体细胞克隆技术扩繁超细型二狼山绒山羊的应用研究

【目的】通过体细胞克隆技术生产超细型二狼山绒山羊克隆个体,为该技术在地方优质羊品种资源扩繁及新品种培育中的应用提供理论依据。【方法】选择1只4岁龄羊绒细度为13.89μm的二狼山绒山羊(♂),采集耳组织并分离培养成纤维细胞,以其为供体细胞,利用体细胞克隆技术开展超细型二狼山绒山羊的扩繁研究,通过克隆羊体重、羊绒细度、繁殖性能等指标评估该技术的可行性。【结果】试验成功建立了稳定的山羊卵母细胞体外成熟培养及体细胞克隆技术体系,卵母细胞成熟率为44.8%,孤雌激活卵裂率、囊胚率分别为83.0%、22.4%;二狼山绒山羊克隆胚的卵裂率、囊胚率分别为77.8%、13.7%。获得5只克隆羊个体,其生长发育正常,二狼山绒山羊母羊自然交配共获得16只健康的F1代个体,具有正常繁殖能力。克隆个体羊绒细度极显著低于同龄对照个体(P<0.01)。【结论】本研究通过体细胞克隆技术成功克隆了超细型二狼山绒山羊个体,其具备正常生产性能和繁殖性能,并保留了超细羊绒的特性,为地方优良羊种质资源扩繁和新品种培育应用研究奠定了基础。

利用体细胞克隆技术扩繁超级公猪的应用价值分析

培育超级公猪用于生产优质商品猪是种猪育种企业的理想目标。常规育种技术选育种公猪时,受测定群体规模及选择强度的影响,仅能培育出少量的超级公猪。同时,少量的超级公猪受到时间、空间、公猪利用效率的限制,根本无法满足养猪业的巨大需求。利用体细胞克隆技术可以在不改变动物基因的前提下批量复制优秀个体。国内外多家单位通过体细胞克隆技术在地方猪遗传资源保护、猪育种新材料创制与新品种培育、人类疾病模型制备、人类异种器官移植、生物反应器等领域做了大量研究。本文对利用体细胞克隆技术扩繁超级公猪在养猪生产中的应用现状进行了综述,并分析和展望了其在养猪行业的巨大应用价值和广阔前景。

淋巴结滤泡辅助T细胞淋巴瘤伴B细胞克隆性增生10例临床病理特征分析

目的探讨淋巴结滤泡辅助T细胞淋巴瘤血管免疫母细胞型(nodal follicular helper T cell lymphoma,angioimmunoblastic-type,nTFHL-AI)伴B细胞克隆性增生的临床病理学特征、免疫表型、分子特征、治疗及预后。方法收集10例nTFHL-AI伴B细胞克隆性增生患者的临床病理资料,分别行HE、免疫组化和基因重排检测,并复习相关文献。结果10例患者中男性5例,女性5例,中位年龄73岁。临床表现以全身淋巴结肿大、脾肿大及B症状为主;Ann Arbor分期:Ⅳ期8例,Ⅰ+Ⅱ期2例。实验室检查以β2微球蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)升高,血红蛋白、红细胞和血小板减少为主,血浆EBV核酸定量阳性8例。镜下均可见典型结节状聚集或散在的透明细胞、分枝状高内皮血管及增生杂乱“风吹”状的滤泡树突网。肿瘤细胞背景中嗜酸性粒细胞浸润0~5个/HPF 7例,5~10个/HPF 2例,>50个/HPF 1例。浆细胞含量≤5%6例,浆细胞含量10%和20%各1例,浆细胞含量较多(30%)2例。组织细胞明显增生7例。见RS样大细胞1例。背景中含大量B细胞5例,含少量B细胞5例。10例患者均表达T细胞标志物,滤泡辅助性T细胞标志物CD10、BCL6、CXCL13和PD-1同时阳性6例,BCL6、CXCL13和PD-1同时阳性10例。EBER原位杂交阳性8例。10例患者均检测到TCR基因重排和IG基因重排阳性。所有患者诊断后均行化疗,其中3例疾病进展死亡。结论伴B细胞克隆性增生nTFHL-AI中,B细胞的克隆性增生与EBV是否感染及感染细胞的数量无关,同时浆细胞增生提示预后不良。

安徽农业大学殷宗俊教授团队成功培育安徽省首批体细胞克隆地方猪

2月8日,安徽农业大学殷宗俊教授团队在安徽大自然种猪股份有限公司开展的定远猪体细胞克隆和胚胎移植实验获得成功,4头通过胚胎移植受孕的大白母猪,已顺利产下56头全身被毛黑色、健康状况良好的纯种淮猪(定远猪)仔猪,胎均产仔数14头。定远猪是中国优良地方品种之一,原产我省江淮之间的古老地方品种,具有繁殖力高、耐粗饲、肉质优良、适应性强等优点,2006年被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》,是国家畜禽遗传资源的基因库,也是今后培育自有知识产权良种猪的宝贵素材。体细胞克隆定远猪的成功分娩,标志着安徽已经全面掌握地方猪遗传资源体细胞冻存方式,实现了遗传资源的长期保存和活体恢复,优质畜禽种质资源保护工作迈上了新的高度,也意味着向破解相关‘卡脖子’问题、实现我省种业振兴迈出了关键一步。

我国首批体细胞克隆优秀奶牛诞生

绵羊“多莉”的诞生让克隆技术广为人知。27年后,中国人将它用到了良种奶牛快速繁育上。1月31日,宁夏科技厅正式发布消息称,春节前夕,3头利用体细胞克隆技术复制的高产长寿奶牛在灵武市陆续出生,这是我国首次采用克隆技术对现存群体中终生产奶量高于100t的优良荷斯坦奶牛个体进行种质复原保存及良种繁育。

具野稻细胞质的胞质型雄性不育系的体细胞克隆变异II.体细胞克隆温敏核不育突变

在胞质型水稻雄性不育系IR66707A和IR69700A经离体培养而获得的136个体细胞克隆中,发现了温敏核不育突变5例。这类突变体在广州地区的自然气候下,早季至晚季前期表现为不育,晚季后期表现为可育。盛夏,在幼穗发育至花粉形成阶段对部分突变材料进行短日照处理,发现对短日照敏感的不育系农垦58S转换为可育,而供试的5例突变及另一对照培矮64S却与未经处理的材料一样仍表现为不育,表明它们的育性与日照长度的变化无关。在同一发育时期进行低温处理的结果显示,低温处理10d及10d以上者可发生育性转换,自交结实率在17.23%-42.19%之间,而未经处理的材料仍然表现不育,表明它们的育性转换与温度有关。以正常品种为父本与突变体杂交,F1全部为可育;F2可育与不育个体的分离比为3:1;以F1为父本与之测交,TF1代中可育与不育个体的分离比为1:1。遗传分析表明,这种温敏核不育突变为一对隐性核基因所控制。获得了由胞质型雄性不育变为胞核型雄性不育的突变体,这在体细胞克隆变异领域中是一种典型的突变。

体细胞克隆山羊微卫星DNA分析

用 10对山羊微卫星DNA多态性引物对 2只体细胞克隆济宁青山羊、青山羊供体细胞、受体奶山羊母羊以及具有亲缘关系的 3只对照济宁青山羊进行微卫星DNA分析 .结果表明有 5对山羊微卫星DNA多态性引物 ,即SR CRSP1,SR CRSP5 ,SR CRSP6 ,SR CRSP7和SR CRSP2 4 ,扩增产物有明显的多态性 .扩增产物经过 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染 ,结果 2只体细胞克隆山羊的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同 ,而且不同于其受体母亲也不同于其他所有同品种不同个体的对照青山羊 .证明体细胞克隆山羊基因组来源于供体细胞 .

高含量薯芋皂素植株的细胞克隆

盾叶薯芋(Dioscorea zingibernisis Wright)细胞克隆系的建立采用平板培养法。试验了18种不同的培养外界环境因素对植板率的影响:如培养基pH值,在培养基中添加谷氨酰胺、丝氨酸、柠檬酸、葡萄糖和偶合低聚糖等。其中,以添加偶合低聚糖的植板率最高。获得31个克隆细胞系。经大量培养,测定细胞生长,筛选出18个优良克隆系。以代号为Rc81的克隆系在接种量为0.7g/L(折合干重,下同),培养28d可获得15.1g/L。

再生障碍性贫血儿童TCRVβ亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLA-DRB1*15的关系

【目的】探讨再生障碍性贫血(再障)儿童TCRVβ24个亚家族T细胞克隆性及其与HLA-DRB1*15的关系。【方法】再障儿童17例(SAA14例,MAA3例),采用RT-PCR和基因扫描分析外周血或骨髓TCRVβ24个亚家族基因的表达和克隆性,SSP-PCR检测HLA-DR。【结果】再障儿童外周血T细胞仅表达4～22个Vβ亚家族,而正常儿童外周血T细胞几乎表达所有Vβ亚家族。12例(包括初诊SAA4例,CR4例,复发1例和MAA3例)再障儿童存在不同程度T细胞克隆性增殖,但个体间差异较大,正常外周血和骨髓均为多克隆性T细胞。5例HLA-DRB1*15(+)患儿中4例(80%)有寡克隆T细胞,而12例HLA-DRB1*15(-)患儿中仅3例(25%)见寡克隆T细胞,两组比较差异具有显著意义(P<0.05)。伴寡克隆T细胞的6例SAA儿童经免疫抑制治疗后达CR;不伴寡克隆T细胞的5例SAA儿童接受免疫抑制治疗,其中CR1例,PR2例、无效1例,死亡1例。【结论】大多数再障儿童存在T细胞克隆性增殖,寡克隆T细胞多见于SAA,尤其是HLA-DRB1*15(+)的SAA儿童。TCRVβT细胞克隆的检测对进一步了解再障免疫功能状态、预测免疫抑制治疗效果具有一定的参考价值。

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCR-RFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%(123/180),囊胚发育率为25.20%(31/123);在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。

CD226(PTA1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究

目的 :研究CD2 2 6分子在NK细胞克隆上的表达及功能。方法 :用有限稀释法建立NK细胞克隆并鉴定。采用重导向杀伤实验 (redirectedcytotoxicityassay ,RCA)观察CD2 2 6单克隆抗体对NK细胞克隆杀伤作用的影响 ,并用ELISA方法检测杀伤相培养上清中细胞因子水平的动态变化。结果 :获得 1株NK细胞克隆。在重导向杀伤实验中 ,CD2 2 6单克隆抗体能明显提高NK细胞克隆的杀伤水平 ;促进NK细胞克隆IFN γ和GM CSF的分泌。结论 :CD2 2 6是一种新的NK细胞活化性受体 ,IFN γ和GM CSF水平升高可能与NK细胞克隆功能有关。

Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析

体细胞核移植(体细胞克隆)技术在动物生产、医药工业、治疗性克隆以及对珍稀濒危动物的拯救有重要意义,然而克隆效率低下以及克隆动物发育异常,严重制约了克隆技术的发展和应用.在体细胞核克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,发生在核移植后几小时内供体核的重编程,决定了克隆胚胎的发育能力.印记基因是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性,而DNA甲基化是调控印记的一个主要方式.印记基因Mash2在胚胎发育和器官形成过程中起着非常重要的作用.为了探求核移植过程中Mash2基因DNA甲基化的表观重编程是否充分,利用亚硫酸氢盐测序法对出生48h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中Mash2基因的DNA甲基化状态进行分析.结果显示,尽管位于Mash2基因启动子和第一个外显子处的CpG岛在正常牛和克隆牛中甲基化水平都不高(20.04%,5.55%),但克隆组的甲基化水平仍显著低于正常对照组(P<0.05).甲基化模式正常组中9N3有5种不同的形式,9N4仅1种;而克隆组9C3和9C5也分别是1种.推测Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因.

鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备

从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mmol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸、以及含1000U/mLLIF、10ng/mLbFGF和5ng/mLSCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第Ⅹ期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2%和1.0%。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。

体细胞克隆牛和转基因体细胞克隆牛的遗传学分析(英文)

分析了来自同一细胞系的体细胞克隆牛甜甜、庆庆、浒娃及来源同一培养转基因体细胞系转基因体细胞克隆牛九妹、乐娃和 1个妊娠 8个月转基因流产胎牛 8C2以及随机抽取的 1头鲁西黄牛 (LX)、 1头褐斯坦牛 (HS)在 2 4个微卫星位点标记牛的基因型 .结果表明 2 4个多态位点均表现出多态 ,等位基因数为 1～ 5个 ,平均为 3 17个 .根据网上公布的数据 ,按其最高频率计算 ,甜甜、庆庆、浒娃、九妹、乐娃、 8C2与培养细胞系、转基因细胞系间匹配概率为 1 17× 10 -3 6,根据本研究观察到的数据计算 ,匹配概率为 1 90× 10 -2 3 ;而与随机抽取的 1头鲁西黄牛及褐斯坦牛的基因型分别在 2 3和2

东北红豆杉细胞克隆技术的研究

利用东北红豆杉叶片愈伤组织细胞为材料，进行了细胞克隆技术的研究。发现悬浮培养细胞第３代的植板率最高，ｐｈｙｔａｇｅｌ与低熔点胶的植板率相当，固体－固体双层培养可适当提高细胞的植板率。通过东北红豆杉细胞克隆的平板培养，获得了一批速生、稳定的细胞系，生长速率最高可达０．４ｇＦＷ／ｇＦＷｄ，完全克服了红豆杉细胞培养过程中的褐化现象。

银杏单细胞克隆研究

目的 :利用银杏单细胞克隆系 ,探索银杏内酯生产的稳定性与细胞均一性之间的关系。方法 :利用植物细胞平板技术培养。结果 :L 谷氨酰胺能大大促进银杏细胞的植板率 ;植板率在 0 .5～ 5 .0× 10 4 cell·ml-1随密度的增加而升高。获得的 48个克隆株系中G 2 2株系银杏内酯B(GKB)含量高达 0 .0 99% ,且大部分克隆株系在继代培养过程中能保持相对稳定。结论 :在银杏组织培养过程中 ,利用单细胞克隆技术可在一定程度上解决银杏内酯生产不稳定性的问题。

内蒙古白绒山羊的体细胞克隆

内蒙古白绒山羊是具有悠久历史的绒肉兼用的品种,对荒漠和半荒漠环境有较强的适应性.山羊绒是来自绒山羊的细绒毛,具有极高的商业价值.为了扩大优秀绒山羊数量,本试验尝试利用体细胞克隆技术进行绒山羊克隆研究.从一只成年优秀公绒山羊中,取其耳缘组织,培养获得成纤维细胞.从当地屠宰场获得山羊卵巢,抽取卵母细胞并体外培养成熟.然后以绒山羊成纤维细胞为核供体,通过体细胞克隆技术生产克隆胚胎.核移植重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率分别为75.8%,72.6%和11.6%.将处于1-至2-细胞期的胚胎移植入同期发情受体母山羊输卵管中,于2009年4月30日诞生了一只克隆绒山羊.该克隆羊的生长状态及产绒量与细胞核供体山羊相一致,呈现良好的发育态势,说明体细胞克隆技术可以成为良种绒山羊的扩繁途径.

前B细胞克隆增强因子在急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中表达及对炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB p65表达影响的研究

目的:观察前B细胞克隆增强因子(pre-B cell colony enhancing factor,PBEF)在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)大鼠中肺组织的表达,以及对ARDS大鼠肺组织炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)mRNA以及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65蛋白表达的影响,通过以上指标的变化,结合已有体外实验所观察到的现象试图证实前B细胞克隆增强因子在ARDS中的促炎作用。方法:将40只成年SD大鼠随机分为空白对照组(C组)、模型组(OA组)、药物干预组(D组)、溶媒对照组(S组),OA组、D组及S组大鼠用油酸尾静脉注射复制ARDS模型,D组造模前腹腔内注射PBEF抑制剂FK866,S组造模前注射等体积FK866溶媒二甲基亚砜。造模成功6 h后取材,比较各组大鼠肺组织PBEF、TNF-α、IL-1βmRNA以及NF-κB p65蛋白表达情况。结果:C组大鼠肺组织中几乎见不到PBEF表达,而在其他各组大鼠肺组织肺泡壁及肺泡水肿液中、支气管黏膜上皮及血管内皮均可发现PBEF蛋白分布;OA组、D组和S组大鼠PBEF及炎症因子mRNA和NF-κB p65蛋白表达增加(PBEF:P=0.000,P=0.000,P=0.000;TNF-α:P=0.035,P=0.000,P=0.000;IL-1β:P=0.000,P=0.000,P=0.000;NF-κB p65:P=0.000,P=0.000,P=0.000),D组大鼠肺组织PBEF、炎症因子mRNA和NF-κB p65蛋白表达较OA组和S组低(PBEF:P=0.002,P=0.006;TNF-α:P=0.004,P=0.001;IL-1β:P=0.001,P=0.015;NF-κB p65:P=0.001,P=0.000)。结论:PBEF可能通过激活炎症反应、促进炎症因子表达等途径造成肺组织的炎性损伤,进而在ARDS发生发展中起重要作用。