重度特发性弱精子症患者精子鞭毛超微结构的研究(附22例报告)

目的:探讨重度特发性弱精子症患者精子鞭毛超微结构特点。方法:对22例重度特发性弱精子症患者的精子鞭毛结构进行透射电镜检查,观察其超微结构特点。结果:22例均存在鞭毛超微结构异常,6例表现为特征性的内外动力臂部分或完全缺失,符合原发性纤毛运动障碍;1例表现为纤维鞘过度增生、肥厚,组织结构紊乱,符合纤维鞘发育不良;15例表现为非特异性鞭毛结构异常,表现为微管结构的随机性、非均一性数量异常。结论:重度特发性弱精子症患者进行鞭毛超微结构检查具有重要意义,可区分先天性及后天获得性鞭毛结构异常,对后续治疗有指导价值。

强精片对弱精子症大鼠精子鞭毛结构蛋白的影响

目的:探讨强精片对弱精子症大鼠精子鞭毛结构蛋白表达量的影响。方法:选取100只雄性SD大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、强精片高、中、低剂量组5组各20只。采用奥硝唑灌胃造模,蛋白印记法测定睾丸组织中TCTE3、MDHC7表达,ELISA法测定血清TUBB浓度。结果:与空白组比较,模型组a、b、c级精子比例明显降低;与模型组比较,强精片高、中、低剂量组a,b,c级精子比例随强精片剂量增加而显著升高,差异有统计学意义;与模型组比较,强精片高剂量组MDHC7、TUBB表达差异有统计学意义,其余差异无统计学意义。随着强精片剂量增加,睾丸中MDHC7、TCTE3及血清TUBB表达量逐渐增加,差异无统计学意义。结论:强精片增加精子尾部鞭毛结构蛋白TUBB、DMHC7表达,进而增加精子活力。

CFAP65基因突变导致精子鞭毛多发形态异常的遗传学初步研究

目的:探寻精子鞭毛多发形态异常(MMAF)可能的致病基因。方法:通过对1例典型的MMAF患者进行全外显子组测序(WES),分析可能的致病基因;运用扫描电镜和透射电镜观察MMAF患者精液样本,明确其鞭毛超微结构特点;通过精子免疫荧光技术分析cilia and flagella-associated protein 65(CFAP65)在精子发生过程中的表达模式。结果:该例患者存在CFAP65基因的一个纯合致病性突变c.2675G>A(p.Trp892*);扫描电镜发现该患者精子具有典型的MMAF特征,即表现为无尾,折尾,卷尾,短尾或不规则尾巴;透射电镜发现患者精子鞭毛"9+2"结构缺失和紊乱:精子鞭毛纤维鞘组装异常,伴有中心微管缺失和动力蛋白臂缺失。细胞免疫荧光提示该CFAP65基因在小鼠各级生殖细胞均有表达。结论:CFAP65基因参与了精子鞭毛结构的组装,其突变可引起MMAF表型而导致男性不育。

精子鞭毛多发形态异常诊疗专家共识

畸形精子症是导致男性不育的主要原因之一,随着高通量测序等遗传学技术的发展,近些年特殊类型畸形精子症的研究日趋深入和完善,但其诊断与治疗亟需规范。鉴于此,中华医学会男科学分会组织本领域专家对精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)的精子形态学特点、基因诊断以及治疗方法等方面进行归纳总结,并结合我国的具体临床实践制定本共识,以供临床参考。

精子鞭毛轴丝结构相关基因异常与弱精子症

精子鞭毛轴丝是精子运动的主要动力来源,参与鞭毛组装和运动调控的基因变异可导致精子活力降低,从而引起弱精子症(asthenozoospermia,ASZ)。常见的弱精子症包括两大类:(1)精子鞭毛在光学显微镜下无明显畸形,(2)精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)。弱精子症主要由轴丝组分编码基因变异所致,在过去的十年里,在揭示致病基因方面取得了显著进展。在MMAF的遗传研究领域,中国和法国是两个涉及比较广的国家。通过系统文献检索和Meta分析中国和法国关于MMAF的基因变异研究,纳入1796名不育男性参与者,结果表明,在中国的弱精子症患者中,DNAH1基因的突变比例显著高于法国(OR=4.97,95%CI=[1.70;14.49],P<0.01)。而CFAP43、CFAP44、CFAP251等基因在两国间未显示显著性差异(P>0.05)。这一发现为理解弱精子症的遗传变异的多样性奠定了基础。

精子鞭毛多发形态异常患者KLHL10基因突变分析

目的 探寻精子鞭毛多发形态异常患者的致病基因。方法 通过全外显子组测序(WES)对患者样本进行检测,分析可能的致病基因;运用扫描电镜和透射电镜观察患者精子超微结构;通过定量聚合酶链反应(qPCR)分析精子中目的基因mRNA表达水平;通过PubMed、中国知识基础设施工程(CNKI)等数据库检索目的基因突变相关临床病例。结果 在本研究征集的患者中检测到一个KLHL10基因杂合突变:c.317C>T(p.Pro106Leu),透射电镜结果表明患者精子鞭毛结构缺失或紊乱,未能找见轴丝中典型“9+2”结构。qPCR结果提示患者精子KLHL10 mRNA表达水平降低,只有正常对照组的一半,而与KLHL10相互结合的泛素连接酶CUL3(Cullin-3)的mRNA表达量却较正常对照升高2.5倍。结论 本研究报道了精子鞭毛多发形态异常患者KLHL10基因C.317C>T突变,该突变位点首次报道可能通过单倍体剂量不足引起精子形态异常。

DNAH1基因突变引起精子鞭毛多发形态异常的不育患者辅助生殖助孕结局分析

目的探讨DNAH1基因突变引起的精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)不育患者行卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕后的临床结局。方法回顾性队列研究分析2018年2月至2020年1月期间在河南省人民医院生殖中心就诊的39例MMAF不育患者的临床资料和基因检测结果,12例由DNAH1突变引起的MMAF患者为DNAH1阳性组,27例未提示DNAH1突变的MMAF患者为DNAH1阴性组,选择同一时期男女双方年龄匹配进行ICSI助孕治疗的100例精子形态正常的男性不育症患者作为对照组,观察并分析3组不育夫妇进行辅助生殖助孕的治疗结局。结果39例MMAF患者均行全外显子组测序检测,其中12例患者检测到DNAH1基因突变,分别为10例复合杂合突变和2例纯合突变,另27例患者未检测到目前已知的引起MMAF的基因突变。3组患者夫妇均行ICSI助孕治疗,DNAH1阳性组、DNAH1阴性组和对照组在获卵数和MII卵子数上的差异均有统计学意义[(17.08±5.32)枚、(9.59±3.98)枚和(10.44±6.33)枚,P=0.001;(14.58±5.18)枚、(6.78±3.38)枚和(8.32±5.31)枚,P<0.001],在胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率和活产率上的差异均无统计学意义(均P>0.05)。12例由DNAH1突变引起的不育患者夫妇共接受12个取卵周期,形成第3天胚胎79枚,首次新鲜胚胎或复融胚胎移植共12次,获得10个亲生子代。结论对于由DNAH1基因突变引起的MMAF患者,ICSI助孕可以帮助其生育亲生子代,且有较高的临床妊娠率和活产率。

常染色体显性遗传2型多囊肾病基因参与精子尾部组装的作用研究

目的研究常染色体显性遗传2型多囊肾病基因(PKD2)在精子尾部组装过程中的作用。方法回顾分析1例携带PKD2基因突变的非梗阻性无精症(NOA)患者的临床资料,Sanger测序验证该基因突变,对睾丸组织进行HE和免疫荧光染色;通过对正常人精子涂片进行免疫荧光染色观察PKD2在精子的定位,利用人视网膜色素上皮(hRPE)细胞检测PKD2在纤毛发育过程中的定位。结果该NOA患者PKD2基因存在c.1571T>A(P.I524N)杂合突变,其精子细胞尾部发育缺陷;PKD2主要定位于精子鞭毛起始部,与参与精子尾部组装及发育的重要蛋白Ac-Tubulin及γ-Tubulin存在共定位,在hRPE细胞纤毛发育过程中PKD2主要定位于纤毛的基体。结论本研究报道了1例全新的PKD2杂合突变的NOA患者病例,结果提示PKD2可能参与精子尾部的起始组装,为进一步研究精子鞭毛组装的机制提供了基础,PKD2基因c.1571T>A(P.I524N)杂合突变可能是无精症诊疗的新靶点。

黄精赞育胶囊对弱精子症大鼠精子鞭毛超微结构的影响

目的探讨黄精赞育胶囊对弱精子症大鼠精子鞭毛超微结构的影响。方法采用雷公藤多甙制备大鼠弱精子症模型,通过透射电镜观察黄精赞育胶囊对精子尾部超微结构的影响。并采用生物发光法测定各组精子ATP含量。结果雷公藤多甙造模后,出现线粒体、外周致密纤维排列紊乱及缺失。黄精赞育胶囊不同剂量组治疗后上述损伤的细胞器均可得到不同程度的修复。黄精赞育组大、中剂量组治疗后精子ATP含量较模型组显著提高。结论黄精赞育胶囊提高精子运动能力与其修复损伤的线粒体及外周致密纤维有关。

精子鞭毛多发形态异常的形态特征与表型分析

目的分析鞭毛多发形态异常（MMAF）患者精子的形态学特点，对其共同特征和表型进行分析。方法对28例表现为鞭毛多发形态异常的患者进行精液分析，光镜下初步形态分析，并通过扫描电镜和透射电镜进一步明确其超微结构特点，对其中一例睾丸组织进行组织病理分析。结果28例患者中仅13例（46．4％）患者检测到活动精子，其中12例精子活动率〈10％，精子存活率9．0％-80．0％。光镜和扫描电镜下可见MMAF精子鞭毛缺失、短、卷曲、弯折和不规则宽度等多种畸形及其组合，透射电镜表现为精子鞭毛纤维鞘、线粒体鞘等多种结构组装异常，中心微管缺失率41．4％-84．6％。动力蛋白臂缺失或存在，内、外侧动力蛋白臂均缺失的2例患者精液中无活动精子。射精中无活动精子和存在活动精子的两组患者间，各种鞭毛畸形构成比例的差异无统计学意义。结论MMAF就是精子鞭毛特异性异常的一种，光镜观察可以初步诊断，利用透射电镜观察可见以中心微管缺失为主要特征的整个鞭毛组装异常，进行明确分析。通过形态学的分析和研究，可以进行具体分型，为明确诊断提供有力依据。

5例精子鞭毛多发形态异常患者的非整倍体率与卵胞质内单精子注射的临床结局研究

目的评估精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)患者的精子非整倍体率与卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的临床结局关系。方法本研究在2017年1月至2018年6月期间共收集到来自郑州大学第二附属医院生殖中心的5例MMAF患者及10例精液参数正常的可育对照,通过巴氏染色和电子显微镜观察患者精子的形态及超微结构特征,采用荧光原位杂交技术(FISH)检测患者精子非整倍体率,最后对患者行ICSI助孕并观察其临床结局。结果患者精液中存在大量缺失的、短的、弯的、卷曲的和不规则的精子鞭毛,且鞭毛轴丝中央微管缺失;患者精子非整倍体率与正常相比差异无统计学意义(P>0.05);5对MMAF患者夫妇经过7个ICSI周期,均实现临床妊娠,其中活产3例,自然流产2例。结论MMAF患者精子鞭毛存在严重形态和超微结构异常,但患者较低的精子非整倍体率提示MMAF患者进行ICSI治疗具有较好的临床结局。

精子鞭毛多发形态异常的遗传学研究进展

精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)是一种遗传缺陷导致的畸形精子症。由于精子鞭毛缺失、短小、卷曲、弯折或不规则,以及不同畸形的组合,患者的精子活力低下,超微结构呈现以鞭毛轴丝中心微管缺失为主要特征的鞭毛组装异常,以及纤维鞘、外周致密纤维、线粒体鞘和动力蛋白臂等结构的缺陷。MMAF男性无法自然生育,需借助辅助生殖技术获得后代。由于MMAF分子病因的异质性,导致患者的辅助生殖结局不尽相同。本文总结了已发现的MMAF候选基因及其功能机制,为MMAF的临床诊疗和研究提供参考。

精子鞭毛多发形态异常的临床诊断

精子鞭毛多发性形态异常(MMAF)是一种严重的精子鞭毛畸形,典型MMAF患者精子尾部出现缺失、短、卷曲、弯折和不规则等,从而导致精子活力严重不足;透射电镜观察鞭毛横断面出现中心微管缺失、纤维鞘和外层致密纤维结构紊乱、动力蛋白臂缺失等超微结构缺陷。MMAF的遗传学病因尚未完全明确,是目前该疾病临床与转化研究所关注的重点。MMAF的临床诊断缺乏统一标准和流程。本综述重点讨论了其诊断策略,为临床MMAF的诊疗提供参考。

CFAP43或CFAP44基因突变致精子鞭毛多发形态异常患者的辅助生殖助孕结局研究

目的探讨CFAP43或CFAP44基因突变致精子鞭毛多发形态异常(multiple morphological abnormalities of the flagella,MMAF)患者行卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)助孕的临床结局。方法回顾性队列研究分析2014年9月至2020年7月期间于安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心就诊的121例MMAF男性不育症患者的临床资料和基因检测结果,纳入9例CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者,5例MMAF患者(P3、P5、P7、P8和P9)选择ICSI助孕治疗,统计并分析这5例患者ICSI助孕的临床结局。结果Sanger测序证实9例MMAF患者携带CFAP43或CFAP44基因双等位基因突变,其中3例患者的突变位点以往未曾报道,分别为CFAP43基因的新发纯合突变(c.4132delC:p.Arg1378Glufs*10)和新发复合杂合突变(c.3938G>A:p.Arg1313Gln;c.4342G>A:p.Glu1448Lys)以及CFAP44基因的新发复合杂合突变(c.1718C>A:p.Pro573His;c.4075G>A:p.Glu1359Lys)。5例MMAF患者夫妇接受5个ICSI周期,已生育4个健康亲生子代。CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者组ICSI受精率为76.47%(39/51),5例患者中临床妊娠3例,活产3例。与DNAH1基因突变MMAF患者组和严重少弱精子症患者组相比,CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者ICSI助孕结局差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论CFAP43或CFAP44基因突变会导致精子严重的鞭毛畸形和运动能力下降,是MMAF的重要病因。ICSI技术可以有效地解决CFAP43或CFAP44基因突变MMAF患者的生育难题。

两例精子鞭毛多发形态异常男性不育症患者的DNAH1基因变异分析

目的对2例由严重弱精子症导致原发性男性不育患者进行临床和遗传学分析,明确其可能的致病原因。方法提取患者及父母外周血基因组DNA,采用全外显子组测序技术对患者进行基因变异分析,并对疑似致病变异进行Sanger测序验证和致病性分析。结果全外显子测序显示例1 DNAH1基因存在c.2016T>G(p.Y672X)和c.6017T>G(p.V2006G)复合杂合变异;例2 DNAH1基因存在c.2610G>A(p.W870X)纯合变异,分别遗传自父亲和母亲。按照美国医学遗传学会与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,DNAH1基因c.2016T>G(p.Y672X)和c.2610G>A(p.W870X)变异均为致病(PVS1+PM2+PM3+PP3)。结论2例患者可能均为DNAH1基因变异导致的精子鞭毛多发形态异常,进而引起原发性男性不育。

特殊类型畸精子症行卵细胞胞质内单精子注射的治疗结局分析

目的:特殊类型畸精子症是男性不育中罕见病和单基因遗传疾病,本文探讨其卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)的治疗结局。方法:回顾性分析2011年1月至2021年1月于江苏省人民医院生殖医学中心实施ICSI治疗的特殊类型畸精子症患者,根据精子形态分为三组(圆头精子症、无头精子症和精子鞭毛多发形态异常),三组患者基因检测均发现致病或可能致病的基因突变。比较三组患者间的临床和实验室数据(年龄、BMI、精子参数、成熟卵子数、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率、活产率和自然流产率)差异。结果:三组共34对患者夫妇,三组患者间年龄,BMI,MII卵子数差别无统计学意义(P>0.05),圆头精子症的精子浓度和精子活力显著高于其他两组(P<0.01),圆头精子症组的受精率显著低于其他两组(P<0.01)。三组共34个取卵周期,其中4个取卵周期未形成可移植胚胎,形成可移植胚胎的30个取卵周期在第一个胚胎移植周期中获得22例临床妊娠,最终活产20例,自然流产2例。无头精子症和精子鞭毛多发形态异常两组的临床妊娠率和活产率显著高于圆头精子症组(P<0.01),三组间自然流产率没有统计学差异(P>0.05)。结论:圆头精子症患者实施人工卵母细胞激活依然有部分患者完全不受精或受精率低下。精子鞭毛多发形态异常和无头精子症患者可以通过ICSI取得相对较好的妊娠结局。

Tektins基因与雄性动物生殖功能

Tektins是一个纤毛和鞭毛轴丝中与微管相关的蛋白家族,影响精子鞭毛的运动性,与雄性动物生殖密切关联。论文简要介绍了精子鞭毛的超微结构和运动方式以及Tektins家族成员在雄性动物生殖方面的生物学功能。

SPEF2基因可变剪切体和功能性SNP鉴定及其与公牛精液性状的相关性研究

为研究牛精子鞭毛2(SPEF2)基因在中国荷斯坦公牛各组织中的表达调控机制及其与精液品质的相关性,利用RTPCR和克隆测序技术分析SPEF2基因的可变剪切体,同时利用PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism)技术对中国荷斯坦公牛群体进行基因型检测分析。结果表明:鉴定到1个新转录本,命名为SPEF2-splice variant(SPEF2-SV),此转录本是从外显子2到外显子5之间缺失459 bp的新序列,预测编码1个含有1 618个氨基酸的蛋白。SPEF2基因的参考转录本在睾丸中高表达,而SPEF2-SV呈现低表达。在SPEF2基因第1内含子(邻近剪切位点附近140 bp)筛选到1个单核苷酸多态(SNP)突变位点(g.11043C>T),经ESEfinder 3.0软件预测发现该SNP改变了剪切因子结合蛋白SC35与靶序列的结合,它可能是产生异常转录本的重要原因。此SNP位点与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性分析结果表明,其与射精量、精子密度和精子活力无显著相关,而与精子畸形率显著相关(P<0.05),其中等位基因对精子畸形的加性效应、显性和替代效应分别是-1.24%、-2.99%、-0.76%。结论:SPEF2基因表达受可变剪切机制的调控,而且其g.11043C>T突变位点可作为中国荷斯坦公牛精液品质选择的潜在功能性分子标记。

鼠Fscb/Cabyr双基因靶向敲除动物模型的建立和鉴定

目的利用CRISPR/Cas9系统构建鼠Fscb/Cabyr双基因靶向敲除小鼠模型,为研究鼠FSCB和CABYR蛋白复合物在精子鞭毛运动和获能中作用奠定基础。方法根据Cabyr基因全长序列,设计CRISPR/Cas9作用靶点,合成4条单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),克隆入pUC57-T7-gRNA表达载体,获得sgRNA表达质粒。sgRNA和Cas9 mRNA体外转录后,将Cas9 mRNA和sgRNA以适当比例混合并注入C57BL/6J小鼠受精卵中,获得Cabyr基因敲除的初建鼠(F0)。PCR鉴定后,选取两只嵌合体雌鼠与背景鼠回交繁育,获得靶基因敲除F1杂合鼠,将其与前期已经建立的Fscb杂合鼠交叉繁育,获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠。通过Western blot和免疫荧光检测双基因敲除后小鼠精子中FSCB/CABYR蛋白的表达情况。结果首先获得7只(3只雄鼠,4只雌鼠)删除Cabyr基因片段并产生移码的F1代杂合鼠,将F1代杂合雄鼠与雌鼠交配,获得Cabyr基因敲除纯合子小鼠。同时,以Fscb杂合小鼠与Cabyr杂合小鼠通过反复交叉繁育,最终获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠。Western blot检测证实双基因敲除纯合子雄鼠睾丸及精子内FSCB和CABYR蛋白表达均消失,免疫荧光检测显示精子主段内无FSCB、CABYR蛋白荧光表达。结论应用CRISPR/Cas9系统和杂合子交叉繁育成功获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠,为进一步研究FSCB和CABYR蛋白复合物的功能奠定了动物模型基础。

Cfap43基因缺陷小鼠组织病理学研究

目的观察Cfap43基因(cilia-and flagella-associated proteins 43)缺陷小鼠精子表型以及多个脏器组织病理学表现。方法使用CRISPR/Cas9技术生成Cfap43敲除小鼠,通过Sanger测序对繁殖后小鼠进行基因型鉴定。选取同一批次的8周龄Cfap43缺陷小鼠Cfap43(-/-)与野生型小鼠(wild type,WT)进行组织病理学检测。观察Cfap43缺陷对小鼠精子表型以及附睾、睾丸、肾、肝、脾、肺、脑、小肠病理结构与超微结构的影响。结果Sanger测序结果显示纯合突变小鼠有2 bp碱基的缺失,Cfap43基因缺陷小鼠附睾精子尾部出现短、粗、卷曲甚至尾部缺失等畸形。病理学观察可见Cfap43基因缺陷小鼠附睾管内成熟精子减少,睾丸生精小管内生精细胞排布紊乱;电镜可见尾部结构排列紊乱;通过透射电镜观察精子头部的变形和浓缩未见明显异常。其他实质脏器如肾、肝、脾、肺、脑、小肠的病理形态与超微结构未见明显改变。结论Cfap43基因缺陷小鼠精子主要表现为鞭毛出现多种畸形,但对其他实质脏器病理形态无明显影响。