不同月龄波尔山羊睾丸中精原干细胞活性及增殖特征研究

[目的]探究不同月龄波尔山羊睾丸中精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)在体外培养过程中的活性及增殖特征。[方法]分别采集1、3、5、58月龄的波尔山羊睾丸,通过组织学方法分别观察不同月龄波尔山羊睾丸的发育情况;分别收集不同月龄波尔山羊睾丸组织,利用三步酶消化法分离成单细胞,通过台盼蓝染色观察睾丸消化细胞总数和死亡细胞数;采用0.2%明胶富集差速贴壁法纯化SSCs并培养10 d,通过流式细胞术鉴定细胞悬液纯化前、纯化后及培养10 d后的Thy-1阳性(Thy-1+)细胞数;将纯化的SSCs培养10 d后,采用碱性磷酸酶染色鉴定SSCs克隆,分别计算不同月龄波尔山羊睾丸SSCs形成的克隆数和克隆面积。[结果]睾丸组织学观察发现1月龄波尔山羊曲细精管管腔生殖细胞数量最少,随着波尔山羊月龄的增加,逐渐发育出各级生殖细胞,但58月龄波尔山羊睾丸生精上皮明显退化。不同月龄波尔山羊睾丸组织经过三步酶消化,在纯化前及纯化后获得的睾丸细胞总数以5月龄波尔山羊最高,显著(P<0.05)高于1月龄波尔山羊;不同月龄波尔山羊纯化前及纯化后的睾丸细胞存活率之间均无显著(P>0.05)差异。在纯化前、纯化后的睾丸组织细胞以及培养10 d的纯化SSCs中,Thy-1+细胞数占睾丸细胞总数的比例均以1月龄波尔山羊最高,显著(P<0.05)高于其他月龄波尔山羊。培养10 d后,不同月龄波尔山羊睾丸来源的SSCs克隆均表现为碱性磷酸酶阳性,1月龄波尔山羊睾丸SSCs形成的平均克隆数显著(P<0.05)高于其他月龄波尔山羊,不同月龄波尔山羊的SSCs平均克隆面积无显著(P>0.05)差异。[结论]5月龄波尔山羊睾丸中细胞总数最多,1月龄波尔山羊睾丸中细胞总数最少,但SSCs活性和增殖效率最高。

精原干细胞体外分离培养的研究进展

精原干细胞是雄性动物睾丸内能够增殖分化产生精子的生殖干细胞,具有传递遗传信息的能力。鉴于其独特的生物学特性,精原干细胞在构建转基因动物和制备多潜能干细胞等领域具有十分重要的作用。精原干细胞的获取有多种分离纯化方法,在体外培养前通常结合使用两种或两种以上的方法来富集高纯度的精原干细胞。目前,关于精原干细胞体外长期培养的研究已在多种家畜上取得了一定进展。文章综述了精原干细胞的生物学特性及其微环境、精原干细胞富集的主要方法和体外培养的多种条件,为建立完善的家畜精原干细胞体外长期培养体系提供参考。

腹腔注射白消安对精原干细胞代谢特征的影响

目的通过构建白消安处理的小鼠模型,探讨其对小鼠睾丸精原干细胞(SSCs)代谢的影响。方法采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠,腹腔注射10 mg/kg白消安,于第0天、第5天和第10天取材,并通过免疫磁珠法分选出Thy1阳性细胞。随后对这些细胞进行了纯度鉴定和代谢组学分析。结果实验发现白消安处理能明显降低小鼠睾丸质量(P<0.05),并损伤睾丸的组织结构。基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)模型显示,处理0 d、5 d和10 d的样本组间存在显著的代谢差异。共筛选鉴定出89种差异代谢物,包括谷胱甘肽(GSH)、牛磺酸、精氨酸、必需氨基酸(EAAs)和不饱和脂肪酸(UFAs)等,其重要相关代谢途径涉及甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。结论白消安通过影响特定的代谢途径,产生明显的生殖毒性效应,导致小鼠睾丸质量下降和组织结构损伤。代谢组学分析其潜在的生殖毒性机制可能与脂质代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢通路有关。

黄牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是一类原始精原细胞,具有自我更新以维持自身数量相对稳定和定向分化成精母细胞的能力。随着黄牛精原干细胞研究的深入与完善,目前在黄牛精原干细胞领域的研究和应用已经取得了显著的进展。本文系统阐述了黄牛精原干细胞的分离纯化、体外培养、移植鉴定和永生化细胞系培养等方面的基本状况,同时探讨了我国黄牛精原干细胞研究领域中目前存在的问题,分析了黄牛精原干细胞的应用前景。

BMP4对山羊精原干细胞体外分化的影响

精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是精子发生的基础,对于繁衍后代具有非常重要的作用。目前大家畜SSCs的体外分化体系尚不明确,需要进一步进行深入研究。本研究探究了BMP4作为外源诱导分化因子对山羊精原干细胞体外分化的影响,采用两步酶消化法和2 h~2 h~12 h差速贴壁法提纯山羊SSCs,免疫荧光染色结果显示,纯化后的SSCs能够表达分子Marker CD90和PLZF。RT-PCR结果表明,相较于其它浓度和作用时间,基础培养液中单独添加50 ng/mL BMP4作用24 h能够达到调控SSCs分化的最佳效果(P<0.05)。

单细胞转录组测序技术在人精原干细胞研究中的应用

精原干细胞的自我更新、增殖与分化对于维持精子发生至关重要。然而,调控这一过程的分子机制尚未完全阐明。精原干细胞具有不同细胞亚型,其在精子发生过程中扮演不同角色。单细胞转录组测序技术提供有效的手段,揭示各精原细胞亚型及其转录组水平和生物学功能变化,为精原干细胞的分子机制研究提供新思路。

抑制猪支持细胞外泌体对精原干细胞自我更新及分化的影响

[目的]本文利用体外模型检测猪支持细胞分泌外泌体的能力及其对猪精原干细胞(porcine spermatogonial stem cells,pSSC)自我更新及分化状态的影响。[方法]通过两步酶消化法分离猪支持细胞和pSSC并建立猪支持细胞-pSSC体外共培养模型,抑制猪支持细胞外泌体的分泌,检测pSSC自我更新及分化指标,研究支持细胞外泌体对pSSC命运的影响。[结果]分离得到的支持细胞的Wilm肿瘤蛋白1(WT1)阳性率为(87.1±0.02)%,整合素β-1蛋白(ITGB1)阳性率为(94.2±0.01)%,分离得到pSSC的早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)阳性率为(80.6±0.02)%;通过Western blot分析、免疫荧光检测证实支持细胞外泌体的存在;证实20μmol·L^(-1)GW4869可以抑制外泌体分泌且不损害支持细胞;GW4869处理后的支持细胞与pSSC共培养发现试验组较对照组pSSC状态差异较为明显,且RT-PCR结果显示猪精原干细胞PLZF基因表达水平显著升高;肥大/干细胞生长因子受体基因(KIT)、胸腺细胞抗原1基因(THY1)、死盒解旋酶4基因(DDX4)表达水平显著降低;Western blot结果显示猪精原干细胞蛋白基因产物9.5(PGP9.5)蛋白表达水平升高,DDX4蛋白表达水平降低。[结论]体外培养时支持细胞分泌的外泌体对pSSC自我更新和分化均具有调控作用,暗示外泌体是支持细胞调控精原干细胞命运的一种重要方式,这为种公猪生殖力的改善提供了新思路。

动物精原干细胞体外培养研究进展

精原干细胞(SSCs)作为成体干细胞之一,可将遗传信息向子代传递,在雄性动物的精子发生过程中起到至关重要的作用。根据SSCs的生物学特征并通过有效的细胞分离手段将睾丸中的SSCs进行分离,进一步纯化并体外培养,才能更加深入地研究其相关机制。随着测序技术及基因编辑技术的发展和成熟,对于SSCs的研究手段和应用范围也在不断扩展。因此,文章主要对SSCs的生物学特征、鉴定、分离、纯化、体外培养以及与SSCs研究中联合使用的新技术进行了总结,以期为SSCs体外培养方法选择及其相关研究提供参考。

视黄酸信号通路在青鳉精原干细胞体外增殖与分化中的作用

为探究视黄酸(RA)在鱼类精原干细胞(SSC)增殖与分化中的作用,实验首先以三色荧光报告载体pGRY[延伸因子1α启动子驱动组蛋白H2B-绿色荧光融合蛋白、减数分裂联会复合体蛋白3(Scp3)启动子驱动嘌呤霉素红色荧光融合蛋白、精蛋白启动子驱动黄色荧光蛋白]转染青鳉精原干细胞系SG3,获得稳转细胞SG3-pGRY,然后分别在2D与3D培养条件下检测RA信号对其增殖与分化的影响。结果显示,稳转细胞SG3-pGRY的红色荧光可监测细胞内源性Scp3的表达,且细胞仍保持干性及分化潜能,表明其可用于监测细胞分化状态。在2D培养条件下,即在细胞培养板中待细胞生长密度约90%就进行传代培养,RA可显著抑制细胞增殖,其受体α、β、γ泛抑制剂BMS493可促进细胞增殖。第48小时,RA处理可下调细胞多能性相关基因pou5f3、klf4表达,上调减数分裂相关基因dazl表达,但对其他减数分裂相关基因如scp3表达无明显影响。第8天,处理组及对照组均未能观察到红色荧光,这与已有报道RA处理体外培养小鼠SSC可显著促进Scp3表达,并进入减数分裂I期偶线期的研究结果明显不同。在3D培养条件下,即用96孔球形低吸附微量培养板进行培养,48 h后细胞成球状体聚集生长,RA、BMS493处理组、对照组在48 h后均观察到明显红色荧光,减数分裂相关基因表达与2D相比显著上调。第8与第34天,RA处理组减数分裂相关基因表达均显著高于对照组,而BMS493处理组低于对照组。研究表明,RA信号可抑制SG3增殖,促进其分化,但不是诱导细胞发生减数分裂的关键分子。本研究不仅为鱼类SSC分化相关研究提供了良好研究模型,而且促进了对于RA信号在鱼类SSC增殖与分化中作用的深入认识。

高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立

目的建立高龄小鼠精原干细胞(SSC)体外长期培养体系。方法将5只8月龄昆明白小鼠用于本实验,组织形态学技术评估睾丸生精状态;优化睾丸体细胞去除流程、原代和传代中饲养层与生长因子组合条件,观察小鼠SSC克隆形成、增殖与传代;细胞生物学与分子生物学技术检测小鼠SSC克隆的干细胞特征。结果高龄小鼠睾丸精曲小管存在生精损害,PLZF^(POS)精原细胞数量增加;优化实验条件后富集的精原细胞数量增加,体外成功培养传代高龄小鼠SSC克隆6个月;高龄小鼠SSC克隆具有AKP活性并表达THY-1、PLZF、OCT-4等精原干细胞标记物。结论本研究通过优化消化、富集、原代和传代培养的多个环节,成功建立高龄小鼠SSC体外长期培养体系。

利用精原干细胞法生产转基因动物的研究进展

综述了利用精原干细胞生产转基因动物的发展历程、方法以及最新研究进展.重点从精原干细胞移植法和曲细精管微注射法两个方面,系统分析了利用精原干细胞生产转基因动物的优缺点,以及当前存在的问题.

长非编码RNA和环状RNA对精原干细胞自我更新调控的研究进展

精原干细胞(SSCs)是睾丸中的一组成体干细胞,是精子发生和维持男性生育能力的基础。SSCs能够自我更新以维持干细胞库的稳定性并分化产生成熟的精子。非编码RNA(ncRNAs)包括长非编码RNA(lncRNAs)和环状RNA(circRNAs),在雄性生殖细胞的基因表达和调控方面具有重要作用。NcRNAs在多种生物学过程中发挥重要作用,包括基因组印记、细胞分化、凋亡、干细胞多能性、X染色体失活和核转运。随着高通量测序技术的发展,大量的lncRNAs被发现与睾丸发育、维持精原干细胞的自我更新和分化、调节精母细胞减数分裂等多种生物学过程有关。本文就lncRNAs和circRNAs在调控精原干细胞自我更新方面的作用和机制进行综述,为男性不育症治疗的新分子靶点提供参考依据。

小鼠精原干细胞体外培养体系建立与功能鉴定

目的构建小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养体系,并对培养的SSCs进行功能鉴定。方法采用两步酶法消化小鼠睾丸组织制备单细胞悬液,CD90、CD49f免疫磁珠分选SSCs,采用Sertoli细胞共培养方法体外培养SSCs,并将培养的SSCs移植到受体小鼠曲细精管,定期观察移植后SSCs在受体小鼠曲细精管增殖分化情况。结果本次研究培养的SSCs在体外大量增殖,SSCs标记物检测显示,CD90、CD49f未分化SSCs标记物表达阳性率均>99%,而CD117分化SSCs标记物表达阳性率<1%,SSCs转染GFP慢病毒后移植到受体小鼠曲细精管内可以广泛定植并增殖分化,移植后12w在受体小鼠曲细精管内可见GFP+精子细胞。结论本研究中建立的小鼠SSCs体外培养体系,不仅能够促进SSCs大量增殖,同时保持了其未分化SSCs干细胞特性。

Fertil Steril:精原干细胞库-Klinefelter综合症患者生殖保护的新思路

Klinefelter综合征（Klinefelter syndrome,KS）又称XXY,47XXY综合征,简称克氏综合症,是一系列由于男性有两条或两条以上X染色体所导致的疾病。临床主要表现为睾丸发育不良、无精症（约占95%）,部分伴有典型体貌特征（体形瘦高、体毛稀少、男乳女化）及阅读/语言障碍。在全球范围内,发病率约1/600;在男性无精症患者中,发生率约11%。

精原干细胞的体外培养及其潜在治疗应用价值

精原干细胞(SSCs)能够自我更新,产生大量分化的生殖细胞并在出生以后形成精子,将遗传信息传递给下一代。因为所有雌性生殖干细胞在出生前已停止增殖,所以SSCs是成年哺乳动物唯一的生殖干细胞。将有生育能力的雄性供体睾丸细胞移植到不育症雄性睾丸细胞中,不育症的雄性可以重新进行精子发生和恢复生育能力。这项移植技术已经用来研究SSCs的生物学特性。研究发现,精原干细胞可以在小鼠的曲细精管进行复制,然后迁移,精原干细胞所需自我更新的生长因子保存在哺乳动物中。因此相信该培养技术很快会被应用于人类的精原干细胞中。本文讨论了现有的和潜在的运用移植技术和体外培养精原干细胞的方法。由于辅助的生殖技术能使精子细胞进入卵母细胞使之受精,所以在体外培养分化精原干细胞使之成为成熟生殖细胞的技术,将会促使人的临床精原干细胞的应用得到长足发展。

精原干细胞的生命历程

精原干细胞是动物体内的一种成体干细胞,在睾丸微环境中可以像胚胎干细胞一样具有增殖、分化潜能。近年来借助于各种细胞学技术,人们对精原干细胞在不同睾丸微环境中的分化和发育状况进行了深入研究,睾丸内不同种类细胞间的相互作用以及特定微环境对干细胞转分化的影响,已成为本领域的热点核心内容。将从精原干细胞生命历程的角度讨论该过程中所取得的研究成果和存在的问题。

小鼠精原干细胞的形态结构及其细胞化学和免疫组化特性

应用光镜、电镜观察了 ７～８ ｄ 小鼠精原干细胞的形态结构特点；应用细胞化学、免疫组织化学方法研究了体外培养小鼠精原干细胞的细胞化学和免疫组织化学特性。结果显示，精原干细胞呈圆形，直径（９±１） μｍ ，核大，呈圆形或轻微卵圆形，胞质较少；核内常染色质占绝对优势，异染色质极少；胞质内核糖体、线粒体较丰富，其他细胞器不发达；精原干细胞 Ａ Ｋ Ｐ染色呈阳性或强阳性，胞质内脂滴很少或没有；精原干细胞表达特异的 ｃｋｉｔ 受体；体外培养的小鼠精原干细胞常呈不完全的胞质分裂，细胞间由细胞间桥相连而呈链状或团状的细胞群丛，细胞群常由偶数细胞组成。

枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响

背景:精原干细胞移植对不育具有潜在的临床应用价值,体外建立精原干细胞的培养系统获得数量较多的精原干细胞,仍是目前研究中亟待解决的问题。目的:观察枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响。方法:采用两步酶消化法获取出生4～6d雄性C57BL/6小鼠睾丸Sertoli细胞与精原干细胞,将精原干细胞接种在Sertoli细胞饲养层上,再加入枸杞多糖或联合细胞因子添加到细胞培养液中。1周后以流式细胞仪检测细胞周期及细胞活性率,并检测各组精原干细胞GFRa-1、Thy-1、c-kit的阳性率。结果与结论:单独加入枸杞多糖后精原干细胞数量明显增加,增殖明显,联合加入胶质细胞源性神经营养因子与白血病抑制因子精原干细胞增殖更加明显(P<0.05)。并发现体外培养1周后的精原干细胞仍保持其睾丸组织内的精原干细胞特征,大多仍维持在未分化状态。表明在枸杞多糖或枸杞多糖联合胶质细胞源性神经营养因子及白血病抑制因子作用下,可促进精原干细胞体外增殖。

以支持细胞为饲养层培养小鼠精原干细胞

为探索精原干细胞(Spermatogonialstemcells,SSCs)体外自增殖的条件以及SSCs体外快速扩增的方法,以6-8日龄昆明乳鼠为材料,分离小鼠睾丸细胞,采用Percoll梯度离心法富集SSCs;以经丝裂霉素C处理的Sertoli细胞作饲养层,以DMEM为基本培养基,加入5%胎牛血清和103u/ml的白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF),体外培养SSCs;运用免疫荧光技术,以SSCs特异性表面分子Thy1为标志,对原代培养20d和传代培养14d的细胞进行鉴定。该培养体系下,SSCs贴壁时间为6h-9h,48h后可见细胞分裂,迅速增殖出现在接种12d以后。接种后第20d形成数十至上百个细胞的细胞团,细胞总数比接种时增加了45-245倍,100倍显微镜下观察可见,单位视野内细胞团数为26±4个。传代后细胞增殖较快。原代培养20d和传代培养14d的细胞均为Thy1阳性;而传代20d后,细胞周缘不整,有伪足出现,呈现出死亡迹象。该培养条比较适合SSCs短期快速增殖。

几种因素对培养小鼠精原干细胞的影响

探讨了小鼠胚胎成纤维细胞饲养层及干细胞因子 ( SCF)、白血病抑制因子 ( LIF)、碱性成纤维细胞生长因子 ( b FGF)等对体外培养小鼠精原干细胞的作用。结果显示 ,在饲养层上 ,精原干细胞贴壁时间缩至 8～1 2 h,饲养层具有促进其分裂增殖的作用 ;培养液中加入不同浓度的 SCF、LIF及 b FGF,可延长精原干细胞在体外的存活时间 ,其中加入 30μg/L SCF后 ,其体外存活时间与对照组相比差异显著 ( P <0 .0 5 )。