人端粒重复序列结合蛋白研究进展

近年来研究表明,端粒重复序列结合蛋白在调节端粒的长度和功能方面起着十分重要的作用。这种作用依赖或不依赖于端粒酶,与细胞衰老和肿瘤发生、发展有密切关系。本文介绍近年来发现的一些重要的端粒重复序列结合蛋白研究进展。

P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

目的 :通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质 1(Telomericrepeatbindingprotein 1,TRBP1)与P5 3的体外结合 ,探讨P5 3通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制。方法 :谷胱甘肽S转移酶 (glu tathioneS transferase ,GST)和人P5 3 GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽 SepharoseTM4B纯化后 ,和人乳腺癌细胞MCF 7细胞蛋白进行体外结合反应 (pulldown) ,Westernblot检测反应物中P5 3和TRBP1的结合。融合蛋白中人P5 3包括野生型 (1～ 393)、C端缺失体P5 3N5 (2～ 2 93)、N端缺失体P5 32C(95～ 393)、175单个氨基酸突变体P5 3R175H(R→H)。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R2 5 0染色显示 ,纯化的GST和 4种P5 3 GST蛋白纯度在 90 %以上 ,且分子量与预计的完全一致。TRBP1的Westernblot显示 ,野生型P5 3和P5 3 R175H均能沉淀MCF 7中的TRBP1,且结合力相似 ,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用。与野生型P5 3和P5 3R175H相比 ,P5 32C与TRBP1的结合力明显增加 ,P5 3N5与TRBP1的结合力明显减弱。结论 :P5 3和TRBP1可以直接体外结合 ,P5 3的C端 (2 93～ 393)是与TRBP1结合的结构域。P5 3和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关。

中医药干预核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体防治类风湿性关节炎的研究进展

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、全身性自身免疫性疾病,以软骨损伤、滑膜炎症等为主要病理特征。核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体是一种细胞内感应蛋白复合物,可感知内源性危险信号并鉴别外来病原体,从而释放白细胞介素-1β、白细胞介素-18等促炎因子,介导细胞凋亡。研究表明,NLRP3炎症小体可以诱发炎症级联反应,加速软骨破坏,与RA密切相关。中医药在防治RA方面已取得一定成果。多项研究证实,中医药可靶向干预NLRP3炎症小体介导RA的病变过程,但尚未有系统性的相关论述。该文论述NLRP3炎症小体参与RA的机制,总结归纳近几年中医药干预NLRP3炎症小体防治RA的研究进展,以期为RA靶向药物的研发与应用提供一定借鉴。

端粒重复序列结合蛋白1与2在系统性红斑狼疮患者中的表达变化及其临床意义

目的探讨端粒重复序列结合蛋白（TRF）1和TRF2在SLE发病中可能的作用。方法①收集107例SLE患者（根据病情是否活动分为活动期组40例与稳定期组67例，根据是否合并肾脏损害分为肾损组46例及无肾损组61例）、41名健康体检者为健康对照组的外周血、实验室资料及临床资料。②采用实时荧光定量多聚酶链反应（RT-qPCR）及蛋白质印迹法检测不同组别TRF1、TRF2转录水平和蛋白表达水平。③采用SPSS19．0软件行独立样本t检验、单因素方差分析及Kruskal．Wallis非参数检验，Speannan相关分析进行统计分析。结果①TRF1、TRF2转录及蛋白水平在SLE活动期组（TRF1：0．0031±0．0033；TRF2：0．0105±0．0648）、肾损组（TRF1：0．0023±0．0026；TRF2：0．0043±0．0033）分别高于稳定期组（TRF1：0．0012±0．0011；TRF2：0．0042±0．0086）、无肾损组（TRF1：0．0013±0．0018；TRF2：0．0034±0．0072）及健康对照组（TRF1：0．0012±0．0030；TRF2：0．0034±0．0027）比较差异有统计学意义（P均〈0．05），健康对照组与稳定期组、无肾损组分别比较差异无统计学意义；②Spearman相关性分析发现在SLE患者中TRF1转录水平与TRF2（r=0.356，P〈0.01）、ESR（r=0.365，P〈0.05）正相关，TRF2转录水平与TRF1（r=0．356，P〈0．01）、SLEDAI评分值（r=0．270，P〈0．05）、ESR（r=0.304，P〈0．05）、肌酐（r=0．258，P〈0.05）及尿蛋白定量（24h）（r=0.344，P〈0.05）正相关。结论TRF1、TRF2在SLE患者异常表达，提示其可能参与了SLE的发生发展；TRF2与SLEDAI评分、尿蛋白定量（24h）呈正相关，提示TRF2可能可作为SLE病情活动及肾脏榻害的生物标记。

端粒重复序列结合蛋白质1与2在原发性干燥综合征患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义

目的端粒重复序列结合蛋白质1(telomeric-repeat binding factor-1,TRF1)和端粒重复序列结合蛋白质2(telomeric-repeat binding factor-2,TRF2)基因表达异常在原发性干燥综合征(primary Sjogren's,pSS)发病中可能的作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测55例pSS患者和41例健康对照者(healthy control,HC)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中TRF1和TRF2转录水平,并与临床指标进行相关性分析。结果 (1)PBMCs TRF2转录水平在SS组显著高于HC组(0.0047±0.0107 vs.0.0026±0.0049,P=0.001),而TRF1转录水平在两组表达差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Spearman相关性分析发现在SS组中TRF2与白细胞计数(WBC)(r=0.309,P<0.05)、中性粒细胞计数(GR)(r=0.312,P<0.05)、补体3(C3)(r=0.470,P<0.05)、抗核抗体(ANA)(r=0.339,P<0.05)呈显著正相关,TRF1转录水平与TRF2(r=1,P<0.01)、WBC(r=0.316,P<0.05)、GR(r=0.313,P<0.05)、ANA(r=0.421,P<0.05)呈显著正相关。结论 TRF2转录水平在SS患者的增高提示其可能参与了SS患者端粒酶激活和端粒缩短的调节;TRF2、TRF1表达水平与WBC、GR、C3、ANA呈显著正相关,提示TRF2、TRF1可能参与了SS炎症免疫调节,且与SS的发病机制有关。加强端粒保护蛋白在SS等自身免疫性疾病的研究有利于进一步阐明这类疾病的发病机制。

端粒重复序列结合蛋白1与2在原发性痛风性关节炎患者中的变化及其临床意义

目的 探讨端粒重复序列结合蛋白（TRF）1和TRF2在原发性痛风性关节炎（GA）发病中可能的作用.方法 将研究对象分为急性期GA（AGA）组77例、非急性期（NAGA）组49例及健康对照组79名.实时荧光定量多聚合酶链反应（RT-qPCR）及蛋白质印迹法分别检测TRF1和TRF2在3组PBMCs中转录水平及蛋白水平的表达.采用单因素方差分析,LSD法两两比较和Spearman相关分析行统计学处理.结果 ①TRF1、TRF2转录水平及蛋白水平在AGA组（0.012 6±0.005 3和0.017 6±0.007 8）和NAGA组（0.009 5±0.003 6和0.014 0±0.004 1）均显著高于健康对照组（0.004 2±0.001 2和0.005 8±0.0019,F=10.818,F=8.869,P均＜0.01）.②在AGA组中TRF2转录水平均与淋巴细胞（LY）呈正相关（r=0.289,P＜0.05）,TRF1转录水平与TRF2（r=0.935,P＜0.01）、LY（r=0.256,P＜0.05）、TG （r=0.281,P＜0.05）、极低密度脂蛋白（VLDL-C）（r=0.291,P＜0.05）均呈正相关.结论 端TRF1、TRF2在原发性GA患者的异常表达及与LY呈正相关,提示其可能参与了痛风的发生发展及免疫与炎症调节.

端粒重复序列结合蛋白TRF1及TRF2在前列腺癌中的表达及临床意义

目的：探讨端粒重复序列结合蛋白（telomere repeat binding factor 1,TRF1）及TRF2在前列腺癌中的差异性表达及临床意义。方法：选取我院2015年1月~2016年4月住院的前列腺癌患者及前列腺增生患者各50例,采用免疫组织化学方法检测各组患者TRF1及TRF2的表达,并对其表达水平与临床指标及Gleason评分进行相关性分析。结果：前列腺癌组织中TRF1蛋白表达水平明显高于前列腺增生组织,差异具有统计学意义（χ^2=62.69,P〈0.01）;TRF2蛋白在两组中均呈现高表达,差异未见明显统计学意义（χ^2=1.13,P=0.76）;单因素分析发现TRF1表达水平与有无外科包膜侵犯（Spearman＇s r=0.43,P=0.002）、精囊浸润（Spearman＇s r=0.35,P=0.01）及淋巴结转移（Spearman＇s r=0.41,P=0.003）、TPSA水平（r=0.61,P〈0.05）、Gleason评分（r=0.47,P=0.01）具有显著相关性,而与前列腺体积大小（r=0.06,P=0.75）及年龄（r=0.14,P=0.09）无明显相关性。结论：TRF1及TRF2在前列腺癌中均呈现高表达,但TRF2的表达无特异性,TRF1的表达对预测前列腺癌预后具有一定价值。

人端粒重复序列结合因子(hTRF1)蛋白质在急性白血病中的表达水平与端粒酶活性关系的研究

为了研究人端粒重复序列结合因子(TRF1)蛋白质在急性白血病(AL)及正常骨髓组织中的表达水平,AL和正常骨髓组织中端粒酶活性及TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系,定量分析了AL患者及正常人骨髓组织中TRF1蛋白质的表达水平,并应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质作为定量标准,建立以抗TRF133-277单克隆抗体的定量Westernblot的方法,而且以该方法检测TRF1蛋白质在组织中的表达水平;另外,应用TRAP-PCR-ELISA法检测AL患者及正常人骨髓组织端粒酶活性,以研究TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系。结果表明:20例AL患者骨髓组织中TRF1表达水平较正常人骨髓组织显著降低,差异具有显著性(P<0.01);急性淋巴细胞性白血病患者的TRF1表达水平较急性非淋巴细胞性白血病患者略减低,但差异无统计学意义(P>0.05);化疗缓解的患者TRF1表达水平较前增高,但仍低于正常(P<0.01);化疗后完全缓解患者的TRF1表达水平较未缓解的患者显著增高,差异具有显著性(P<0.01);AL患者初发未治时骨髓细胞端粒酶的活性明显高于正常人(P<0.05)和首次缓解者(P<0.01);初发未治时,ALL患者骨髓细胞端粒酶活性略高于ANLL患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性呈明显负相关(P<0.001)。结论:TRF1蛋白质在AL患者骨髓细胞中的表达明显减低,且与疗效及端粒酶活性相关。

端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌中的表达

目的检测端粒重复序列结合因子1和2及端粒保护蛋白1基因在食管癌组织中的表达。方法收集我院33例明确诊断为食管癌患者的中心组织及其相应癌旁组织,然后提取总RNA并逆转录成cDNA,适时荧光定量PCR方法检测TRF1、TRF2和POT1基因在这些组织中的表达水平。结果 TRF1mRNA在食管癌中心和癌旁表达所得CT值分别为(1.42±2.31)和(1.02±1.04),差异有统计学意义(P<0.05,n=33);TRF2为(8.53±2.57)和(8.38±1.50),两者差异无统计学意义(P>0.05,n=33);POT1为(4.72±1.47)和(3.80±1.06),两者差异有统计学意义(P=0.001,n=33)。结论虽然TRF2基因在食管癌中表达没有统计学差异,但TRF1和POT1基因在食管癌组织中表达显著降低,提示TRF1和POT1有可能与食管癌的发生、发展有着密切的关系。

端粒重复序列结合因子1蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

目的研究端粒重复序列结合因子1(TRF1)蛋白在胃癌中的表达及其与胃癌发生发展的关系。方法用Westernblot方法检测TRF1蛋白在10例正常胃黏膜、15例胃癌前病变、20例胃癌、5例淋巴结转移胃癌组织中的表达。结果TRF1蛋白在癌前病变组、胃癌组、转移癌组比正常组表达高;胃癌组、转移癌组比癌前病变组表达高(P<0.01)。在胃癌组织中,TRF1蛋白的表达与胃癌分化程度有关,分化越差,表达越高(P<0.01)。结论TRF1蛋白可能在胃癌的发生发展中起重要作用。

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的 :研究 TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平。方法 :定量分析肾组织中 TRF1蛋白的表达水平 ,应用经倍比稀释的 TRF13 3 -2 77纯化蛋白作为定量标准 ,建立了以抗 TRF13 3 -2 77单抗作定量 Wes-tern- blot的方法 ,并以该方法检测 TRF1蛋白在组织中的表达水平。结果 :32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质 ,均值为 2 .4 2 8± 1.35 2 μg/ μl,癌旁自身对照组织 TRF1的表达水平为 3.6 11± 1.92 2 μg/ μl(t=5 .776 ,P<0 .0 0 1)。肿瘤组织内 TRF13 3 -2 77表达水平较相应癌旁组织显著降低 ,并与肿瘤的恶性程度相关 ,差异具有显著性意义 (P<0 .0 1)。结论 :TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低 ,并与肿瘤恶性程度呈负相关。

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响。方法将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只。对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合。建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃。于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量。结果建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用。

人端粒重复序列结合因子1^(33-277)在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的 :建立能高效表达人端粒重复序列结合因子 1第 33- 2 77位 (TRF1 33- 2 77)氨基酸的菌株并制备多抗。方法 :设计一对引物 ,分别带有 Kpn 和 Eco RI位点 ,从已经克隆了 TRF1 c DNA全长的重组质粒 p CR -TOPO-TRF1扩增 TRF1 33- 2 77c DNA片段 ,克隆入 PGEM-T质粒 ,测序和酶切图谱鉴定 ,Eco RI酶切后亚克隆入 p GEX-3X的 Eco RI位点之间 ,筛选正向插入重组子。转化大肠杆菌 DH5 a,筛选高表达菌株。结果 :得到高效表达融合蛋白的菌株 DH5 a-TRF1 33- 2 77。其融合蛋白经western blot证实具 TRF1抗原性。结论 :所建立的菌株为 h TRF1单克隆和多克隆抗体制备提供蛋白来源。

人端粒重复序列结合因子在急性白血病细胞中的表达及与端粒酶活性的关系

目的 :研究人端粒重复序列结合因子 (TRF1)在 30例急性白血病细胞中的表达 ,了解 TRF1表达与急性白血病分型的关系 ,以及与端粒酶活性的关系。方法 :用荧光定量 RT- PCR定量检测 30例急性白血病细胞中TRF1m RNA表达情况 ,同时检测 h TERT m RNA的表达 ,并分析两者之间的相关性。结果 :TRF1在急性非淋巴细胞性白血病 (ANLL)细胞中的表达 0 .0 12 6 (0 .0 12 7～ 0 .0 5 46 )明显低于正常人骨髓单个核细胞中的表达 0 .0 4 5 7(0 .0 0 839～ 0 .2 6 2 ) (P<0 .0 0 1) ,但在急性淋巴细胞性白血病 (ALL)细胞中的表达 0 .0 74 5 (1.92× 10 -6～ 0 .193)与正常人骨髓单个核细胞比较差异无显著性 ,且在 ANL L细胞中的表达明显低于 ALL细胞中的表达 (P=0 .0 0 1)。TRF1和 h TERT在急性白血病细胞和正常人骨髓单个核细胞中的表达无显著相关性 (r=- 0 .173,P=0 .2 0 7)。结论 :TRF1m RNA在 ANLL细胞中表达明显降低 ,而在 ALL细胞中表达无显著改变 ,提示 ANLL细胞中 TRF1可能通过调控端粒长度对端粒酶起间接负调控作用。

端粒重复序列结合因子2真核表达载体的构建及表达

目的:构建端粒重复序列结合因子2(TRF2)真核表达载体,观察其在胃癌细胞中的表达。方法:EcoR I,HindⅢ双酶切AdTRF2质粒,胶回收1600bp小片段,连接入pcDNA3.1载体。经双酶切及测序鉴定后转染SGC7901细胞,空载体质粒转染SGC7901细胞为对照。G418选择培养液培养2个月,选取转染组及对照组细胞克隆。①细胞用阿霉素处理6h后Westernblot法检测TRF2表达。②MTT法检测转染对细胞生长增殖速度的影响。结果:成功构建TRF2真核表达载体,转染后SGC7901细胞TRF2表达明显增高,对细胞的生长增殖速度无明显影响(P>0.05)。结论:成功构建TRF2真核表达载体及稳定转染细胞株,为进一步研究TRF2功能奠定了基础。

人端粒重复序列结合因子基因组和假基因研究

目的 :确定人端粒重复序列结合因子 (TERF1)的基因组结构和假基因的定位与结构。方法 :利用 Gen Bank等生物信息学资源 ,NCBI提供的 BLAST及其他相关的生物信息学工具 (Sequencher,DNA Strider和 Autoassembler等 ) ,确定 TERF1基因组和假基因的定位与结构 ,并用 PCR和测序证实。结果 :定位在 8q13上的 TERF1基因组由 10个外显子构成。它有 4个假基因分别分布在第 13、18、2 1和 X染色体上 (Ψ TERF1- 13、Ψ TERF1- 18、Ψ TERF 1- 2 1和Ψ TERF1- X) ,其结构均与 TERF1m RNA相似 ,但缺少部分外显子。Ψ TERF1- 13、Ψ TERF 1- 18和Ψ TERF1- 2 1的周边序列之间存在长度至少 6 0 kb的同源片段。结论 :TERF1基因组含 10个外显子 ,它有 4个加工过的假基因分布在第13、18、2 1和 X染色体上。大片段同源序列属近期重复片段中的染色体间倍增。

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段 (TRF133 -277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF133 -277,将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白兔 ,制备血清过柱纯化 ,将TRF133 -277 和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱 ,血清过GST柱以去除抗GST抗体 ,然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体 ,获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗 ,在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带 ,与阳性对照基本一致。 结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效 ,所获抗TRF133 -277

端粒重复序列结合因子1在子宫内膜癌的表达及与临床病理特征的相关性研究

目的探讨端粒重复序列结合因子1(TRF1)在子宫内膜癌的表达及与临床病理特征的相关性。方法选择行手术诊治的子宫内膜癌患者120例的癌组织标本与癌旁组织标本作为研究对象,所有标本都给予TRF1的免疫组化分析,同时记录患者的临床病理特征并进行相关性分析。结果子宫内膜癌组织中TRF1表达阳性率分别为90.8%,癌旁组织为28.3%,对比有统计学意义(P <0.05)。在子宫内膜癌组织中,TRF1的表达阳性率随着分化程度的降低、临床分期的增加、肌层浸润深度的加深、淋巴结的转移而显著增高(P <0.05); TRF1表达阳性率与患者年龄、大体类型、组织类型无关(P> 0.05)。Spearman等级相关分析显示:TRF1表达与临床分期、肌层浸润、淋巴结转移呈显著正相关性(P<0.05),与分化程度呈显著负相关性(P <0.05)。结论 TRF1在子宫内膜癌组织中呈现高表达状况,与临床病理特征有很好的相关性,可用于指导进行临床诊断与治疗。

端粒重复序列结合因子1和2在口腔黏膜癌组织中的表达及临床意义

目的研究端粒重复序列结合因子(telomere repeat binding factor,TRF) 1、TRF2在口腔黏膜癌组织中的表达情况及临床意义。方法收集2012年7月—2016年7月武汉大学人民医院收治的48例口腔黏膜癌患者癌组织和癌旁组织标本以及32例正常人口腔软组织表本,采用免疫组化方法来检测癌组织、癌旁组织和正常人口腔软组织标本中TRF1与TRF2蛋白的表达情况。结果口腔黏膜癌组织中TRF1的阳性率明显低于癌旁组织和正常组织(P<0. 01),并且高分化与中分化癌组织中TRF1的阳性率显著高于低分化癌组织(P<0. 05)。癌组织中TRF2阳性率显著高于癌旁组织与正常组织(P<0. 01),在高分化与中分化癌组织中TRF2阳性率明显低于低分化癌组织(P<0. 05)。结论 TRF1的阳性率在癌组织中明显降低,而TRF2的阳性率在癌组织中显著升高,表明TRF1与TRF2蛋白表达水平的变化可能与口腔黏膜癌的发生发展密切相关。

端粒重复结合蛋白1与磷酸化激酶Aurora B相互作用研究

目的鉴定端粒重复结合蛋白1(TRF1)的磷酸化位点及其与磷酸化激酶Aurora B在体内外的相互作用。方法用myc-His-TRF1真核表达质粒转染人宫颈癌细胞HeLa,免疫沉淀后行质谱分析。采用免疫沉淀及体外沉降实验研究TRF1与Aurora B的相互作用。结果免疫沉淀实验结合质谱分析鉴定出5个新的TRF1磷酸化位点;运用体外沉降实验和体内免疫共沉淀实验证实Aurora B能够与TRF1在体内外相互结合。结论Aurora B可能是一个新的TRF1结合蛋白,TRF1与Aurora B能够在体内外相互结合。