转基因植物中筛选标记基因的利用及消除

在基因转移过程中,人们常常使用标记基因来筛选转化细胞或组织。常用的筛选标记基因尤其是抗生素抗性基因的使用往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且影响基因多重转化。为了消除这些弊端,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。本文主要综述转基因植物中有关筛选标记基因及其消除方法。

G418和氯霉素作为转基因盐藻的抗生素筛选标记

寻找可以作为筛选标记的抗生素是进行盐藻转基因的前提 ,尤其是分子更小、反应更灵敏的抗生素。通过降低培养液中NaCl浓度至 0 2 5mol l以后 ,进行抗生素筛选 ,得到了一种可以作为筛选标记的抗生素———G4 18,70 0 μg/mlG4 18在第 5d即比较完全地杀死野生型盐藻细胞。由于未知的原因 ,实验中氯霉素表现出的抑制浓度是 4 0 0 μg ml,作用时间是 10d以上 ,不同于已有报道。在含 1 5mol lNaCl的盐藻培养基中 ,氯霉素、潮霉素、壮观霉素、G4 18、氨苄青霉素、卡那霉素都没有表现出杀死盐藻细胞的能力。这说明G4

以木糖异构酶基因为筛选标记的玉米遗传转化

利用木糖异构酶基因作为筛选标记可以在含有不同浓度木糖的培养基上筛选出玉米再生植株,其中50%～100%木糖浓度的总体筛选效果较好,但不同玉米基因型之间筛选的最佳浓度差异很大。通过DNA点杂交、PCR及PCR-Southern印记法检测表明,木糖异构酶基因已经整合到转基因植株中。以木糖作为筛选剂,可以减小潜在的生物安全隐患。

用绿色荧光蛋白基因作为筛选标记的新型克隆载体的构建

用绿色荧光蛋白基因作为筛选标记的新型克隆载体的构建李寿东齐义鹏胡建红林宏（武汉大学病毒研究所武汉４３００７２）目前通常使用的质粒克隆载体，如ｐＵＣ系列、ｐＧＥＭ系列和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等，都是以ｌａｃＺ’作为筛选标记的插入失活型载体。ｌａｃＺ’...

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作为食品级筛选标记的研究

为研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,作者从嗜酸乳杆菌基因组中克隆β-半乳糖苷酶基因并在乳酸乳球菌中表达,通过X-gal显色筛选阳性克隆;用X-gal显色筛选方法将重组乳酸乳球菌传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力。结果显示:通过表达有活性的β-半乳糖苷酶和X-gal显色可成功筛选出阳性克隆菌株;对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.592>0.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.882>0.05)。由此可见,β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性,为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素(Myostatin,MSTN)基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞(PK15细胞),用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。

以对潮霉素抗性为筛选标记的棉花遗传转化

以 HPT基因作为筛选标记基因 ,潮霉素作为筛选剂 ,通过农杆菌介导法将 GFP基因导入棉花细胞并得到再生植株。经过 Southern杂交证实外源基因已经整合到棉花基因中 ,荧光显微镜可以观察到绿色荧光 ,说明 GFP基因得到表达。研究确定了潮霉素作为棉花转化的筛选剂在农杆菌介导的转化中适用的浓度范围及筛选方法 ,即棉花转化中潮霉素的筛选浓度范围为 2 .5～ 1 0 mg· L- 1,在有 GFP等一些易于观察和检测的标记基因存在时 ,起始浓度可用较低 ( 2 .5 mg· L- 1)的筛选浓度 ;而在没有标记基因或检测方法较复杂时 ,起始浓度用较高 ( 1 0 mg· L- 1)

共转化法删除转基因植物筛选标记基因的研究

筛选标记基因因其在植物基因工程中的重要作用而得到了普遍应用,目前使用的筛选标记主要是抗生素抗性基因或抗除草剂基因,然而一旦获得转基因植株,它的存在不但没有必要,而且还引起人们的种种顾虑。因此如何从转基因植物中删除筛选标记基因成为植物基因工程研究的重要内容。目前已有多个系统用来删除选择标记基因,从而获得无筛选标记基因的转基因植株。其中共转化法操作简便因而得到了广泛的应用。本文综述了共转化法研究的最新进展并对其实际应用的可行性进行探讨。

ahFAD2基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化

将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段。利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛。

乳酸菌食品级筛选标记研究进展

构建食品级载体是开发乳酸菌潜在应用价值的关键。筛选标记是载体的重要组成部分,也是目前乳酸菌遗传学研究领域的一个热点。本文对国内外已构建的食品级筛选标记系统,包括抗性筛选标记系统、互补型筛选标记系统进行了综述,以期对食品级筛选标记系统的进一步研究提供有价值的参考。

舟形藻生长、品质特性及转化筛选标记研究

研究了舟形藻(Navicula tenera)细胞表型和积累模式,利用索式抽提法和气质联用(GC-MS)方法对其进行总油脂含量和脂肪酸组分的分析,并研究了舟形藻对氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、草胺膦(PPT)、庆大霉素(Gen)、链霉素(Str)、遗传霉素(G418)、潮霉素(Hyg)以及氯霉素(Cm)这8种常用抗生素的敏感性。结果显示,舟形藻细胞以沉积底部的生长模式积累;其总油脂含量占其干物质重量的8.31%,脂肪酸种类主要有C16∶0,C16∶3(n-4)和C20∶5(n-3)(EPA),分别占总脂肪酸的64.13%、15.87%和19.62%;舟形藻对Cm和G418非常敏感,对Hyg较敏感,而对不同浓度的Amp、Kan、Gen、Str以及PPT极不敏感。为舟形藻基因工程筛选标记的确立,进而建立其遗传转化系统奠定了基础。

以潮霉素为筛选标记猕猴桃遗传转化体系的初步建立

以带潮霉素筛选标记基因的质粒载体通过农杆菌介导法分别转化猕猴桃的叶片、叶柄和茎段,并获得转化再生植株。结果表明:筛选时潮霉素浓度以2mg/L合适;叶片预培养以光照为适合,而叶柄和茎段差别不大;就转化率而言,茎段明显高于叶柄和叶片;经PCR检测初步证实转化植株为阳性植株。

农杆菌介导大麦无筛选标记转基因植株的获得

【目的】目前,国内外大麦遗传转化主要利用Golden Promise品种,基因依赖性严重,尤其是大麦的转化效率较低,并且获得安全型转基因大麦植株对其进一步产业化非常重要。建立高效、无筛选标记大麦遗传转化体系,拓展大麦遗传转化的受体基因型,为大麦基因功能解析和大麦转基因育种及商业化种植提供技术保障。【方法】以优良大麦品种Vlamingh为受体,取开花授粉后14 d左右的幼胚为转化材料,通过对培养基成分及培养步骤优化,建立农杆菌介导的高效遗传转化体系,并利用该体系将Bar和GUS在不同T-DNA区段的双T-DNA表达载体pWMB123转化大麦,获得候选转基因植株,然后利用PCR、Bar试纸条、组织化学染色和Southern blot等检测方法,在T1代转基因植株中成功获得无筛选标记大麦转基因植株。【结果】在愈伤组织分化阶段,发现培养基中添加1.0 mg·L^-1 KT、0.5 mg·L^-16-BA和0.05 mg·L^-1 NAA明显促进愈伤组织分化。在转基因植株生根阶段,发现采用添加1.0 mg·L^-1的IBA的SM1(无其他生长素)的生根效果最佳,培养基中添加2.5 mg·L^-1 CuSO4显著降低了大麦转基因植株白化现象。共转化了138个幼胚,最终获得14株大麦转基因植株,转化效率10.14%。PCR、Bar试纸条、GUS染色等检测证实,T0代转基因植株中均含有Bar,而仅有10株含有GUS,2个T-DNA的共转化效率为71.43%。选取4个同时含有Bar和GUS的转基因植株,对其自交后代进行检测,在BL8株系中筛选到2株只含GUS而不含Bar的转基因植株,无筛选标记效率为6.9%。在T1代转基因植株中对Bar和GUS进行了Southern blot鉴定,发现在多数转基因植株中Bar和GUS均为多拷贝整合,进一步证实BL8-15和BL8-19为无筛选标记的转基因植株。【结论】利用大麦品种Vlamingh为转化材料可以较高效率获得转基因植株,提高愈伤组织分化效率和转基因植株生根效率,降低转基因植株白化现象。利用农杆菌介导双T-DNA表达载体转化大麦,成功获得了无筛选标记转基因植株。

植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究

以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。

两种筛选标记基因在水稻(Oryza sativa L.)遗传转化中的比较

筛选标记的有效选择 (筛选周期及筛选效率 )是影响作物基因转化成败的重要因素之一。该文在农杆菌介导水稻转化过程中 ,比较研究了两个标记基因 (hpt和bar基因 )对抗性愈伤组织产生时间及出愈率的影响。结果表明 :以hpt为筛选标记 ,抗性愈伤组织出现周期短 ,出愈率高达 2 0 %左右 ;而bar基因作为筛选标记时 ,抗性愈伤组织块出现较慢 ,出愈率仅 10 %左右。因此 ,在水稻的农杆菌转化中 ,仅作为筛选标记 。

反馈抑制不敏感邻氨基苯甲酸合成酶基因作为筛选标记基因用于大豆遗传转化研究(英文)

目前广泛采用的抗菌素或抗除草剂基因作为植物转化筛选标记基因可能带来转基因逃逸 ,因此寻找能够用于植物转化的来源于植物本身的筛选基因是解决这一问题的方法之一。通过从烟草中克隆的邻氨基苯甲酸合成酶基因 (ASA2 )作为筛选标记基因 ,并采用氨基酸的类似物 5 甲基色氨酸为筛选剂 ,进行了农杆菌介导的大豆成熟胚尖转化研究。Southern杂交结果表明ASA2基因成功整合到大豆基因组 ,Northern杂交也显示该基因在转化大豆叶片中表达。HPLC检测转化大豆叶片游离色氨酸的含量比野生型要高 5 9%～ 12 3%。PCR检测转化子 1代结果显示转化基因通过孟德尔规律稳定遗传。这些结果表明反馈抑制不敏感ASA2基因可以作为筛选标记基因用于大豆遗传转化。同时也证实来源于一种植物 (烟草 )编码的邻氨基苯甲酸α 亚基能够与另一种植物 (大豆 )编码该酶的 β 亚基结合形成具有完整活性的邻氨基苯甲酸合成酶。

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.

胡萝卜筛选标记选择及遗传转化

以常用的筛选剂潮霉素(Hyg)、除草剂Basta和卡那霉素(Kan)对胡萝卜愈伤组织进行敏感性试验,结果表明:胡萝卜愈伤组织对潮霉素和除草剂Basta非常敏感,筛选浓度分别以8mg/L和2mg/L较为合适;卡那霉素合适的筛选浓度应为150mg/L。以带bar基因的质粒载体对胡萝卜愈伤组织进行遗传转化,获得抗性愈伤组织和再生植株。

猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略，构建猪肌肉生长抑素（Myostatin，MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板，PCR扩增MSTN基因同源长、短臂；采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。

海带成熟孢子体对两种抗性筛选标记敏感性的研究

本研究以海带的成熟孢子体为外植体,采用固体培养基研究了海带成熟孢子体组织块对不同浓度壮观霉素和Basta的敏感性,以确定两种抗性筛选标记用于海带抗性筛选时的最适选择压力,为海带遗传转化奠定基础。结果表明:壮观霉素对海带成熟孢子体组织块的生长有抑制作用,200mg/L浓度对海带组织块筛选较适宜。Basta对海带成熟孢子体组织块生长的抑制和致死作用均较大,4mg/L是较适宜的筛选浓度。