Tim-3/Galectin-9与Th1/Th2相关因子在人细粒棘球蚴感染中的表达研究

目的探讨人细粒棘球蚴感染中Tim-3/Galectin-9与Thl/Th2的平衡关系及其与该疾病发生、发展的关系。方法用实时荧光定量PCR法分别检测30例慢性细粒棘球蚴感染者和30例健康体检人群外周血中Tim-3、Galectin-9、T-bet和GATA-3mRNA的表达,同时用酶联免疫吸附(ELISA)法检测慢性细粒棘球蚴感染者和健康对照者血清中可溶性Tim-3和Galectin-9及IFN-γ、IL-12和IL-4的水平。结果 (1)实时荧光定量PCR检测结果显示:与健康对照组相比,感染组Tim-3和Galectin-9mRNA水平显著升高,T-bet mRNA水平显著降低,GATA-3mRNA水平显著升高。(2)ELISA检测结果显示:与健康对照组相比,感染组血清中可溶性Tim-3和Galectin-9水平显著升高,IFN-γ和IL-12水平显著下降,IL-4水平显著升高。Tim-3与Galectin-9呈正相关(P=0.000,r=0.776);Tim-3与T-bet呈负相关(P=0.000,r=-0.645);Tim-3与GATA-3呈正相关(P=0.000,r=-0.752)。结论 Tim-3/Galectin-9在人细粒棘球蚴持续性感染中发挥一定的作用,Tim-3/Galectin-9可能通过影响Th1/Th2相关的转录因子T-bet/GATA-3和细胞因子IL-12、IFN-γ和IL-4的水平变化,促进Th1/Th2细胞失衡现象的发生,从而促进感染的持续性发展。

细粒棘球蚴感染者中Tim-3^+CD4^+CD25^+Treg细胞及相关因子的表达

目的通过检测细粒棘球蚴感染者外周血中Tim-3^+CD4^+CD25^+Treg细胞及相关因子的表达水平,探讨细粒棘球蚴感染者中Tim-3与CD4+CD25+Treg细胞的关系及Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞对该疾病持续性发展的作用。方法选取30例细粒棘球蚴感染者和30例健康对照人群,用流式细胞术检测感染组和对照组外周血中Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞的比例变化;实时荧光定量PCR法分别检测感染组和对照组外周血单个核细胞中Tim-3和Foxp3 mRNA的表达;ELISA法检测感染组和对照组血清中IL-10和TGF-β的水平;Pearson相关法分析感染者外周血中Tim-3 mRNA的表达与Foxp3 mRNA的相关性以及Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞与IL-10和TGF-β的相关性。结果与对照组相比,细粒棘球蚴感染组外周血中Tim-3^+CD4^+CD25+Treg细胞的比例均显著升高(P<0.001);外周血单个核细胞中Tim-3和Foxp3 mRNA水平显著升高(P<0.001);血清中IL-10(P<0.001)和TGF-β(P=0.046)水平显著升高;细粒棘球蚴患者外周血Tim-3 mRNA与Foxp3 mRNA表达水平呈正相关;Tim-3+CD4+CD25+Treg细胞与IL-10和TGF-β的水平均正相关。结论细粒棘球蚴感染者中Tim-3在CD4+CD25+Treg细胞上的过表达可能会促进CD4+CD25+Treg细胞的产生及其抑制功能的发挥,从而促使感染的持续性发展。

细粒棘球蚴感染对小鼠肝纤维化及炎症因子水平的影响

目的:研究细粒棘球蚴感染对小鼠肝纤维化及炎症因子水平的影响。方法:将20只小鼠随机分为对照组和感染组(每组10只),感染组小鼠腹腔注射200 m L细粒棘球蚴原头节液,感染16周,对照组不作处理。比较两组血清中肝功能指标谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)及纤维化指标层黏连蛋白(LN)、透明质酸酶(HA)水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察肝组织形态学特征;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测肝组织中炎症因子白细胞介素(IL)-17A、IL-6、γ干扰素(IFN-γ)、人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA相对表达量。结果:感染组血清GOT、GPT、LN、HA水平显著高于对照组(P<0.05)。HE染色结果显示,感染组小鼠肝组织中汇管区有大量纤维组织增生。感染组小鼠肝组织中IL-17A、IL-6、IFN-γ、MCP-1和TNF-αm RNA相对表达量均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。结论:细粒棘球蚴感染可导致小鼠肝纤维化的发生,感染期间炎症因子表达水平增高。

重组抗原p29免疫保护小鼠细粒棘球蚴感染的差异长链非编码RNA的筛选研究

目的研究在筛选重组抗原p29诱导的免疫保护下细粒棘球蚴感染宿主后长链非编码RNA(lncRNA)差异分子的意义。方法将45只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、感染组和p29免疫+感染组。p29免疫+感染组小鼠重组抗原p29免疫3次,末次免疫7周后,采用细粒棘球蚴原头蚴腹腔感染小鼠(包括感染组、p29+感染组);感染24周后,采集小鼠血液,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMCs)。经Trizol提取总RNA后,采用Magnetic Core试剂盒构建lncRNA文库,通过HiSeq 2 000高通量测序与生物信息学方法筛选差异表达的lncRNA。最后,采用qRT-PCR验证候选lncRNA分子。结果高通量测序及生物信息学分析结果表明,与空白对照组相比,感染组小鼠PBMCs中有14个lncRNA显著差异分子(P<0.05);与感染组相比,p29+感染组外周血PBMCs细胞中有30个差异表达的lncRNA(P<0.05);进一步经qRT-PCR验证,确定XLOC-012763、INTE-015204与INTE-028446是p29+感染组的候选差异lncRNA。结论此研究筛选出p29免疫保护细粒棘球蚴感染小鼠PBMCs中的3个lncRNA差异分子,丰富了p29免疫保护理论机制,为其后续作为疫苗应用开发奠定了基础。

细粒棘球蚴感染小鼠肝脏模型的构建

目的通过小鼠肝被膜下注射细粒棘球蚴头节,构建细粒棘球蚴病的动物模型。方法从感染细粒棘球蚴的羊肝上提取细粒棘球蚴头节,体外用细胞培养基培养3~5 d,通过伊红染色检测其活性。将小鼠用5%水合氯醛麻醉,然后固定在手术操作台上,腹部皮肤消毒后,用消毒后的剪刀剪开皮肤。提取活性大于90%头节,用1 m L注射器注射到C57小鼠(6~8周龄,体重18~22g)的肝被膜下,然后缝合皮肤。分别在30、60、90、120、150 d提取小鼠的肝脏,将肝脏组织固定后,切片,HE染色观察炎症的基本病理变化,天狼猩红染色观察胶原纤维在病灶组织的增生情况。结果造模60只小鼠,成功率达95%。病理切片观察到30 d肝脏组织出现大量淋巴细胞的浸润和疏松的胶原纤维增生,随着感染时间的延长,淋巴细胞浸润减少,多核巨细胞和上皮样细胞增多,胶原纤维增多并且致密化。结论本实验构建的动物模型可用于构建细粒棘球蚴病的动物模型,为研究细粒棘球蚴病的治疗奠定基础。

细粒棘球蚴感染绵羊诱发过敏性休克期间电解质及血气的动态变化

目的 以细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,EG)感染绵羊并诱发过敏性休克动物模型为基础,观察休克期间电解质、血气的动态变化趋势,为其防治提供理论依据。方法 人工感染EG绵羊15只,用EG囊液粗制抗原攻击发敏复制过敏性休克动物模型,分别于抗原攻击前后各时点,经右颈内动脉采血,测定电解质及血气各指标。结果 抗原攻击后3.5min血K+显著增高(P<0.01),30 min后降至基础值水平,其它电解质无显著变化;动脉氧分压(PaO2)在抗原攻击后即持续性降低(P<0.01),动脉血二氧化碳分压(PaCO2)在8 min时有显著升高(P<0.01),以后逐渐恢复,pH值明显下降;血细胞容积(Hct)及血红蛋白(Hb)在抗原攻击后3.5 min增高显著(P<0.05)。结论 EG诱发的过敏性休克电解质及血气变化剧烈,表现为明显的高血钾、酸中毒、PaO2的持续降低以及PaCO2的增高,且反应迅速,消退较快。

细粒棘球蚴病患者Tim-3/Galectin-9对Th17/Treg的影响作用

目的探讨人细粒棘球蚴感染中T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3/半乳糖凝集素-9(Tim-3/Galectin-9)与Th17/Treg关系。方法收集28例细粒棘球蚴感染患者(CE组)以及30例健康体检人员(正常对照组)外周血,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细粒棘球蚴感染患者外周血白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17A(IL-17A)、转化生长因子β(TGF-β)的水平,实时定量PCR检测Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA以及Th17转录因子(RORγt)和Treg细胞转录因子(FOXP3),并进行相关性分析。结果细粒棘球蚴感染患者CD4^+T细胞上Tim-3表达水平高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,CE组患者外周血中TGF-β、IL-10含量明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。CE组患者血清中Galectin-9水平高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。而转录因子Foxp3在CE患者外周血单个核细胞(PBMC)中水平高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Tim-3^+CD4^+T和Galectin-9分别与TGF-β和IL-10呈正相关(P<0.05)。Tim-3mRNA、Galectin-9 mRNA分别与FOXP3呈正相关(P<0.05)。结论Tim-3/Galectin-9参与了细粒棘球蚴感染患者的免疫应答,Tim-3/Galectin-9可能通过改变Treg细胞转录因子及细胞因子,促进Th17/Treg细胞平衡改变,导致细粒棘球蚴持续感染。

重组抗原p29免疫保护小鼠细粒棘球蚴感染的差异长链非编码RNA的筛选研究

探讨了细粒棘球蚴感染后,借助重组抗原p29免疫保护下的长链非编码RNA差异分子的意义,并做好推广及实践运用,为疾病治疗提供重要的参考及指引。方法:在研究过程中,采取了对比实验分析的方法,选择38只小鼠作为实验对象,并采取随机分组方式,将38只小鼠随机分为观察组和对照组,每组小鼠例数为19例。观察组为p29免疫组,对照组为空白组。之后观察组重组抗原p29免疫3次,并利用细粒棘球蚴进行感染,在感染20周之后,对两组小鼠的血液样本进行获取,并对血液样本进行离心处理,对长链非编码RNA数据进行获取,对比两组小鼠的长链非编码RNA数据差异。结果:通过对比观察组和对照组的情况来看,观察组与对照组存在着显著性差异(P<0.05)。结论:通过重组抗原p29免疫保护小鼠细粒棘球蚴感染,能够对非编码RNA数据进行有效地提取,把握非编码RNA的差异分子,对p29免疫保护理论机制进行有效地把握,为临床治疗提供重要的数据指引,具有一定的临床实践意义。

棘球蚴感染极化巨噬细胞调控免疫性血小板减少症(ITP)的机制研究

目的探讨细粒棘球蚴感染早期和晚期巨噬细胞极化对免疫性血小板减少症(ITP)的调节作用。方法将BALB/c小鼠分为ITP组和空白对照组。ITP组经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立BALB/c小鼠早期和晚期感染模型,并根据感染剂量和时间分为低剂量感染4周/ITP组(Eg-L-4w/ITP),高剂量感染4周/ITP组(Eg-H-4w/ITP),高剂量感染4周/con组(Eg-H-4w/con)和高剂量感染12周/ITP组(Eg-H-12w/ITP)。分别于感染第4周和12周腹腔注射Anti-CD41抗体,对照组腹腔注射PBS。同时尾静脉连续采血5 d。将小鼠处死,取肝组织,HE染色后观察病理变化;通过流式细胞术检测小鼠脾脏、外周血F4/80^(+)CD11c^(+)M1和F4/80^(+)CD206^(+)M2型巨噬细胞以及T、B淋巴细胞及其亚型细胞比例。结果感染组小鼠肝组织出现棘球蚴感染寄生灶,感染灶周围炎症细胞浸润。ITP组小鼠注射致病抗体后血小板数显著减少,ITP模型建立成功。血常规结果显示,细粒棘球蚴感染小鼠4周ITP模型小鼠外周血血小板未明显增多,感染12周ITP模型小鼠血小板数增多。提示细粒棘球蚴感染小鼠晚期状态对ITP小鼠模型具有调节保护作用。流式细胞术检测低、高剂量感染4周组小鼠脾脏和外周血F4/80^(+)CD11c^(+)M1型巨噬细胞比例分别为(11.12±1.24)%、(12.54±1.73)%和(6.11±0.66)%、(6.34±0.79)%,与ITP组、对照组的(6.90±1.48)%、(7.30±1.20)%和(4.40±0.49)%、(2.78±0.56)%比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。低、高剂量感染4周组脾脏和外周血F4/80^(+)CD206^(+)M2型巨噬细胞以及B、T淋巴细胞比例均高于ITP组和对照组(均P<0.05)。结论细粒棘球蚴感染早期的F4/80^(+)CD11c^(+)M1型巨噬细胞和感染晚期的F4/80^(+)CD206^(+)M2型巨噬细胞均对免疫性血小板减少症(ITP)有调节作用。

包虫囊液干预的肝细胞Foxp3与IFITM3表达变化及其与干扰素刺激蛋白相关性分析

目的观察包虫囊液干预的肝细胞核转录因子Foxp3、干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达变化并分析其与干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。方法从包虫病羊肝脏包囊中抽取囊液,将人肝癌细胞HepG2分为高浓度组、中浓度组、低浓度组及对照组,分别加入1∶10、1∶100和1∶1000浓度比例的囊液及不加囊液,采用Western blotting法及荧光定量PCR法检测各组干预后及低浓度组在干预后0、12、24、36、48、60、72 h细胞中的Foxp3、IFITM3及相关干扰素刺激蛋白IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15蛋白及mRNA表达,采用Spearman分析Foxp3、IFITM3与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15的相关性。结果不同囊液浓度干预下,IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3、ISG15蛋白及mRNA表达随着干预囊液浓度降低逐渐升高,IFIT3蛋白表达中浓度组>低浓度组、高浓度组(P均<0.05),IFIT3 mRNA高、中、低浓度组差异无统计学意义。低囊液浓度干预下各时点IFITM1、IFITM2、IFIT3蛋白表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、ISG15蛋白表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3蛋白表达随囊液干预时间延长而升高;IFITM2、IFIT3、ISG15 mRNA表达随囊液干预时间延长而降低,IFITM3、IFITM1 mRNA表达随囊液干预时间延长先升高后降低,Foxp3 mRNA表达随囊液干预时间延长而升高。Spearman相关分析结果显示,不同囊液浓度干预下Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关(P=0.004);Foxp3 mRNA、IFITM3蛋白及mRNA表达与IFITM1、IFITM2、ISG15 mRNA表达均呈正相关(P均<0.05),与IFIT3 mRNA表达无相关性;Foxp3蛋白表达与IFITM1、ISG15蛋白表达呈正相关(P均<0.05),与IFITM2和IFIT3蛋白表达无相关性。低囊液浓度干预下各时点Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关(P均<0.05);Foxp3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈负相关;IFITM3表达与IFITM1、IFITM2、IFIT3、ISG15表达呈正相关(P均<0.05)。结论在低浓度包虫囊液干预下,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、Foxp3及ISG15表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈正相关;随着囊液干预时间的延长,HepG2细胞IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFIT3、ISG15表达降低、Foxp3的表达升高,且Foxp3表达与IFITM3表达呈负相关。

包虫囊液对干扰素信号TRIF/IFITM3通路的影响

目的 探索包虫囊液干预人源肝细胞(L02)过程中TRIF/IFITM3通路相关蛋白的变化。方法 从感染细粒棘球蚴病的羊肝中获取囊液,用不同比例囊液浓度(1∶10、1∶100和1∶1000)干预肝细胞并设置阴性对照组(未加囊液干预)。采用囊液浓度(1∶1000)干预肝细胞后分别在0、24、48和72 h收集细胞。实时荧光定量PCR检测TRIF/IFITM3通路相关mRNA的表达,Western blot检测TRIF、IRF3、IFITM3、Foxp3的蛋白表达变化。免疫荧光检测IFITM3、Foxp3的表达和定位。Spearman分析TRIF、IFITM3及Foxp3的相关性。结果 Western blot显示囊液浓度(1∶1000)促进TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达,TRIF的相对表达量分别是(0.45±0.09)、(0.54±0.05)、(1.08±0.24)、(1.75±0.31);IFITM3的相对表达量分别是(1.02±0.41)、(1.00±0.16)、(1.24±0.12)、(1.84±0.20)。囊液浓度(1∶1000)刺激肝细胞0、24、48和72 h后,Western blot显示TRIF、IRF3、IFITM3蛋白表达量逐渐下降,而Foxp3表达量增高。TRIF的相对表达量分别是(1.00±0.31)、(1.08±0.19)、(0.90±0.13)、(0.57±0.05);IFITM3的相对表达量分别是(0.80±0.26)、(0.94±0.09)、(0.82±0.19)、(0.54±0.18)。Foxp3的相对表达量分别是(0.70±0.11)、(0.80±0.02)、(0.83±0.03)、(1.08±0.04)。免疫荧光显示,在泡球蚴感染60 d时,小鼠肝脏IFITM3和Foxp3发生共定位。Spearman分析TRIF与IFITM3存在正相关性(r=0.704,P<0.01),TRIF与Foxp3存在负相关性(r=-0.859,P<0.01),IFITM3与Foxp3存在负相关性(r=-0.686,P<0.01)。结论 较低浓度的包虫囊液刺激TRIF/IFITM3通路相关分子表达,进而激活天然免疫的抗病原体功能;随着囊液干预时间增加TRIF/IFITM3受抑制,而Foxp3高表达,促进包虫在宿主体内慢性寄生。

包虫囊液干预下宿主限制性因子IFITM3和Foxp3之间的关联研究

目的探究在包虫囊液干预过程中IFITM3与Foxp3之间的相互影响。方法小鼠细粒棘球蚴病造模后收集肝脏组织,通过HE染色、免疫组织化学方法检测肝脏组织中IFITM3和Foxp3的表达状况。采用Western blot和荧光定量PCR(Real-time PCR)测定未加囊液浓度(阴性组)、1∶10、1∶100和1∶1000共4组不同囊液浓度比例干预HEK293T细胞后IFITM3和Foxp3的蛋白表达量和mRNA相对表达量。用Spearman进行IFITM3和Foxp3相关性分析。结果HE染色后,可见CE肝脏组织的病灶;免疫组化结果显示随着细粒棘球蚴感染时间的延长,IFITM3在肝脏的表达量逐渐降低,Foxp3的表达量逐渐升高。在感染第2 d IFITM3的表达最高而Foxp3的表达量最低高,感染300 d IFITM3的表达量最低,Foxp3的表达量最高。Western blot显示,在4组囊液浓度比例干预下,IFITM3的灰度值分别是(1.421±0.162)、(0.798±0.091)、(0.936±0.118)、(1.269±0.101);Foxp3的灰度值分别是(0.614±0.034)、(0.761±0.020)、(0.919±0.019)、(1.115±0.177),说明IFITM3和Foxp3随着囊液干预浓度的降低表达量逐渐升高。Real-time PCR结果显示,在4组囊液浓度比例干预后IFITM3 mRNA相对表达水平分别是(1.00±0.322)、(0.605±0.321)、(0.736±0.113)、(2.384±0.049);Foxp3 mRNA相对表达水平分别是(1.000±0.153)、(1.321±0.316)、(1.675±0.376)、(3.848±1.645),说明随着囊液干预浓度的降低,IFITM3和Foxp3mRNA的相对表达量逐渐升高。Spearman相关分析结果显示,不同浓度囊液干预后,细胞中的IFITM3与Foxp3在mRNA相对表达和蛋白表达均成正相关。结论在细粒棘球蚴感染过程中,低浓度的囊液刺激会使IFITM3和Foxp3的表达量增高,并且IFITM3与Foxp3呈正相关性,说明宿主限制性因子IFITM3通过与核转录因子Foxp3存在关联,从而与获得性免疫发生联系。