抑制线粒体动力相关蛋白1通过PI3KAKT通路对糖尿病大鼠七氟醚后处理心肌细胞凋亡的影响

目的探究抑制线粒体动力相关蛋白1(Drp1)通过磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对糖尿病(DM)大鼠七氟醚(Sev)后处理心肌细胞凋亡的影响和机制。方法60只雄性SD大鼠分为假手术(Sham)、缺血/再灌注(I/R)、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1组,每组10只。通过腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,通过结扎左冠脉前降支建立心肌I/R模型,在缺血后吸入Sev或腹腔注射Drp1的抑制剂Mdivi-1。比较各组的梗死体积、心肌组织损伤情况、心肌细胞凋亡水平以及PI3K/AKT通路水平。结果I/R组的cTnI、CK-MB、凋亡指数水平显著高于Sham组,PI3K、AKT水平显著低于Sham组(P<0.05)。I/R+DM组的cTnI、CK-MB、凋亡指数水平显著高于I/R组,PI3K、AKT水平显著低于I/R组(P<0.05)。I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组的cTnI、CK-MB、凋亡指数水平显著低于I/R+DM组,PI3K、AKT水平显著高于I/R组(P<0.05)。I/R+DM+Sev+Mdivi-1组的cTnI、CK-MB、凋亡指数水平显著低于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组,PI3K、AKT水平显著高于I/R+DM+Sev组和I/R+DM+Mdivi-1组(P<0.05)。结论抑制Drp1可以通过促进PI3K/Akt通路抑制DM大鼠心肌I/R模型的心肌细胞凋亡,从而促进Sev对DM大鼠心肌I/R损伤的保护作用。

线粒体动力相关蛋白Drp1在小鼠脑出血后炎症反应中的作用

目的:探讨线粒体动力相关蛋白1(Drp1)在小鼠脑出血(ICH)后继发性炎症损伤中的作用及机制。方法:Western blot检测小鼠脑出血后Drp1和磷酸化Drp1(p-Drp1)的表达时间窗,并筛选出选择性Drp1抑制剂(Mdivi-1)在小鼠ICH模型中的最适药物浓度。将小鼠随机分为sham组、ICH组、ICH+溶剂对照组(ICH+Vehicle组)、ICH+Mdivi-1组。采用mNSS评估小鼠神经功能,干湿重法检测脑组织含水量,HE、Nissl染色观察小鼠脑组织形态学改变,MPO染色观察中性粒细胞浸润情况,Western blot检测炎症因子IL-6、TNF-α以及线粒体膜标志蛋白TOM20、COX4Ⅰ1蛋白表达水平。结果:与sham组相比,p-Drp1表达在ICH后12 h显著升高(P<0.01)。与ICH+Vehicle组相比,ICH+Mdivi-1组神经功能缺损评分升高(P<0.01),脑组织含水量增多(P<0.05),脑组织损伤程度加重,血肿周围炎症因子IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高(P<0.05),MPO阳性细胞数量明显增加,线粒体膜蛋白TOM20、COX4Ⅰ1的表达显著升高(P<0.01)。结论:抑制Drp1可抑制线粒体分裂并加重小鼠ICH后炎症损伤,Drp1可能减轻ICH后炎症反应。

脑卒中后认知功能障碍与炎症反应及线粒体动力相关蛋白的相关性

目的探讨脑卒中后认知功能障碍(PSCI)与炎症反应及线粒体动力相关蛋白(DRP1)的相关性。方法选取2020-05—2023-08邯郸市人民医院PSCI患者60例为研究对象,收集同期卒中后不伴认知功能障碍(PSNCI)患者100例作对照。收集并比较所有研究对象的基线资料及实验室指标[白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原(FIB)及线粒体动力相关蛋白(DRP1)]水平。采用Logistic回归法分析脑卒中后并发认知功能障碍的影响因素。绘制ROC曲线分析IL-6、CRP、FIB及DRP1预测PSCI的效能。结果认知功能障碍组IL-6、CRP、FIB水平均显著高于认知功能正常组,DRP1相对表达量显著低于认知功能正常组(P<0.05)。认知功能障碍组年龄≥70岁、合并疾病(高血压、糖尿病及高脂血症)、吸烟、饮酒、文盲、无体育锻炼及卒中后情绪障碍比重均大于认知功能正常组(P<0.05)。2组性别及体重指数(BMI)比较无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析显示,年龄≥70岁、高血压、糖尿病、吸烟、文盲,IL-6、CRP、FIB水平升高及DRP1水平降低是脑卒中并发认知功能障碍的独立危险因素(P<0.05)。IL-6、CRP、FIB及DRP1单独预测PSCI的AUC值分别为0.793(95%CI:0.724~0.861)、0.819(95%CI:0.745~0.893)、0.870(95%CI:0.816~0.924)及0.803(95%CI:0.733~0.873),诊断效能较好。四者联合预测PSCI的AUC值为0.975(95%CI:0.955~0.995),四者联合诊断预测PSCI的效能优于IL-6(Z=5.433,P<0.001)、CRP(Z=4.384,P<0.001)、FIB(Z=4.182,P<0.001)及DRP1(Z=5.050,P<0.001)单独诊断。结论IL-6、CRP、FIB及DRP1均与PSCI密切相关,是脑卒中后发生PSCI的独立影响因素,且能有效预测PSCI。

线粒体动力相关蛋白DRP1对肝癌细胞糖代谢的调控作用研究

目的探讨线粒体动力相关蛋白1(dynamic-related protein 1,DRP1)在肝癌细胞糖代谢重编程中的作用。方法(1)siRNA下调肝癌细胞SNU-739中DRP1表达后,检测对肝癌细胞葡萄糖摄取与乳酸产生的影响,以明确DRP1对肝癌细胞糖酵解的调控作用。(2)siRNA下调肝癌细胞SNU-739中DRP1表达后,检测对肝癌细胞氧耗速率与ATP产生的影响,以明确DRP1对肝癌细胞氧化磷酸化的调控作用。(3)siRNA下调肝癌细胞SNU-739中DRP1表达后,利用质谱检测对糖酵解与线粒体三羧酸循环代谢产物的影响。结果(1)下调DRP1可显著抑制肝癌SNU-739细胞的葡萄糖摄取(siCtrl:si-DRP1#1:si-DRP1#2=1.000±0.069:0.417±0.032:0.400±0.040;F=141.400,P<0.001)与乳酸产生(siCtrl:si-DRP1#1:si-DRP1#2=1.000±0.050:0.327±0.040:0.310±0.036;F=256.700,P<0.001)。(2)下调DRP1可激活肝癌SNU-739细胞的氧耗速率(siCtrl:si-DRP1#1:si-DRP1#2=1.000±0.069:1.623±0.081:1.591±0.046;F=81.720,P<0.001)与ATP产生(siCtrl:si-DRP1#1:si-DRP1#2=1.000±0.062:1.813±0.093:1.850±0.070;F=119.200,P<0.001)。(3)下调DRP1后,肝癌SNU-739细胞中糖酵解中间产物葡萄糖、丙酮酸与乳酸的水平均显著降低(均P<0.001),而三羧酸循环关键产物柠檬酸、延胡索酸与苹果酸的水平均显著升高(均P<0.001)。结论线粒体动力相关蛋白DRP1通过激活糖酵解并抑制氧化磷酸化而促进肝癌细胞的糖代谢重编程。

线粒体分裂相关蛋白高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生

目的:探讨肾小球线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、P-Drp1(Ser616)和线粒体分裂蛋白1(Fis1)表达与足细胞损伤及蛋白尿发生的关系。方法:建立阿霉素大鼠肾病模型,用免疫组化和western blot检测肾小球和肾皮质Drp1、P-Drp1(Ser616)及Fis1的表达,分析上述蛋白表达与蛋白尿及足细胞线粒体形态的相关性。在小鼠足细胞系MPC5过表达Drp1,分析对凋亡和线粒体形态的影响。结果:肾小球和肾皮质Drp1在阿霉素大鼠肾病模型4周和6周时表达增强,肾小球P-Drp1(Ser616)在6周时表达增强,肾小球Fis1在2周和6周时增强。肾小球和肾皮质Drp1、肾小球P-Drp1(Ser616)和Fis1表达与24h尿蛋白正相关。肾小球Drp1表达量与足细胞线粒体胞浆密度和线粒体细胞密度呈负相关。肾小球P-Drp1(Ser616)与足细胞线粒体最大长宽比呈负相关。肾小球Fis1与足细胞线粒体面积和周长呈负相关。过表达Drp1致小鼠足细胞凋亡显著增多,线粒体片段化。结论:肾小球Drp1、P-Drp1(Ser616)与Fis1高表达参与阿霉素大鼠肾病模型蛋白尿的发生,Drp1高表达致线粒体片段化和足细胞凋亡。

激酶锚定蛋白1抑制线粒体分裂减轻肾脏缺血再灌注损伤

目的:探讨激酶锚定蛋白1(AKAP1)在肾脏缺血再灌注损伤(IRI)中的作用及机制。方法:首先构建小鼠肾脏缺血再灌注模型,夹闭双侧肾动脉缺血28 min,再灌注24 h后采血并留取肾组织,检测血清肌酐、尿素氮、病理损伤及AKAP1表达情况,其次将小鼠肾小管上皮细胞培养至第2天进行干预,缺氧过程(H)将细胞置入1%O_(2)、5%CO_(2)、37℃三气培养箱内无糖无血清依次培养3 h,复氧(R)时更换含10%胎牛血清低糖培养基正常培养6 h。观察对照组和各缺复氧(H/R)组再复氧6 h时肾小管上细胞一般形态,最后通过转染过表达AKAP1的方式检测H/R各组ATP含量,线粒体膜电位以及线粒体Mito-Red染色情况。结果:AKAP1在肾脏缺血再灌注后表达下降(P<0.05);小鼠肾小管上皮细胞在H/R处理后出现AKAP1表达下降以及线粒体功能障碍(P<0.05);AKAP1通过线粒体动力相关蛋白1调控H/R诱导线粒体损伤(P<0.05)。结论:AKAP1可以通过抑制线粒体功能障碍减轻肾脏IRI。

DRP1调控线粒体稳态对人视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化的影响

目的探讨线粒体动力相关蛋白(DRP1)对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法构建H_(2)O_(2)干预ARPE-19细胞模型,将ARPE-19细胞分为3组,NG组:采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞6 h;H_(2)O_(2)组:先采用650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预细胞,此后培养方式及时间与NG组相同;H_(2)O_(2)+Mdivi-1组:先采用10μmol·L^(-1)Mdivi-1处理ARPE-19细胞2 h,再给予650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预,此后培养方式及时间与NG组相同。Western blot检测各组细胞p-DRP-1/DRP1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波型蛋白(Vimintin)及紧密连接蛋白(ZO-1)表达水平;线粒体红色荧光探针检测各组细胞线粒体形态;线粒体超氧化物红色荧光探针检测各组细胞线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1染色试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位;免疫荧光检测各组细胞中ZO-1表达水平。结果H_(2)O_(2)组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值高于NG组,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值低于H_(2)O_(2)组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞较H_(2)O_(2)组线粒体碎片化程度得到改善。H_(2)O_(2)组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)与NG组(1.00±0.17)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(2.15±0.18)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞红/绿荧光强度比值(0.16±0.12)与NG组(1.00±0.09)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(0.42±0.05)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞上皮样标志物表达下降,间质样标志物表达上升,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞上皮样标志物表达上升,间质样标志物表达下降。各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,H_(2)O_(2)组与NG组及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ZO-1免疫荧光染色实验显示,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H_(2)O_(2)组。结论DRP1可调控线粒体动态平衡,靶向DRP1可改善线粒体功能并抑制EMT进展,从而减轻H_(2)O_(2)诱导的RPE细胞功能障碍。

黄芪多糖通过调节Drp1介导的线粒体分裂改善感染性心肌病

目的从线粒体动力相关蛋白1(Dp1)介导线粒体分裂平衡角度,解读黄芪多糖(APS)对感染性心肌病小鼠的心功能保护作用及机制。方法按随机数字表法将18只成年雄性C57BL/6J小鼠分为对照组、脂多糖(LPS)组和LPS+APS组,每组6只。采用LPS诱导制备感染性:心肌病模型。各组均于术后6h经尾静脉取外周血,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清炎性因子水平;LPS处理后24 h行超声心动图检查心室功能,包括左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张期末内径(LVEDD)和左室收缩期末内径(LVESD);检查后即刻处死小鼠取心肌组织,采用蛋白质印迹试验(Western bloting)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、C3a、Drp1、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、视神经菱缩蛋白1(Opa1)蛋白表达。将购买的小鼠心房肌细胞株HL-1分为对照组、LPS组、LPS+APS组和LPS+APS+线粒体氧化磷酸化解偶联剂(FCCP)组。采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测分离线粒体及HL-1细胞内的ROS含量:采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位(MMP);采用三磷酸腺背(ATP)检测试剂盒检测HL-1细胞内ATP含量。结果与对照组比较.LPS组小鼠心脏的LVEF、LNFS、LVEDD和LVESD均明显降低.线粒体内ROS含量明显升高,MMP和ATP含量均明显下降;而APS可改善感染性心肌病小鼠的心功能指标[LVEF:0.571±0.026比0.287±0.045.LVFS(%):33.13±2.11比21.22±0.99.LVEDD(mm):3.74±0.10比2.77±0.05.LVESD(mm):2.74±0.09比1.99±0.04.均P<0.05].明显降低心肌内ROS含量[ROS(%):138.39±9.28比260.97±19.22.P<0.05].明显抑制MMP和ATP含量下降[MMP(红色1绿色荧光强度比值):0.91±0.05比0.55±0.01,ATP(%):94.22±10.11比58.74±5.39.均P<0.05),且APS可明显抑制LPS处理后的Drp1和Fis1蛋白过表达以及MIn2和Opal蛋白低表达[Drp1/GAPDH(%):126.33±11.70比218.75±19.44,Fis1/CAPDH(%):105.71±15.77比194.39±5.27,Mfn2/CAPDH(%):92.75±10.44比41.88±3.95,0pa1/CAPDH(%):98.14±3.71比55.94±7.30.均P<0.05]。故进一步采用HL-1细胞构建感染性心肌病模型,HL-1细胞经FCCP处理后可明显抑制APS的保护效应。结论APS通过抑制Drp1过表达,抑制线粒体的过度分裂,减轻感染性心肌细胞的氧化应激和线粒体损伤,最终改善心脏功能,该机制的发现可为感染性心肌病的治疗提供新的理论依据和临床参考。

VEGF对缺氧复氧小鼠海马神经元细胞线粒体凋亡的抑制作用

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)对缺氧复氧小鼠海马神经元细胞系HT22细胞凋亡与线粒体动力相关蛋白1(Drp1)表达情况的影响。方法取对数生长期的HT22细胞,随机分3组:正常对照组(Control)、缺氧复氧组(Model)、Model+VEGF组(Model+VEGF)。除Control组外,其余各组细胞在缺氧缺糖处理6h后,进行复氧复糖继续培养18h,Model+VEGF组在缺氧复氧结束后加入VEGF 164处理24h。倒置显微镜观察各组细胞形态,Hoechst33258染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western Blot检测细胞中Drp1的表达情况。结果Control组细胞呈两级或者多级,胞体明显,细胞更为短小与饱满,细胞交织成片连接在一起;Model组细胞皱缩,胞体变圆,细胞显微镜下观察细胞突触变长,细胞间连接减少;Model+VGEF组细胞形态与Model组相比有所缓解;与Control组相比,Model组细胞凋亡与Drp1蛋白表达量显著增加(P<0.05);与Model组相比,Model+VEGF组细胞凋亡率与Drp1蛋白表达量明显下降(P<0.05)。结论VEGF可能通过抑制细胞线粒体凋亡对缺氧复氧的HT22细胞起到保护作用。

急性肾缺血再灌注损伤模型小鼠线粒体去乙酰化酶3的表达

背景:对比剂肾病已经成为医院获得性急性肾损伤的主要原因之一,其本质是肾脏的急性缺血再灌注损伤,其中去乙酰化酶3在其中发挥的作用还不清楚。目的:探索不同肾脏缺血时间对去乙酰化酶3表达的影响及其与线粒体损伤相关指标的关系。方法:构建C57BL/6J小鼠急性肾脏缺血模型,给予不同的缺血时间(15,20,25,30 min),再灌注48 h。根据缺血时间,分为对照组、假手术组、缺血15,20,25,30 min再灌注组,每组8只。术后48 h,检测血清肌酐、尿素氮水平,TUNEL试剂盒检测肾组织细胞凋亡情况,荧光素酶发光法检测肾组织ATP水平,苏木精-伊红染色观察肾组织病理变化,透射电镜下观察线粒体变化,Western blot检测去乙酰化酶3和线粒体动力相关蛋白1、线粒体融合蛋白1的表达。结果与结论:①血清肌酐、尿素氮、组织病理评分及凋亡指数在各缺血组中逐渐升高;②肾组织线粒体结构损伤在各缺血组中逐渐加重,ATP含量总体下降;③正常对照组与假手术组及缺血15min再灌注组的去乙酰化酶3蛋白水平无差异;与缺血15min再灌注组比较,缺血20 min再灌注组的去乙酰化酶3蛋白水平升高(P<0.05),缺血25 min继续升高(P<0.05),缺血30 min表达最高(P<0.05);④与假手术组比较,线粒体融合蛋白1在缺血15-20 min升高(P<0.05);与缺血15 min再灌注组比较,线粒体融合蛋白1在缺血25 min和30 min进一步升高(P<0.05);⑤缺血15 min再灌注组的线粒体动力相关蛋白1水平达高峰,与缺血15 min再灌注组比较,缺血20 min再灌注组的线粒体动力相关蛋白1水平有所下降(P<0.05),缺血25 min再灌注组进一步下降(P<0.05);⑥相关性研究发现,ATP与去乙酰化酶3存在显著负相关(r=-0.77,P<0.05),去乙酰化酶3与线粒体动力相关蛋白1存在负向相关性(r=-0.52,P<0.05),去乙酰化酶3与线粒体融合蛋白1存在正向相关性(r=0.72,P<0.05);⑦结果表明,肾脏缺血再灌注损伤时,ATP水平下降会刺激肾组织线粒体去乙酰化酶3表达呈现时间依赖性增高,进而促进线粒体融合,抑制线粒体裂解,起到保护线粒体、维持能量代谢的作用,提示去乙酰化酶3可能是减轻肾脏缺血再灌注损伤的干预靶点。

双硫仑/铜复合物通过Drp1去磷酸化和线粒体转位抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡

目的研究双硫仑/铜复合物二乙基二硫代氨基甲酸铜[copper(Ⅱ)diethyldithiocarbamate,CuET]对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法用不同浓度(0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00μmol/L)的CuET处理,CuET(2.00μmol/L)作用不同时间(0、3、6、9、12、24 h)或Drp1线粒体转位的选择性抑制剂Mdivi-1(1.00μmol/L)预处理肝癌细胞HepG2、SMMC-7721后,MTT实验检测细胞存活率,软琼脂克隆形成实验确定集落形成,流式细胞术分析细胞凋亡,激光共聚焦检测Drp1线粒体转位,Western blot检测细胞凋亡的相关蛋白cleaved-Caspase 9、cleaved-Caspase 3、cleaved-PARP1、细胞色素C(cytochrome C,cyto C),以及线粒体分裂蛋白phospho-Drp1(S637)、phospho-Drp1(S616)和Drp1的表达。结果CuET对HepG2和SMMC-7721细胞增殖和集落形成的抑制作用呈剂量依赖性(P<0.01);对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡诱导作用也有明显的剂量和时间依赖性(P<0.01);Western blot检测结果显示,CuET可导致Caspase 3和Caspase 9的裂解激活,PARP的降解激活以及cyto C从线粒体向细胞质的释放。CuET处理可导致Drp1(S637)去磷酸化和Drp1线粒体转位。细胞经Mdivi-1预处理后可明显阻断CuET诱导的Drp1线粒体转位、Caspase 3的裂解/激活、cyto C的释放以及细胞凋亡。结论双硫仑/铜复合物通过Drp1去磷酸化和线粒体转位抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞发生凋亡。

滋肾活血方对血管性痴呆大鼠分裂与融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1的影响

目的观察滋肾活血方对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠海马组织线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)、线粒体动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、线粒体分裂蛋白1(fission mitochondrial 1,Fis1)表达的影响。方法选用雄性SD大鼠60只,随机均分为假手术组、模型组、滋肾活血高剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血低剂量组、西药组。除假手术组外,其余各组均采用改良2-VO法建立VD大鼠模型。每组大鼠按9 mL/(kg·d)剂量灌胃相应药物。模型组、假手术组给予蒸馏水,滋肾活血低剂量组、滋肾活血中剂量组、滋肾活血高剂量组予以滋肾活血方溶液[9.8、17.8、35.6 g/(kg·d)]灌胃,西药组以多奈哌齐溶液[150 mg/(kg·d)]灌胃。连续喂药2周后,采用水迷宫实验评估大鼠学习记忆功能;取海马组织,采用免疫组化法检测实验大鼠海马组织中的Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1蛋白表达量。结果与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期(escape latency,EL)延长(P<0.05),Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白的表达量降低(P<0.05)。与模型组对比,滋肾活血中、高剂量组大鼠EL缩短(P<0.05),Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白表达量升高(P<0.05)。与滋肾活血低剂量组比较,滋肾活血中、高剂量组大鼠EL缩短(P<0.05),Mfn1、Drp1蛋白表达量升高(P<0.05)。结论滋肾活血方可能通过调节细胞内线粒体分裂与融合,上调Mfn1、Mfn2、Drp1蛋白的表达,从而改善认知功能。

动力相关蛋白Drp1在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中变化的研究

目的研究动力相关蛋白1(Drp1)在羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中的变化。方法采用Western Blot方法检测Drp1在羊瘙痒因子139A感染的脑组织匀浆中的含量变化及其亚硝基化水平。采用组织免疫荧光方法检测Drp1在脑组织中的分布。结果在羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织匀浆中,Drp1总量略有降低。对感染不同时间点的动态分析结果显示Drp1含量呈逐渐降低趋势,终末期稍有回升。感染终末期脑组织中亚硝基化水平明显增高。组织免疫荧光显示正常和羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织中,Drp1与神经元细胞存在共定位现象。结论Drp1在小鼠中枢神经系统中主要分布于神经元细胞,在羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中,Drp1总量略有降低,另外亚硝基化水平明显增高,提示在羊瘙痒病感染的小鼠脑组织中,线粒体动力相关蛋白的表达量及翻译后修饰水平出现了变化,在感染过程中起着重要作用。

靶向抑制黑质网状部GABA能神经元的DRP1改善肝性脑病小鼠运动功能

目的:探讨黑质网状部(SNr)的GABA能神经元中线粒体分裂对急性肝性脑病(AHE)小鼠运动障碍的影响。方法:利用硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射制备AHE小鼠模型,通过苏木精-伊红(HE)染色观察AHE小鼠肝小叶的变化,利用生化检测试剂盒检测AHE小鼠血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和血氨的变化。接下来通过转棒疲劳实验、高架十字迷宫实验、旷场实验观察AHE小鼠运动功能。进一步利用透射电镜观察分析AHE小鼠SNr的线粒体面积、周长、圆率等形态学指标的变化,Western Blot观察AHE小鼠SNr的线粒体分裂融合相关分子的表达变化。接下来,利用重组腺相关病毒(AAV)靶向调控AHE小鼠SNr的线粒体动力相关蛋白1(DRP1)的表达,在荧光酶标仪上检测SNr的线粒体膜电位(MMP)、细胞的ATP和活性氧(ROS),并观察小鼠运动功能的变化。结果:较对照组,AHE小鼠运动功能明显降低,SNr的线粒体分裂明显增强,线粒体分裂相关蛋白表达显著升高;AHE小鼠SNr的MMP显著下降,细胞的ATP下降,ROS升高。靶向抑制AHE小鼠SNr的DRP1表达后,运动改善;进一步观察发现,AHE小鼠SNr的线粒体分裂被抑制后,MMP显著升高,细胞的ATP升高,ROS下降,证明线粒体功能明显改善。结论:靶向抑制AHE小鼠黑质网状部GABA能神经元的线粒体分裂,可以改善线粒体形态和功能,从而缓解其运动障碍。

下调Drp1对高糖条件下肾小管上皮细胞凋亡、氧化应激及炎症因子表达的影响

目的:探讨下调线粒体动力相关蛋白1(Drp1)对高糖条件下肾小管上皮细胞凋亡、氧化应激及炎症反应的影响。方法:肾小管上皮细胞HK-2分为正常对照组和高糖组(给予30.0 mmol/L葡萄糖),采用Real-time PCR和Western blot法检测细胞中Drp1的表达。另取HK-2细胞分为正常对照组、高糖组、Lv-NC+高糖组和Lv-si Drp1+高糖组,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中Caspase-3、炎性小体NOD样受体蛋白3(NLRP3)蛋白的表达;收集细胞培养液上清,用硫代巴比妥酸法检测MDA水平,黄嘌呤氧化法测定SOD活性,二硝基苯肼比色法测定LDH水平,ELISA法检测IL-1β水平。结果:与正常对照组比较,高糖组细胞中Drp1 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。与正常对照组比较,高糖组和Lv-NC+高糖组细胞凋亡率升高,Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,MDA、LDH分泌增加,SOD分泌减少,IL-1β分泌增加,细胞中NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.05);与高糖组和Lv-NC+高糖组比较,Lv-si Drp1+高糖组细胞凋亡率降低,Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低,MDA、LDH分泌减少,SOD分泌增加,细胞中NLRP3蛋白的表达水平降低,IL-1β分泌减少(P<0.05)。结论:下调Drp1可减少高糖条件下肾小管上皮细胞凋亡,减轻氧化应激反应和炎症反应。

番茄红素对SD大鼠在体心脏缺血再灌注损伤的影响及其作用机制

目的探讨番茄红素对SD大鼠在体心脏缺血再灌注(IR)损伤的影响及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、番茄红素组、IR损伤组、番茄红素+IR损伤组各15只,番茄红素组与番茄红素+IR损伤组术前15 d给予番茄红素,其他组给予生理盐水,1次/d。再灌注24 h后检测各组心肌梗死面积;再灌注3 h后检测炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6,血清心肌酶谱指标乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK),血清氧化应激损伤指标超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)变化水平,比较线粒体相关蛋白在mRNA与蛋白水平的表达。结果与IR损伤组比较,番茄红素+IR损伤组心肌梗死面积显著减少,CK、LDH、TNF-α、CRP、IL-6、MDA水平显著降低,SOD水平显著升高;线粒体动力相关蛋白(Drp)1、线粒体融合蛋白(Mfn)及视神经萎缩症蛋白(Opa)1 mRNA与蛋白水平显著增高(均P<0.05)。结论番茄红素对SD大鼠在体心脏IR损伤有较好的保护作用,其保护机制与抑制炎症反应、减少氧化应激、改善线粒体形态、提高线粒体代谢密切相关。

Drp1介导的线粒体裂变在肌萎缩侧索硬化中的研究进展

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是运动神经元病中最常见的类型,随着上下运动神经元的丢失病情不断恶化,尚无有效治疗方法。线粒体功能障碍是ALS的重要发病机制之一。线粒体是产生ATP的主要细胞器,以高度动态的形式存在,通过不断的裂变与融合维持线粒体的形态、质量和功能,保证细胞正常活动。线粒体动力相关蛋白1(Drp1)是驱动线粒体裂变的主要调节因子,其功能异常与ALS的发病机制密切相关。抑制Drp1导致的线粒体过度碎片化、减少线粒体损伤可能成为ALS防治的新靶点。本文作者对Drp1的结构及其介导的裂变功能在ALS中的研究进展进行综述。

不同浓度脂多糖对脓毒症急性肺损伤肺上皮细胞坏死性凋亡和线粒体自噬的影响

目的观察不同浓度脂多糖(lippopolysaccharide,LPS)对肺上皮细胞坏死性凋亡和线粒体动力学相关蛋白1(dynamin related protein 1,Drp1)依赖的线粒体自噬的影响,探讨LPS制作脓毒症急性肺损伤模型的合适浓度。方法对数生长期A549细胞分为对照组、5 mg/L LPS组、10 mg/L LPS组、25 mg/L LPS组、50 mg/L LPS组,5 mg/L LPS组、10 mg/L LPS组、25 mg/L LPS组、50 mg/L LPS组分别采用PBS稀释的5、10、25、50 mg/L LPS处理16 h,对照组给予等体积PBS培养16 h。采用Western blot法检测各组细胞坏死性凋亡标志蛋白p-RIP3、RIPK1、p-MLKL和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α以及线粒体自噬标志蛋白PINK1、LC3B、Drp1、p-Mfn2相对表达量,并采用JC-1线粒体探针检测线粒体膜电位。结果10、25、50 mg/L LPS组细胞p-RIP3、RIPK1、p-MLKL、TNF-α、PINK1、Drp1、LC3B蛋白相对表达量依次增高(P<0.05),且均高于5 mg/L LPS组和对照组(P<0.05)。10、25、50 mg/L LPS组p-Mfn2蛋白相对表达量(1.043±0.085、0.844±0.085、0.204±0.040)和细胞线粒体膜电位(7.323±0.331、6.429±0.456、4.661±0.456)依次降低(P<0.05),且均低于5 mg/L LPS组(1.288±0.035、9.013±0.648)和对照组(2.497±0.440、14.392±1.216)(P<0.05)。5 mg/L LPS组细胞p-RIP3、RIPK1、p-MLKL、TNF-α、PINK1、LC3B蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05),p-Mfn2蛋白相对表达量和细胞线粒体膜电位低于对照组(P<0.05),Drp1蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论10~50 mg/L LPS可诱导肺上皮细胞发生坏死性凋亡,可能与Drp1依赖的线粒体自噬有关;10~50 mg/L LPS可能是建立脓毒症急性肺损伤细胞模型的较合适浓度。

基于iTRAQ的蛋白质组学技术对Drp1基因过表达挽救帕金森病模型果蝇的机制研究

目的应用iTRAQ技术探讨线粒体动力相关蛋白1（Drp1）基因过表达挽救PD模型果蝇的蛋白质组学变化以及挽救效应的分子机制。方法将各果蝇品系分别杂交构建出不同实验果蝇：正常组、PD模型组（PINK1B9转基因疾病果蝇）和PD挽救组（Drp1基因过表达PD模型果蝇），并观察果蝇翅膀形态、运动能力及计算异翅率、飞行率。提取果蝇蛋白组分，以iTRAQ技术联用串联质谱分析蛋白质组的整体变化情况，并将各组果蝇蛋白鉴定结果分别两两比较获得差异蛋白，最后将鉴定得到的差异蛋白进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果PD挽救组的异翅率与PD模型组相比明显降低（2.60%±0.47% vs. 82.40%±12.47%），飞行率与PD模型组相比明显提高（89.70%±7.76% vs. 3.30%±1.69%），差异均有统计学意义（P〈0.05）。蛋白质组学分析结果共鉴定得到3630个蛋白，其中PD模型组与正常组间鉴定得到的差异蛋白共282个，主要是铁离子相关蛋白；PD挽救组与PD模型组间鉴定得到的差异蛋白共170个，主要是锌离子相关蛋白。共同差异蛋白的信息显示Drp1基因过表达后逆转了绝大多数PD模型中相对正常果蝇异常表达的蛋白，其中21%的蛋白具有金属离子结合功能，且主要是锌离子结合功能。结论金属离子代谢可能在PD发病及Drp1基因过表达挽救PD过程中有重要作用，尤其是锌离子代谢可能在挽救效应中起主要作用。

亨廷顿舞蹈症中Hsp60丢失诱发线粒体功能障碍(英)

亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease, HD)是一种典型的神经退行性疾病,其中纹状体神经元的线粒体障碍是导致其神经退行的重要原因。前期研究表明亨廷顿蛋白突变体(mutant huntingtin, mtHtt)抑制线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein response, UPRmt)导致线粒体碎片化,但其潜在分子机制尚不明确。本研究结果表明,UPRmt标志物热休克蛋白60(heat shock protein 60, Hsp60)缺失可导致纹状体细胞线粒体碎片化。采用慢病毒敲低纹状体细胞中的Hsp60,结果显示,线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)与线粒体结合增强、Drp1 616位丝氨酸磷酸化和Drp1寡聚体水平升高。突变型纹状体细胞中过表达Hsp60抑制了Drp1过度激活。此外,Hsp60下调诱导活性氧生成和线粒体膜电位丢失。以上结果提示,HD中Hsp60与线粒体功能调节密切相关。