广西麻鸡STMN2基因克隆、生物信息学及组织表达分析

为了探究Stathmin-like 2(STMN2)在广西麻鸡中的蛋白结构和组织表达水平,本研究克隆了广西麻鸡STMN2基因并进行生物信息和组织表达谱分析。通过克隆获得STMN2基因CDS序列全长,利用qRTPCR分析STMN2基因在不同组织中的表达水平。结果显示,STMN2基因编码区序列全长540bp,共编码179个氨基酸。生物信息学分析表明,广西麻鸡STMN2氨基酸序列与原鸡、雉鸡、绿头鸭、鸽、人、小鼠的同源性分别为99.3%、98.8%、96.1%、97.8%、85.7%、87.9%。进化树分析结果显示,STMN2基因在禽类和哺乳类之间存在明显的遗传距离,其中广西麻鸡与原鸡的亲缘关系最近,与雏鸡的亲缘关系较近,鸽和绿头鸭次之。STMN2蛋白的分子质量20.88 ku,等电点为8.72,是不具有跨膜结构和信号肽的不稳定亲水碱性蛋白。qRT-PCR结果显示,STMN2基因在脑中表达量最高,显著高于其他组织或器官。本实验结果为进一步研究鸡STMN2基因功能提供了理论参考。

广西麻鸡kpna3基因克隆、生物信息学及组织表达分析

为了探究广西麻鸡核转运蛋白α3(karyopherin subunit alpha 3, kpna3)的结构和组织表达谱,试验采集了6只120日龄广西麻鸡的大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、睾丸、肾脏、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、腹脂、背部皮脂组织,克隆了kpna3基因并进行生物信息学和组织表达谱分析。结果表明:kpna3基因全长1 572 bp,共编码523个氨基酸。kpna3基因序列与原鸡、雉鸡、绿头鸭、鸽、人和小鼠的相似性分别为99.6%、98.3%、95.9%、95.4%、88.1%和88.5%;与原鸡的亲缘关系最近,其次是雉鸡,然后依次绿头鸭和野鸽;kpna3蛋白分子质量为35.86 ku,等电点为9.43,为不稳定的亲水碱性蛋白,不含跨膜结构和信号肽。kpna3基因在广西麻鸡大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、睾丸、肾脏、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、腹脂、背部皮脂14个组织中均有表达,在肌胃中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。说明成功克隆广西麻鸡kpna3基因的编码区(coding sequence, CDS)序列,在肌胃组织中表达量高可能与基因功能有关。

水牛SERPINE2基因的克隆、生物信息学及组织表达分析

本试验对水牛SERPINE2基因进行生物信息学分析,探索其在水牛不同组织器官中的表达规律,旨在为研究SERPINE2在水牛生殖过程中的具体调控机制提供理论支持。利用PCR技术克隆水牛SERPINE2基因CDS区的全长序列,在线生物信息学分析程序对SERPINE2进行分析,实时荧光定量PCR技术检测SERPINE2 mRNA在水牛不同组织的表达水平。结果表明:SERPINE2基因CDS区长度为1191 bp,编码397个氨基酸,通过分析相似性结果,发现水牛和牛、绵羊、山羊的相似性为99.6%;系统进化树结果显示,遗传距离最近的是水牛和牛,绵羊次之。在组成SERPINE2蛋白的氨基酸中,缬氨酸含量较高,占氨基酸总数的9.6%。SERPINE2蛋白是一种不稳定的亲水蛋白,SERPINE2有一个信号肽,没有跨膜结构域。SERPINE2蛋白的二级结构中,α-螺旋结构的占比最高,为41.56%。多个器官检测出SERPINE2 mRNA的表达,其中在卵巢的表达量显著高于其他器官,说明SERPINE2基因可能与卵巢生长发育有重大联系。

牦牛UCP1基因生物学特性及组织表达分析

旨在克隆牦牛解偶联蛋白1(UCP1)基因序列,并对其进行生物信息学分析,进一步研究该基因在牦牛各组织的表达规律.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛UCP1基因全长序列,生物信息学分析牦牛CDS区,qPCR检测UCP1基因在牦牛不同组织中的表达模式.结果表明,UCP1基因全长为954 bp(GenBank No.MW345537),其中开放阅读框(Open reading frame,ORF)全长为942 bp,编码313个氨基酸.蛋白分子特性预测UCP1蛋白为不稳定疏水性蛋白,存在跨膜结构域以及多个磷酸化位点.二级结构和三级结构预测显示,UCP1蛋白由无规则卷曲、α螺旋和延伸链三者交替出现.牦牛UCP1基因的核苷酸和氨基酸序列与普通牛的相应序列相似度最高,同源性分别为97.63%和96.76%;与斑马鱼的核苷酸序列和氨基酸序列相似度最低,分别为62.58%和64.29%.组织表达分析发现UCP1在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背肌、半腱肌中均有表达,但在肾中的表达量最高,肾与其他组织之间差异显著(P<0.05).不同品种牦牛UCP1基因的差异表达分析发现,其在麦洼牦牛背最长肌、肝中的表达量均显著高于金川牦牛(P<0.05和P<0.0001).这些结果为丰富牦牛UCP1基因的功能研究提供了参考依据.

赤眼鳟myostatin基因的克隆与组织表达分析

以赤眼鳟(Squaliobarbus crriculus)肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE方法,获得其myostatin(肌肉生长抑制素)基因全长为2 214 bp的cDNA序列,其包含了1个含有1 128个核苷酸的开放性阅读框(ORF),共编码375个氨基酸。赤眼鳟与其他物种myostatin的特征性一致。其编码区序列与鲤鱼同源性最高,为96.99%,与其他鱼类的同源性为76%～81%,与哺乳类和鸟类的同源性较低,为63%左右。赤眼鳟Myostatin蛋白的氨基酸序列与其他物种同源性较高,尤其在C端生物活性区,高度的保守性反映了该基因受到了高度的进化限制以及功能的重要性。半定量RT-PCR分析表明,myostatin基因在除肝脏外的其他组织都有表达,在肌肉和脑中的表达量较高,此结果表明赤眼鳟myostatin基因除了对肌肉生长发育有调控作用以外,还可能在机体中发挥其他功能。

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平。方法应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Westernblot证实表达蛋白的特异性。应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析。结果RT-PCR扩增获得HBVD-NAPTP1基因片段,插入pET-32a(+)表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Westernblot证实了表达的重组蛋白的特异性。HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达。结论成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平。

尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

为了探究补体C9在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫中发挥的作用,本研究克隆并分析了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)。结果显示:OnC9的cDNA序列全长2 502 bp,包含1 761 bp的开放阅读框(ORF),编码586个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9与牙鲆(Paralichthys olivaceus)补体C9氨基酸相似性最高,达73.0%,与其他鱼类补体C9的相似性介于49.3%~71.4%之间。实时荧光定量PCR检测结果表明,OnC9基因在所检测的各个组织或器官中表达水平有明显差异,在肝脏中表达量最高,其次是肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃,在脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染鱼体后,肝脏、后肾等组织中OnC9表达量表现为在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动表达的规律。说明OnC9在无乳链球菌感染尼罗罗非鱼后的免疫应答中发挥作用。

鹌鹑VIPR-1的克隆、序列特征和组织表达分析

【目的】对鹌鹑血管活性肠肽1型受体(vasoacitve intestinal peptide type 1 receptor,VIPR-1)cDNA全长基因进行克隆及分析,为鹌鹑的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得鹌鹑了VIPR-1 cDNA全长序列;通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对;采用实时定量PCR方法检测了VIPR-1在8个组织中的表达。【结果】鹌鹑VIPR-1的cDNA全长2 427 bp,包含了1 341 bp的开放性阅读框,编码446个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的鹌鹑VIPR-1编码区序列与鸡该编码区序列存在41个碱基的差异,造成4个氨基酸残基的不同;VIPR-1氨基酸序列与鸡、火鸡、斑胸草雀的氨基酸的一致性分别为99.1%、92.2%、88%,与其它物种的一致性在60%—78%;各物种VIPR-1蛋白进化树符合物种进化规律;VIPR-1理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和β-转角构成;在N-端存在一个由22个氨基酸残基(MKSARLRVLLPLLGCLLSAASS)组成的信号肽,7个α-螺旋构成的跨膜域和C-端结构域,在跨膜域有胆固醇结合位点;在所检测的8个组织中VIPR-1 mRNA均有表达,在小肠中表达量最高。【结论】成功地克隆了鹌鹑VIPR-1 cDNA全长序列,该基因在小肠组织的表达高于其它组织,在跨膜域存在胆固醇结合位点。

家鸽Caveolin-1基因全长cDNA的克隆、序列和组织表达分析

窖蛋白(Caveolin)是一类构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白,由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-1基因是Caveolin基因家族的成员之一。该实验采用RT-PCR与RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术成功地克隆了家鸽Caveolin-1基因的全长cDNA。该cDNA全长2605bp,包含537bp的完整编码区,编码178个氨基酸;分析发现家鸽Caveolin-1基因编码区与牛、家犬、鸡、褐家鼠等核苷酸同源性为80.1%～93.4%,氨基酸同源性高达85.4%～97.2%;半定量RT-PCR分析表明该基因在家鸽各种组织广泛表达,脂肪中表达量最高,各种肌肉中表达量次之,肝脏中表达量最低。此结果说明家鸽Caveolin-1基因可能与脂肪、肌肉中的某些代谢途径有关。

尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体(NITR,Novel immune-type receptor)基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KX989509;命名为On-NITR),该基因c DNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为37.38k D,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示:On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。

长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析

利用RACE方法克隆到长春花中编码黄素单加氧酶的基因(YUCCA),YUCCA(YUC)是植物生长素吲哚乙酸(IAA)合成通路上的关键酶。长春花YUC(CrYUC,GeneBank登陆号KF827426)cDNA序列全长1 863bp,包括编码405个氨基酸的1 218bp开放阅读框、5’非编码区、3’非编码区和poly A尾巴;其相应的DNA中有3个内含子。生物信息学分析结果显示:预测CrYUC的分子量为45.3kDa,等电点为9.01;有16个磷酸化活性位点;与其他物种的YUC有较高相似度。初步表达分析发现:YUC在长春花的叶片、花、根及茎中均有表达,且茎及叶片中表达量高于花及根中表达量。

红笛鲷(Lutjanus sanguineus)C型凝集素基因的克隆与组织表达分析

根据已知的海水鱼类C型凝集素基因的核苷酸保守区序列设计一对简并引物,先后通过RT-PCR和RACE PCR法从红笛鲷脾脏中首次克隆获得红笛鲷C型凝集素(CTL)基因的c DNA全长(登录号:AGT37609)。该序列长828 bp,开放阅读框663 bp,编码220个氨基酸。氨基酸序列分析显示,红笛鲷CTL基因氨基酸序列与其他物种CTL的相似性在30%-68%之间。系统进化分析表明,红笛鲷C型凝集素与鳉鱼、条石鲷、斜带石斑鱼CTL蛋白亲缘关系最近,聚成一支。通过荧光定量PCR分析红笛鲷基因的组织差异表达,红笛鲷CTL基因在肝、脾以及皮肤中表达水平较高,其次是头肾、肾、胃、肠及肌肉,在心脏与脑中表达量较低。

松江鲈MRF4基因克隆与组织表达分析

MRF4(myf6或herculin)基因属于MyoD家族成员之一,为成肌细胞分化成肌管的重要调控因子.本实验以松江鲈(Trachidermus fasciatus)肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE的方法,获得1 049 bp全长cDNA序列,包含了1个含有720个核苷酸的开放性阅读框(ORF),共编码239个氨基酸.其编码区序列与石斑鱼同源性最高、为91.81%,其次是东方红鳍鲀、为83.40%,与哺乳类、鸟类的同源性在65%左右,与爪蟾同源性最低仅为59.65%.预测松江鲈MRF4蛋白具有保守的HLH结构域,bHLH结构域形成剪刀状α-螺旋二聚体.用荧光定量PCR方法检测发现,MRF4基因的mRNA在松江鲈6种组织中均有表达,但其在肌肉组织中表达量极显著高于其他组织,提示其在肌肉的生长发育过程中起着重要作用.

棘腹蛙TGF-α基因的克隆与组织表达分析

为了解棘腹蛙TGF-α基因信息和组织表达特性,采用RT-PCR克隆棘腹蛙TGF-α全长序列,发现棘腹蛙TGF-αc DNA全长1 021 bp,开放阅读框为486 bp,编码161个氨基酸,预测分子质量为17.28 k Da,其氨基酸序列与其他物种的相似性为65%~73%;利用实时荧光定量PCR方法对该基因的表达情况进行分析,发现在肝脏和胃脏有较高表达。本研究克隆了棘腹蛙TGF-α并对其组织分布进行了分析,为后期深入挖掘棘腹蛙TGF-α的生物学功能提供了参考。

鲤JAK2基因分子克隆及组织表达分析

采用同源克隆策略和RACE-PCR技术,克隆得到可能的鲤(Cyprinus carpio)两面神激酶2(JAK2)基因的c DNA全长序列,包括3 378 bp的开放阅读框,732 bp的5'-非编码区,529 bp的3'-非编码区,总长度达4 639bp。开放阅读框可编码1 125个氨基酸,推测分子质量和理论等电点分别为129.33 ku和6.99。同源性分析显示,克隆的鲤鱼基因与斑马鱼(Danio rerio)JAK2同源性最高,其氨基酸序列同一性和相似度分别达89%和95%。结构域预测表明,所编码氨基酸序列包含FERM、SH2及两个酪氨酸激酶结构域,这4个结构域也保守地存在于其他脊椎动物的JAK分子中。高级结构预测显示,鲤JAK2主要包括α-螺旋(α-helix)、β-折叠(β-sheet)和连接环(loop)等3类结构元件。脊椎动物JAK分子系统进化树显示,JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4类JAK分子分别聚类,鲤JAK2处于JAK2支系中,与所有其他的鱼类JAK2聚为一大支,并与两栖类和哺乳类组成的另一大支构成姊妹群,表明它们具有共同的祖先基因,为直系同源关系。实时荧光定量PCR检测结果表明,鲤JAK2在皮肤中表达量最高,其次是肠、血液和脑,而在肌肉、鳃、头肾、心、肝、脾中表达量较低;鲤JAK3在脾中表达量最高,在其他组织中表达量均很低,甚至未检出。

鲤TYK2基因的克隆鉴定及组织表达分析

两面神激酶(JAK,Janus kinase)是一类酪氨酸蛋白激酶(PTK,protein tyrosine kinase),迄今已发现有4个成员,即JAK1、JAK2、JAK3和TYK2(Tyrosine kinase 2),JAK分子具有7个独特的结构域,从C端到N端依次为JAK同源区1(JAK homology 1,JH1)-JH7[1]。细胞因子与相应受体结合后,JAK与受体偶联并发生酪氨酸磷酸化而激活,活化的JAK能催化受体上特定部位的酪氨酸残基磷酸化,形成信号转导和转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)等含Src同源区2(SH2,

牦牛CTGF基因克隆、蛋白功能及组织表达分析

为获得牦牛CTGF基因的CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,并研究该基因在肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌等组织中的mRNA表达水平。以类乌齐牦牛为研究对象,采取RT-PCR方法获得类乌齐牦牛CTGF基因CDS序列,荧光定量PCR(qPCR)方法检测该基因在其5个组织中的mRNA表达水平。结果显示:牦牛CTGF基因含2个CpG岛,开放阅读框长度为1050 bp(登录号:MT968972),可编码349个氨基酸,CTGF编码蛋白存在信号肽,为水溶性不稳定的表面蛋白,共存在21个磷酸化位点和7个糖基化位点,在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多,有3个完整的保守功能结构域。荧光定量结果显示,CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌组织中均有表达,且在肝脏中表达水平最高。旨在为CTGF基因在调控牦牛肌肉生长发育方面提供参考数据。

柑橘大实蝇气味结合蛋白基因BminOBP25的克隆、原核表达及组织表达分析

【目的】昆虫的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)与嗅觉识别密切相关,在触角感受器淋巴液内运输外界的脂溶性气味分子顺利到达嗅觉受体过程中起着关键的作用。本研究对柑橘大实蝇Bactrocera minax的气味结合蛋白基因进行了克隆和表达分析,旨在更好地了解气味结合蛋白在柑橘大实蝇嗅觉识别中的作用及为进一步研究柑橘大实蝇嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘大实蝇的气味结合蛋白基因,并进行生物信息学分析;构建重组表达载体p ET28a(+)-Bmin OBP25,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定重组表达蛋白;采用荧光定量PCR检测该基因在柑橘大实蝇成虫不同组织中的表达。【结果】克隆获得柑橘大实蝇气味结合蛋白基因的c DNA全长序列,命名为Bmin OBP25(Gen Bank登录号:MH181875)。测序结果表明,Bmin OBP25开放阅读框全长447 bp,编码148个氨基酸,预测分子量为17.5 k D,编码序列具有OBPs典型的6个保守半胱氨酸和6个α螺旋区域特征。在IPTG诱导下目标蛋白以6×His标签融合蛋白的形式在宿主菌中得到稳定表达。荧光定量PCR分析表明,Bmin OBP25 mRNA在成虫触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅和产卵器中均有表达,其中在触角、头(去除触角)、足和产卵器中表达量较高。【结论】Bmin OBP25在柑橘大实蝇成虫触角、头、足和产卵器中具有高转录活性,提示该基因在非嗅觉组织中可能也具有生理功能,特别是可能在昆虫的取食与产卵地选择过程中起重要作用,其功能还需深入研究。本研究实现了Bmin OBP25基因的原核表达,为深入研究Bmin OBP25基因的功能奠定基础。

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa^175aa)和CARP(65aa^102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。

大岩桐SsKN1基因的克隆及组织表达分析

以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。