各组小鼠的存活情况,连续观察5 d,绘制生存曲线,测评Andr联合抗菌药物的体内抗感染保护作用。结果:转录组学共组装对比出289个显著差异基因,其中145个基因显著上调,144个基因显著下调。差异基因的GO富集分析显示,差异基因主要涉及细胞代谢过程、细胞组成及“铁离子结合”;KEGG分析差异基因在42条通路中高度富集,主要涉及各类抗菌药物抗性通路,能量代谢相关通路以及毒力因子相关通路,其中色氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、泛醌和其他萜类-泛醌、辅助因子的生物合成、β-内酰胺抗药性、离子抗菌肽(CAMP)抗药性显著下调(pvalue<0.01~0.05)。RT-q PCR检测结果显示,Andr对pvd I无影响,但显著降低phz H和phz S的表达,同时phz M的表达升高,影响铜绿假单胞菌PYO的生物合成过程。验证实验证实Andr降低了PYO的生成,并且体内感染模型实验表明Andr与左氧氟沙星联合使用可显著提高感染小鼠的存活率。结论:通过干扰PYO的合成,调控Fe转运,增强CAMPs活性,可能是Andr最终实现“减毒”和“增效”的重要原因。

穿心莲内酯靶向Akt信号干预HIV感染T细胞的效率研究

目的探讨穿心莲内酯靶向Akt信号干预人类免疫缺陷病毒(HIV)感染T细胞的效率。方法培养Jurkat T细胞,用WST-1试剂检测穿心莲内酯干预对Jurkat T细胞活性的影响。将Jurkat T细胞分为空白对照组、穿心莲内酯组、LY294002组(PI3K抑制剂)及穿心莲内酯联合LY294002组。各组药物分别干预24 h后,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞PI3K、Akt mRNA相对表达量,采用Western blotting检测各组细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量。制备HIV假病毒,用假病毒感染各组细胞,萤光素酶系统检测假病毒感染Jurkat T细胞的效率。结果WST-1试剂检测结果显示,随着穿心莲内酯浓度增加,Jurkat T细胞活力降低(P<0.05)。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,穿心莲内酯降低Jurkat T细胞PI3K及其下游Akt mRNA相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白相对表达量(P<0.05)。HIV假病毒感染实验结果显示,穿心莲内酯降低HIV假病毒感染Jurkat T细胞的效率,联合组比单独组的抑制效果更好(P<0.05)。结论穿心莲内酯可能通过PI3K降低其下游Akt的活化,从而减少HIV假病毒在Jurkat T细胞间的传播及进入细胞的机会,降低其感染Jurkat T细胞的概率。

穿心莲内酯调节HMGB1/RAGE信号通路对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能损伤的影响

目的探讨穿心莲内酯调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)信号通路对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠坐骨神经功能损伤的影响。方法将84只大鼠随机分为对照组(生理盐水)、DPN组(生理盐水)、穿心莲内酯低剂量组(0.833 mg/kg)、穿心莲内酯高剂量组(3.332 mg/kg)、硫辛酸组(阳性对照,0.1 g/kg)、重组大鼠HMGB1蛋白(rHMGB1,8μg/kg)组、穿心莲内酯高剂量+rHMGB1组,每组12只。除对照组外,其余各组大鼠均采用高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素的方式构建DPN模型。造模成功24 h后,进行给药处理,每天1次,持续8周。给药结束后,检测大鼠空腹血糖、机械痛阈值、热痛阈值、坐骨神经传导速度的变化;观察大鼠坐骨神经病理变化;检测大鼠坐骨神经中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;检测大鼠坐骨神经中HMGB1、RAGE蛋白表达水平和核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白磷酸化水平。结果与对照组比较,DPN组大鼠坐骨神经病理损伤严重,空腹血糖、热痛阈值、MDA含量及HMGB1、RAGE蛋白表达水平和NF-κB p65蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05),机械痛阈值、感觉神经传导速度、运动神经传导速度、SOD活性显著降低/减慢(P<0.05);与DPN组比较,穿心莲内酯低、高剂量组和硫辛酸组大鼠上述指标均显著改善(P<0.05),rHMGB1组对应指标变化趋势与上述3个给药组相反(P<0.05);并且,rHMGB1可减弱高剂量穿心莲内酯对DPN大鼠血糖的降低作用及坐骨神经氧化应激损伤的改善作用(P<0.05)。结论穿心莲内酯可能通过抑制HMGB1/RAGE信号通路来降低血糖、抑制氧化应激,进而改善DPN大鼠坐骨神经损伤。

穿心莲内酯调节cGAS-STING信号通路对银屑病小鼠的治疗作用

目的 探究穿心莲内酯(Andro)调节GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激物(cGAS-STING)信号通路对银屑病小鼠的治疗作用及机制。方法 90只BALB/c小鼠分为对照组(Control组),模型组(Model组),穿心莲内酯低、中、高剂量组(Andro-L、M、H组,10、30、50 mg·kg^(-1)·d^(-1) Andro)和穿心莲内酯高剂量+STING激活剂DMXAA组(Andro-H+DMXAA组,50 mg·kg^(-1)·d^(-1) Andro+5 mg·kg^(-1)·d^(-1) DMXAA)。除Control组外,其余组小鼠背部施用咪喹莫特(IMQ)建立银屑病小鼠模型。观察小鼠银屑病面积并进行严重程度指数(PASI)评分,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-23、IL-17A、干扰素(IFN)-γ和IFN-β水平,苏木素-伊红(HE)染色和甲苯胺蓝染色测定表皮厚度和肥大细胞数,免疫荧光染色检测Ki-67、CD4阳性细胞表达率,RT-q PCR检测c GAS和STING m RNA表达水平,免疫印迹实验检测c GAS、STING、干扰素调节因子3(IRF3)、p-IRF3蛋白水平。结果 与Control组相比,Model组小鼠背部皮肤出现严重的红斑、鳞屑,有大量的炎性细胞浸润;抓挠次数、PASI评分、表皮厚度、肥大细胞数量、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17A、IFN-γ和IFN-β水平、Ki-67和CD4阳性表达率、c GAS和STING m RNA和蛋白表达水平及IRF3磷酸化水平升高(P<0.05)。与Model组相比,Andro-L组、Andro-M组和Andro-H组小鼠皮肤红斑、鳞屑、炎性细胞浸润现象减轻;抓挠次数、PASI评分、表皮厚度、肥大细胞数量、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17A、IFN-γ和IFN-β水平、Ki-67和CD4阳性表达率、cGAS和STING mRNA和蛋白表达水平及IRF3磷酸化水平呈剂量依赖性降低(P<0.05);STING激活剂DMXAA逆转了穿心莲内酯对银屑病小鼠的保护作用(P<0.05)。结论 穿心莲内酯可通过抑制cGAS-STING信号通路减轻炎症反应,改善小鼠银屑病症状。

穿心莲内酯对角膜镰刀菌生物膜形成及黏附能力的影响

目的探讨中药有效成分穿心莲内酯对角膜镰刀菌生物膜形成及其黏附能力的影响。方法采用结晶紫染色法评估不同浓度穿心莲内酯作用下临床多重耐药角膜镰刀菌株的初始黏附及生物膜形成能力。结果与未加药对照组相比,培养2 h、4 h,抑制50%的镰刀菌孢子黏附的穿心莲内酯浓度分别为64、512μg/mL;培养24 h,角膜镰刀菌表现出强生物膜形成能力,穿心莲内酯在2048μg/mL下可抑制其50%的生物膜形成。结论穿心莲内酯可显著抑制角膜镰刀菌的初始黏附,并对其生物膜形成有一定的抑制作用。

穿心莲内酯磺化物抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其生物膜的药效及机制

目的探讨穿心莲内酯磺化物(andrographolide sulfonate,AS)抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)及其生物膜(biofilm,BF)的药效及机制。方法采用微量肉汤倍比稀释法测定AS对MRSA的最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration,MIC);生长曲线法测定不同浓度AS作用MRSA 24小时内的细菌时间—生长曲线;微孔板法测定不同剂量AS给药对成熟MRSA生物膜(MRSA biofilm,MRSA-BF)活菌量的影响;扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察不同剂量AS对成熟MRSA-BF的形态学变化;通过超高压液相色谱—飞行时间质谱仪法(UPLC-TOF-MS)分析不同剂量AS干预成熟MRSA-BF菌体的内源性代谢物谱特征。结果AS表现出显著的抗MRSA活性,MIC为50 mg/mL;12.5 mg/mL和6.25 mg/mL浓度的AS均可较好地抑制MRSA及其BF的生长,破坏已成熟的膜性结构,且抑制作用呈剂量依赖关系。代谢组学结果提示27个内源性终端代谢物是反映生物膜形成的代谢物,相关的生物通路有苯丙氨酸(phenylalanine,PA)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)、色氨酸的生物合成以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢;16个内源性终端代谢物是6.25 mg/mL AS干预MRSA-BF的代谢标志物,相关的生物通路为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;18个内源性终端代谢物是12.5 mg/mL AS干预MRSA-BF的代谢标志物,通路分析未发现相关的生物通路;11个内源性终端代谢物是反映AS干预MRSA-BF的药效代谢标志物,其相关的生物通路包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、新生霉素的生物合成以及苯丙氨酸的代谢。结论AS对MRSA及其成熟生物膜均有抑制作用,抑制BF的机制与细菌苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、新生霉素的生物合成以及苯丙氨酸的代谢相关。AS可作为临床治疗MRSA-BF感染的潜在有效方案。

穿心莲内酯生物合成与调控的研究进展

穿心莲内酯是中药材穿心莲的主要活性成分,具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆等功效,临床上主要用于治疗小儿肺炎和上呼吸道感染等疾病。近年来,由于环境因素长期影响、品种纯度不高以及优良品种选育工作滞后等原因,很大程度上限制了穿心莲的品质提升。在穿心莲药材质量评价中,穿心莲内酯的含量是一项非常重要的指标,通过解析穿心莲内酯生物合成的分子机制及积累规律,有助于提升穿心莲药材质量。该文综述了穿心莲内酯的生物合成途径与分子调控机制,穿心莲内酯的生物合成主要分为两大阶段,即穿心莲内酯前体的合成阶段和穿心莲内酯合成的修饰阶段,其中前体合成研究已经较为清楚,但有关穿心莲内酯合成修饰阶段的途径和关键酶的挖掘还处于空白水平,需进一步研究。通过从环境因素和栽培措施两个层面对穿心莲内酯合成积累的关键影响因子进行挖掘,有利于建立完善的高品质穿心莲种植体系。此外,对调控穿心莲内酯生物合成的研究进展进行总结和展望,可为穿心莲药材品质提升提供参考。

穿心莲内酯联合多柔比星介导ROS依赖性DNA损伤诱导乳腺癌细胞死亡

目的探讨穿心莲内酯联合多柔比星对乳腺癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7分别单独使用多柔比星、穿心莲内酯或联合两药处理后,采用MTT实验、克隆形成实验分别检测细胞增殖能力、克隆形成能力。采用流式细胞术(PI染色和DCFH-DA染色)检测细胞死亡情况和细胞ROS水平,Western blot检测乳腺癌细胞的γ-H2AX、PARP和α-tubulin蛋白表达,添加ROS清除剂NAC进一步检测ROS对细胞DNA的影响。构建乳腺癌裸鼠异位移植瘤模型,单独使用多柔比星、穿心莲内酯或联合两药处理后,检测裸鼠体重、肿瘤体积,通过HE病理染色、Ki-67-IHC染色分别检测细胞死亡和肿瘤细胞增殖能力,验证联合用药在动物体内的治疗效果。结果与单独用药组相比,联合用药组乳腺癌细胞的增殖率、存活率和克隆形成能力均降低(均P<0.05),细胞ROS水平升高(P<0.001),γ-H2AX蛋白表达升高并诱导PARP蛋白发生裂解;与联合用药组相比,NAC+联合用药组的细胞存活率升高(P<0.05),而细胞ROS水平降低(P<0.001)、γ-H2AX蛋白表达减少。在动物实验中,不同处理组的裸鼠体重差异无统计学意义(均P>0.05);与单独用药组相比,联合用药组裸鼠肿瘤体积较小、肿瘤细胞死亡更多、Ki-67表达水平较低(均P<0.05)。结论穿心莲内酯能增强多柔比星抑制乳腺癌细胞增殖的能力。穿心莲内酯通过增加ROS水平加重细胞DNA损伤可能是诱导乳腺癌细胞死亡的机制。

穿心莲内酯磺化物注射液解热镇痛抗炎作用研究

为探究穿心莲内酯磺化物注射液的解热、镇痛、抗炎作用,将SD大鼠和KM小鼠分别随机分为空白组,阳性药穿心莲注射液组,穿心莲内酯磺化物注射液高、中、低剂量组。通过皮下注射干酵母诱导大鼠发热模型探究其解热作用;通过冰醋酸致小鼠扭体法探究其镇痛作用;通过二甲苯诱导小鼠耳肿胀法及λ-角叉菜胶诱导大鼠足肿胀法探究其抗炎作用。结果表明,穿心莲内酯磺化物注射液可显著抑制干酵母所致发热大鼠的肛温上升;显著抑制冰醋酸所致小鼠疼痛,减少扭体次数;显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀,减少肿胀度;显著抑制λ-角叉菜胶致大鼠足肿胀,减少肿胀度。由此可知,穿心莲内酯磺化物注射液具有明显的解热、镇痛、抗炎的作用。

穿心莲内酯磺化物注射液急性毒性及长期毒性研究

观察穿心莲内酯磺化物注射液的急性毒性及长期毒性反应,为临床安全用药提供参考。急性毒性试验选取40只SPF级昆明(KM)小鼠,雌雄各半,随机分为4组,每组10只,分别以5000 mg/kg、3968 mg/kg、3150 mg/kg、2500 mg/kg的剂量给药,每天2次,给药时间间隔2.5 h,末次给药完毕后,第2天起,连续7 d观察小鼠急性毒性反应。长期毒性试验选取80只SD大鼠,随机分为空白对照组及穿心莲内酯磺化物低剂量组、中剂量组、高剂量组,3个剂量组分别以LD50的1/10、1/50、1/100剂量对大鼠进行灌胃给药,连续给药30 d,各组大鼠自由采食、饮水,观察大鼠对穿心莲内酯磺化物长期毒性反应。结果显示,除死亡小鼠病理学检查出现部分异常,急性毒性试验各组小鼠多个脏器病理学检查无明显异常;与空白对照组相比,长期毒性试验各试验组大鼠体质量、采食量均正常,病理检查未见与药物毒性相关的主要脏器组织形态学改变。穿心莲内酯磺化物对小鼠半数致死量为4454.20 mg/kg,95%可信区间为4157.19~4773.09 mg/kg,急性毒性显示低毒,无长期毒性,临床治疗用药拥有较大的安全剂量。

穿心莲内酯磺化物注射液对猪的安全性评价

本试验旨在考察肌内注射穿心莲内酯磺化物注射液对靶动物猪的安全性。选取32头健康仔猪,随机分为空白对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组,3个剂量组分别以25 mg/kg、15 mg/kg、5 mg/kg剂量肌内注射给药,连续3 d,每天1次,观察各剂量组猪给药后的临床表现,考察穿心莲内酯磺化物注射液对猪血液生理、生化指标的影响,试验结束时,对高剂量组及空白对照组试验猪进行剖检及组织病理学检查。结果显示,连续给药后7 d,与空白对照组相比,各剂量组猪临床表现正常,血液生理、生化指标均无显著性差异,各脏器组织均无明显的与药物有关的病理变化。表明通过肌内注射穿心莲内酯磺化物注射液对靶动物猪无明显不良反应,安全性较高。

穿心莲内酯通过抑制Fas/FasL信号轴降低子宫内膜癌Ishikawa/DPP细胞对顺铂的耐药性

目的:探讨穿心莲内酯(Andro)调节脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配体(FasL)信号轴对子宫内膜癌Ishikawa细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法:采用0、5、10、20μg/mL DDP分别处理Ishikawa细胞和顺铂耐药的Ishikawa/DPP细胞,0、5、10、25、50μmol/L Andro处理Ishikawa/DDP细胞,MTT法检测细胞增殖情况并为后续实验选择合适的给药剂量。将Ishikawa/DDP细胞随机分为对照组、DDP组(DDP干预)、Andro组(DDP、Andro干预)、pcDNA3.1-NC组(转染pcDNA3.1+DDP、Andro干预)、pcDNA3.1-Fas/FasL组(转染pcDNA3.1-Fas/FasL+DDP、Andro干预),24 h后,采用qPCR法检测Fas、FasL mRNA的表达,平板克隆形成实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞克隆能力、细胞迁移与侵袭和细胞凋亡,WB法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、BAX、Bcl-2、MMP-2、PD-L1、多药耐药蛋白-1(MDR-1)及Fas、FasL蛋白表达。结果:DDP以剂量依赖的方式抑制Ishikawa和Ishikawa/DPP细胞增殖,并且与Ishikawa细胞比较,Ishikawa/DPP细胞对DDP的敏感性更低(均P<0.05);Andro以剂量依赖性的方式抑制Ishikawa/DPP细胞的增殖(均P<0.05)。Ishikawa/DPP细胞中Fas、FasL的表达水平均高于Ishikawa细胞(均P<0.05)。选取20μg/mL DDP和25μmol/L Andro为干预剂量,干预时间24h。与对照组比较,DDP组Ishikawa/DPP细胞中PD-L1、MDR-1、Fas、FasL mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而克隆形成率、迁移与侵袭细胞数、凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05);与DDP组比较,Andro组Ishikawa/DPP细胞中Fas、FasL mRNA表达水平、细胞克隆形成率、迁移与侵袭细胞数、PCNA、Bcl-2、MMP-2、PD-L1、MDR-1、Fas、FasL蛋白表达水平显著降低,BAX蛋白表达水平及凋亡率显著升高(P<0.05或P<0.01),pcDNA3.1-NC组与Andro组类似;与pcDNA3.1-NC组比较,pcDNA3.1-Fas/FasL组Ishikawa/DPP细胞上述指标变化均被逆转(P<0.05)。结论:Andro可能通过抑制Fas/FasL信号轴来抑制Ishikawa/DPP细胞增殖、迁移与侵袭,促进凋亡,从而降低细胞对DDP的耐药性。

穿心莲内酯减轻脂多糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡机制

目的探讨穿心莲内酯(AG)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症肾小管上皮细胞(HK-2细胞)铁死亡的影响及其作用机制。方法采用LPS处理HK-2细胞,模拟脓毒症HK-2损伤体外模型,进一步用5、10、20、40μmol/L的AG进行干预,将细胞随机分为对照组(Control)、LPS组、LPS+二甲亚砜(DMSO)组、AG组。采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出最适LPS和AG浓度;比较各组中细胞形态变化,肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子-1(KIM-1)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,以及铁死亡调控蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁蛋白(Ferritin)的表达水平,评估AG处理对细胞的保护作用。结果与Control组相比,10μg/mL LPS诱导的HK-2细胞中细胞活力及GSH含量下降,细胞皱缩、贴壁能力差,氧化产物MDA和ROS含量以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平明显升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,Ferritin蛋白表达水平增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而在使用AG干预后,与LPS组相比,细胞活力升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高,而Ferritin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);MDA含量和ROS荧光强度以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AG对LPS诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用,其机制可能是激活SLC7A11/GPX4通路,减少氧化应激,上调抗氧化酶活性,减轻细胞铁死亡。

穿心莲内酯介导c-SKI抑制心肌成纤维细胞转分化和心肌纤维化

目的:探讨c-SKI(cellular Sloan-Kettering Institute)蛋白表达变化对穿心莲内酯(andrgrapholide,Andr)治疗小鼠心肌纤维化的影响。方法:将18只C57雄性小鼠随机分为control组、模型组[异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)组]和ISO+Andr组,每组6只。ISO组和ISO+Andr组小鼠皮下注射ISO,control组注射生理盐水;ISO+Andr组小鼠给予Andr灌胃,ISO组和control组给予等体积生理盐水灌胃。给药8周,取心脏组织进行HE和Masson染色检测病理特征;免疫组化或Western blot实验检测c-SKI和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关蛋白水平;qPCR检测c-SKI mRNA水平。用不同浓度Andr干预人心脏成纤维细胞(human cardiac fibroblasts,HCFBs)48 h,CCK-8实验检测细胞活力,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平。用Andr最低有效剂量处理转分化细胞模型,显微镜观察细胞形态,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平,qPCR检测c-SKI mRNA水平。敲减c-SKI和Andr联合处理转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的HCFBs,CCK-8实验检测细胞增殖活力,Western blot实验检测c-SKI和ECM相关蛋白水平。结果:与ISO组相比,Andr干预后小鼠心肌纤维排列整齐,心肌细胞形态基本正常,细胞膜完整,胶原容积分数显著减少(P<0.01),c-SKI的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.05或P<0.01),纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和I型胶原(collagen type I,Col I)蛋白水平显著下调(P<0.01)。HCFBs经50μmol/L Andr处理48 h,细胞活力显著降低(P<0.01),FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白水平显著下调(P<0.01),c-SKI表达显著上调(P<0.01)。与PBS组相比,TGF-β1组细胞数量增多,胞核固缩,细胞形态改变,细胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白表达显著上调(P<0.01),c-SKI表达显著下调(P<0.01);Andr干预逆转了TGF-β1对HCFBs的诱导作用。敲减c-SKI和Andr联合处理显著下调HCFBs中c-SKI表达(P<0.01),显著上调FN1、α-SMA、vimentin和Col I蛋白表达水平(P<0.05),显著增强细胞活力(P<0.05)。结论:Andr可能通过调控c-SKI表达影响TGF-β1信号通路,抑制心肌成纤维细胞增殖和ECM沉积,从而抑制心肌纤维化。

穿心莲内酯自微乳给药系统制备

目的制备穿心莲内酯自微乳给药系统。方法根据平衡溶解度、辅料配伍、伪三元相图确定辅料比例范围。以广藿香油占比、Labrasol ALF与Tween 80比例、Km为影响因素,平衡溶解度为评价指标,星点设计-响应面法优化处方,再进行体外评价。结果最优处方为广藿香油、Labrasol ALF、Tween 80、Transcutol HP占比10.45%、13.28%、9.82%、66.44%,平衡溶解度为(11.95±0.04)mg/g。质量参数分别为乳化时间(20.22±0.38)s,粒径(51.70±2.91)nm,多分散指数0.27±0.02,透光率(91.21±1.58)%。自微乳给药系统冻融稳定性良好,稀释倍数、分散介质对其粒径无明显影响,在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中溶出迅速。结论自微乳给药系统可提高穿心莲内酯溶解度、溶出速率。

穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用

为探究穿心莲内酯(AP)对金黄色葡萄球菌(S.aureus)外排系统的抑制作用,本试验采用微量肉汤稀释法和棋盘法检测AP与抗菌药物的联合抑菌作用,荧光分光光度法检测AP对S.aureus体内环丙沙星蓄积量的影响,PCR和实时荧光定量PCR方法检测S.aureus外排泵基因的携带情况和AP对S.aureus外排泵基因转录水平的影响。结果显示,AP与环丙沙星具有协同作用;AP与S.aureus作用12 min时,能极显著提高菌体内环丙沙星的蓄积量(P<0.000 1);外排泵基因norA、norB、norC、sepA、mepA和mdeA同时携带的比例为24.1%,norB基因的检出率最高,为87.4%;AP作用后,S.aureus外排泵基因转录水平均极显著下降(P<0.001或P<0.000 1),其中norB在AP浓度达到256和512μg/mL时下降幅度最大,较空白对照降低91%(P<0.001),提示AP可通过抑制外排泵基因的表达来增强S.aureus对药物的敏感性。本试验从耐药表型和基因表达水平来确认AP是否可成为一种潜在的外排泵抑制剂,为解决S.aureus耐药问题提供新的思路。