生物统合加工嵌合纤维小体组装模块反应机制探究

为探究生物统合加工嵌合纤维小体中重组蛋白粘连模块与对接模块的分子相互作用及其对嵌合纤维小体组装效率的影响,采用酿酒酵母细胞分泌表达支架蛋白和酶分子催化模块,在胞外通过非变性蛋白凝胶电泳和等温滴定量热法测定分析二级支架蛋白、纤维素酶分别与一级支架蛋白结合时的相互作用反应。结果显示,分别连接二级支架蛋白和纤维素酶蛋白的对接模块与粘连模块的亲和力常数增大,亲和力减小,组装反应为焓变驱动的放热反应并产生氢键,证明这些蛋白分子间亲和力减小是导致二级支架蛋白与一级支架蛋白组装效率较低的主要影响因素。

纤维小体研究进展

纤维小体可提高厌氧微生物降解纤维素的效率,对纤维素的降解有着至关重要的作用。阐述了纤维小体的脚手架蛋白与酶蛋白的组装模式的多样性及脚手架蛋白中粘连模块的多样性,为提高纤维素利用率提供了更加可靠的理论基础。

纤维小体结构及其功能的研究进展

纤维素作为地球上数量最大的可再生资源,因其难以降解,造成了以纤维素为主的生物资源的极大浪费。纤维小体(cellulosome)是厌氧生物产生的胞外多酶复合体,能够高效地降解纤维素,是开发利用纤维素的重要途径之一。目前,对纤维小体的研究主要集中在基因和基因组水平,而对纤维小体多酶复合体的结构和功能方面的研究相对缺乏。本文结合国内外对纤维小体最新的研究状况,综述了纤维小体多酶复合体的组装模式及其功能,并讨论了纤维小体用于生物质降解中存在的主要问题,以期为人工纤维小体的改造和纤维素资源的利用提供更多的理论基础。

典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展

以解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)和热纤梭菌(Clostridium thermocellum)为代表的产纤维小体梭菌可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化,是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌株。然而,这些产纤维小体梭菌的纤维素降解效率及乙醇产量尚不能满足工业化生产的要求,其遗传改造技术的不成熟严重制约了通过定向代谢工程改造提高生产性能的进程。针对这些典型的产纤维小体菌株,各国科学家近年来在基于二类内含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台建立方面取得了较大突破,并通过靶向代谢工程改造,显著提高纤维素乙醇的产量。笔者对这些前期研究工作以及国内外相关研究成果进行系统的总结,并对构建的遗传改造工具的应用前景进行展望。

自组装嵌合纤维小体酿酒酵母菌群的乙醇发酵研究

在可共代谢葡萄糖木糖的二倍体酿酒酵母Y6细胞表面,通过组成型强启动子（PGK）控制的a凝集素表面展示系统,构建一个可共代谢纤维素半纤维素的双支架纤维小体。通过免疫荧光、流式细胞术及酶催化活性的测定,证明纤维小体结构能正确组装并以活性形式固定在细胞表面。以纤维素和半纤维素为底物进行乙醇发酵实验,60 h时最大乙醇产量达1.98 g/L,乙醇产率为0.33 g/g,相当于理论值的65%。结果证明,表面展示嵌合纤维小体的酿酒酵母可实现共降解纤维素和半纤维素生产乙醇的目标。

细菌纤维小体的结构和功能

纤维小体(Cellulosome)是多种纤维素酶、半纤维素酶依靠锚定-粘附机制形成的一种多酶复合体结构,通过细胞粘附蛋白附着在细菌细胞壁上,分子量2.0(106~2.5(106 D,能高效彻底地降解天然纤维素材料.纤维小体的结构和功能是理解原核生物中蛋白与蛋白之间的相互作用和细菌对天然纤维素降解的重要模型.

嵌合纤维小体的空间结构与汽爆玉米秸秆酶解动力学特征研究

为探究嵌合纤维小体的空间结构对其酶解动力学性能的影响,通过胞外自组装,将纤维素酶分别锚定在不同支架蛋白上,从而构建出具有不同空间结构的人工纤维小体。对比分析嵌合纤维小体和游离酶的热稳定性差异,并以汽爆玉米秸秆为底物进行酶解动力学分析,获得米氏常数(K_(m))、最大反应速率(V_(max))和底物反馈抑制常数(K)。结果显示,纤维素酶与支架蛋白的结合能使其热敏感度降低且热稳定性提高。此外,二级支架蛋白嵌合纤维小体水解汽爆玉米秸秆的K_(m)=0.02 mg/m L、V_(max)=19 mg/(m L·min)、K=0.04 mg/L,说明二级支架蛋白使酶与底物的亲和力比简单结构嵌合纤维小体提高19.8%,进而证明嵌合纤维小体的复杂空间结构能优化其酶解动力学特征、提高纤维素酶的热稳定性。

嵌合纤维小体酵母菌群同步糖化发酵木质纤维素产乙醇的研究

为探究CBP酿酒酵母菌群表面展示嵌合纤维小体的协同作用,该文通过组装纤维素酶和半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的性能,构建由分别可表面展示纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafI,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶构成)和半纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafII,内切木聚糖酶和外切木糖苷酶构成)的重组酿酒酵母菌EBY100株组成的CBP菌群。通过蛋白质的SDS-PAGE、Western Bolt验证、酶活性测定、细胞表面定位和纤维小体组装效率分析,证明了融合蛋白能够以活性形式组装成2种形式的嵌合纤维小体。以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行同步糖化发酵产乙醇,96 h时最大乙醇产量达到0.673 g/L,消耗每克碳水化合物的乙醇产量0.255 g,相当于乙醇产率理论值的50.1%,协同因子为1.06。结果证明两株酵母细胞表面的不同类型嵌合纤维小体在水解木质纤维素过程中存在明显的协同促进作用。

纤维小体在合成生物学中的应用研究进展

纤维小体是一种高效降解木质纤维素的多酶复合体,主要由自然界中一些梭菌纲厌氧细菌合成及分泌。纤维小体具有模块化、多样化、自组装、协同高效、底物自适应等特征,与合成生物学的工程化策略非常吻合,近年来在生物技术特别是合成生物技术中得到了大量的应用。本文简要介绍了纤维小体的基本架构和高效作用机制,从不同的方面综述了纤维小体在合成生物学研究中的应用研究进展,包括人工纤维小体、底物通道与合成代谢通路构建、细胞表面展示与酶固定化、仿纤维小体设计与构建等。并对纤维小体当前研究的热点问题及其在合成生物学中的应用方向进行了展望,可以预见,基于纤维小体研究所获得的多种蛋白质元件以及建立的工程化策略将在合成生物学中发挥重要作用。

黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为获得纤维小体(cellulosome)的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列(GenBank登录号:JN109634.1)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。

厌氧分解纤维素细菌P4-3的产酶特性及其纤维小体组分的定位

中温厌氧纤维素分解菌P4-3可产生活性较高、热稳定性较强的纤维素酶。通过检测CMC酶活性,研究了培养时间、温度、培养基初始pH值、碳源和氮源对其产酶的影响。通过破壁处理,检测不同部位粗酶液中的CMC酶、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶活性,分析了其纤维小体中三种酶组分的分布和比例。结果显示,利用滤纸和纤维二糖作为底物达到最大酶活的时间分别为144 h和72 h;产酶最佳温度为40℃,pH值为7.5,纤维二糖为最佳碳源,酵母粉为最佳氮源。培养144 h,CMC酶、滤纸酶及β-葡萄糖苷酶在上清液、未破壁菌体悬浮液与破壁菌体悬浮液中的活性比分别为9∶1∶1,14∶4∶3和6∶3∶4。

内切纤维素酶E4参与纤维小体组装的研究

褐色高温单胞菌编码内切纤维素酶E4的催化域(CAD)DNA片段与丙酮丁醇梭菌编码对接蛋白的基因片段通过装配PCR方法,在大肠杆菌BL21(DE3)重组表达形成融合蛋白E4SD,然后在钙离子介导下与在大肠杆菌BL21(DE3)表达的来源于丙酮丁醇梭菌的含有纤维素结合单元和2个粘连蛋白的脚手架蛋白CipA互相作用,在体外组装成微纤维小体.结果显示,E4SD通过C-端的对接蛋白成功地与脚手架蛋白上的粘连蛋白互相作用,结合到脚手架蛋白上,且E4SD在微纤维小体中的羧甲基纤维素和微晶纤维素酶活性分别提高到游离状态下的130%与300%,提示非纤维小体酶系的纤维素酶,特别是远缘物种的具有优良酶特性的纤维素酶可以通过将其与脚手架蛋白同样种属的对接蛋白添加至末端,从而参与到丙酮丁醇梭菌的纤维小体中来,并与其他纤维素酶在脚手架蛋白的参与下协调作用,高效降解纤维素.

酿酒酵母人造纤维小体的研究进展

纤维素乙醇的统合生物加工过程(consolidated bioprocessing,CBP)是将(半)纤维素酶生产、纤维素水解和乙醇发酵过程组合,通过一种微生物完成的生物加工过程。CBP有利于降低生物转化过程的成本,受到研究者的普遍关注。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为传统的乙醇生产菌株,是极具潜力的CBP底盘细胞。纤维小体是某些厌氧微生物细胞表面由纤维素酶系与支架蛋白组成的大分子复合物,它能高效降解木质纤维,在酿酒酵母表面展示纤维小体已成为构建CBP细胞的研究热点。笔者综述了人造纤维小体在酿酒酵母细胞表面展示组装的研究进展,重点阐述了纤维小体各元件的设计和改造,并针对酿酒酵母分泌途径的改造,提出提高人造纤维小体分泌组装的可能性策略。

梭热杆菌纤维小体研究进展

梭热杆菌(Clostridium thermocellum)是一种嗜热厌氧细菌,通过分泌大量纤维素酶高效降解纤维素。根据作用纤维素的不同部位,梭热杆菌分泌的纤维素酶分为内切纤维素酶和外切纤维素酶。纤维小体是由支架蛋白、锚定元件、黏合蛋白、纤维素结合域和催化单位组成的复合体,其独特的结构,使得它可以比真菌纤维素酶更紧密地结合到纤维素表面,这个复合结构结合着多种催化单位,而此特殊的结构是梭热杆菌高效降解纤维素的必要条件。近年来,为更深入透彻地了解纤维小体的结构与功能进行了大量的研究工作,现对相关研究进展进行综述,并给出了未来可能的发展方向。

复合功能嵌合纤维小体空间结构优化及性能研究

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维小体进行纤维素同步糖化发酵产乙醇性能分析。结果表明嵌合纤维小体的酶活性在50℃下维持相对稳定状态达到120 h。其中ScafI-Ⅳ型支架蛋白嵌合纤维小体的V_(max)=0.147 mg/(mL·min),K_(m)=6.085 mg/mL及水解纤维素的还原糖产量均高于其他3种结构嵌合纤维小体。CBP酿酒酵母菌群以磷酸膨胀纤维素为底物进行同步糖化发酵产乙醇,ScafI-Ⅳ型结构嵌合纤维小体在96 h时乙醇产量达到1.12 g/L,产量为0.263 g/g,相当于乙醇产率理论值的51.50%。该结果证明通过优化支架蛋白结构可改善嵌合纤维小体的酶解性能,并对于人工设计纤维小体的研究具有一定的理论意义。

解纤维梭菌纤维小体的研究进展

解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)是一种非反刍类中温兼性厌氧细菌,能够分泌纤维小体多酶复合物,对结晶纤维素具有高效的降解能力。纤维小体均含有最多可以结合8个酶分子的脚手架蛋白CipC,CipC的N端是由碳水化合物结合模块、8个高度同源的粘连模块和2个亲水性的X2模块组成。纤维小体复合物的所有酶组分都含有一个特殊的对接蛋白模块,能够特异性地与CipC粘连蛋白相结合。编码CipC蛋白以及9个与纤维素降解相关酶类的基因都在一个高达26kb的大基因簇上。近年来,解纤维梭菌纤维小体的相关研究不断深入,已成功设计、构建人工纤维小体,并且成功在酿酒酵母中转入、表达纤维小体。通过对现有工程菌株的代谢网络改造,可以提高生物炼制的产率、降低生产成本。

解纤维梭菌纤维小体黏附域与锚定域相互作用的差异性

黏附域(cohesin)与锚定域(dockerin)的相互作用是纤维素酶复合体-纤维小体(cellulosome)组装的基础,该作用是自然界已知最强的相互作用力之一。为解析纤维小体的装配机制,本研究以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)纤维小体为研究对象,通过Pull-down和等温滴定量热(ITC)的方法,分析并比较不同簇的3个黏附域与7个锚定域之间的相互作用。结果表明,不同簇黏附域与锚定域的相互作用具有显著差异。其中,Coh1与Doc-0729的相互作用最强,Ka为108 M-1,Coh7与Doc-0729、0931作用力强,Ka为107 M-1,而Coh8与Doc-0931、1656、0752作用强,Ka也达到107 M-1。总之,Doc-0729、0931、1656与3个Coh的结合力均较高。本研究揭示了纤维小体黏附域与锚定域的组装具有偏爱性,这为人工纤维小体的设计和装配奠定了理论基础。

人工纤维小体骨架蛋白的分子设计与自组装

纤维小体是厌氧微生物分泌的能够高效降解木质纤维素的一种多酶复合体。其骨架蛋白质的大量重组合成是人工纤维小体构建的关键。为了构建全长的结构复杂的能招募大量酶亚基的骨架蛋白质,本研究对解纤维梭菌Ruminiclostridum cellulolyticum骨架蛋白CipC进行分子模块化设计,并分别与肽-蛋白质共价偶联系统SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher融合表达。然后分别通过非固定化和固定化组装策略对人工纤维小体骨架蛋白质进行了初步组装。结果显示,SpyTag和SpyCatcher、SnoopTag和SnoopCatcher之间自发形成稳定的共价异肽键,而且SpyTag和SnoopCatcher,SnoopTag和SpyCacther之间无交叉反应。最终成功组装出含有不同数量黏附域的骨架蛋白质,实现骨架蛋白链的延伸。本研究为构建结构更复杂、活性更高的人工纤维小体提供了新的设计思路并奠定了其技术基础。

纤维小体在燃料乙醇中的应用

纤维小体在木质纤维素的降解中起着重要作用。它不仅含有降解纤维素所需的各种纤维素酶系,而且组装成具有高效催化活性的多酶复合体形式。介绍了纤维小体基本结构与功能,重点概述了其在生物燃料乙醇中的应用并对纤维小体的研究提出了展望。

基于纤维小体展示技术的酿酒酵母纤维素乙醇研究进展

利用联合生物加工工艺生产第二代燃料乙醇(纤维素乙醇)是国内外的研究热点.前期的研究结果表明,酿酒酵母分泌或展示非复合型纤维素酶体系的应用效果并不理想,而复合型纤维素酶体系(即纤维小体)因对纤维素的降解能力比非复合型纤维素酶体系更强,所以其在酿酒酵母细胞表面的组装研究受到越来越多的关注.目前,单支架和双支架纤维小体在酵母细胞表面的完全自组装以及多细胞协同参与的非完全自组装均已实现.纤维小体展示型酿酒酵母已能直接利用结晶型纤维素发酵生产乙醇,但由于降解模块的结构缺陷,纤维素乙醇的产量仍然偏低.本文对纤维小体的酵母展示技术及其在纤维素乙醇发酵中的应用研究进行了论述,并对该领域的发展方向进行了展望.