NP9基因的克隆及对细胞周期素D1转录活性的影响

背景与目的:NP9基因是我们在鼻咽癌中克隆到的一个新的表达下调的基因(GenBank登录号:BF718797),为了进一步研究该基因的功能,我们构建了人NP9基因编码区序列的真核表达质粒,并研究其表达对细胞周期素D1(cyclinD1)的影响。方法:通过核苷酸同源序列比较(BlastN)得到NP9EST的同源cDNA,RT-PCR扩增其编码区序列并构建真核表达重组质粒pRc/CMV2-NP9,脂质体转染后G418筛选出稳定、高效转录NP9基因的细胞克隆;再通过脂质体转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc质粒到稳定表达NP9基因的细胞克隆,测定荧光素酶的活性以确定NP9基因对cyclinD1和NF-κB转录活性的影响;同时亚克隆NP9基因编码序列到载体pEGFP-C1中,脂质体转染细胞以确定NP9蛋白在细胞中的定位。结果:融合的绿色荧光蛋白出现于细胞核。G418抗性克隆中,RT-PCR扩增证实部分克隆表达NP9基因,且强弱不同。表达NP9基因的细胞克隆在瞬间转染cyclinD1promoterLuc和NF-κB-Luc48h后,荧光素酶的活性较其对照组分别下降46%和63%。结论:NP9蛋白在细胞核内表达;NP9基因通过抑制核转录因子NF-κB的转录活性下调cyclinD1的表达。

食管鳞状细胞癌中细胞周期素D1和P16蛋白的表达及意义

目的探讨食管鳞状细胞癌中周期素D1(Cyclin D1)和P16蛋白的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法及Western blot方法检测食管鳞状细胞癌组织及食管正常黏膜组织中Cyclin D1及P16蛋白表达水平,并分析其与临床病理学指标之间的关系,探讨食管鳞状细胞癌组织中Cyclin D1与P16蛋白表达的相关性。结果免疫组化显示,Cyclin D1在食管癌组织中的阳性表达率高于食管正常黏膜组织(P<0.05),P16在食管癌组织中的阳性表达率低于食管正常黏膜组织(P<0.05)。Western blot检测结果显示,食管癌组织中Cyclin D1蛋白表达量明显高于食管正常黏膜组织(P<0.05),P16蛋白表达量明显低于食管正常黏膜组织(P<0.05)。Cyclin D1的表达与肿瘤浸润深度、是否淋巴结转移、肿瘤分化程度有关(P<0.05),P16的表达与是否淋巴结转移有关(P<0.05)。食管癌组织中Cyclin D1与P16蛋白表达之间无明显相关性(P>0.05)。结论检测Cyclin D1和P16蛋白表达有望作为评估食管鳞状细胞癌生物学行为和预后的参考指标。

上皮钙粘素、β-连环蛋白、细胞周期素D1在进行期寻常型银屑病皮损的表达

目的通过检测银屑病患者皮损处上皮钙粘素、β-连环蛋白和细胞周期素D1的表达,探讨其在银屑病角质形成细胞高度增殖中的意义。方法用免疫组化方法检测正常组织及进行期银屑病皮损处上皮钙粘素、β-连环蛋白和细胞周期素D1蛋白的表达。结果银屑病患者皮损增生的表皮细胞上皮钙粘素和β-连环蛋白在颗粒层和基底细胞层表达明显降低,与正常人相比有显著性差异(P<0.01)。而细胞周期素D1在银屑病患者皮损基底细胞层表达显著升高,并与β-连环蛋白的异常表达相关。结论上皮钙粘素和β-连环蛋白表达的下调可能与银屑病角质形成细胞高度增殖有关,Wnt信号转导系统异常可能参与银屑病的发病机制。

成釉细胞瘤中细胞周期素D1及其抑制因子和hTERT的表达

目的研究端粒酶逆转录酶(hTERT)、细胞周期素D1(cyclinD1)、周期素依赖激酶抑制因子p16INK4、p21WAF1mRNA和p27KIP1蛋白在人成釉细胞瘤(ABs)中的表达。方法用原位杂交和免疫组化SP法分别检测ABs中hTERT、cyclinD1、p16INK4、p21WAF1mRNA和p27KIP1蛋白的表达。结果hTERTmRNA在ABs中有较强表达,51例为阳性表达,cyclinD1mRNA在ABs中23例为阳性表达,而p16INK4、p21WAF1mRNA和p27KIP1蛋白在ABs中分别有17、12、9例为阳性表达。伴随ABs的复发和恶变,hTERT、cyclinD1mRNA阳性率逐渐上升,p16INK4、p21WAF1mRNA和p27KIP1蛋白阳性表达丢失。经Kendall相关性分析得出,hTERTmRNA与p16INK4、p21WAF1mRNA、p27KIP1蛋白之间在ABs中rk分别为-0.587、-0.652、-0.783,均有统计学意义(P<0.001)。结论hTERT在ABs中的活性可能与p16INK4、p21WAF1mRNA、p27KIP1蛋白丢失等多种因子共同调控有关。

细胞周期素D1和p16蛋白表达与胆管癌转移和预后的关系

目的探讨细胞周期素D1(Cyclin D1)和p16蛋白表达与胆管癌临床病理特征和患者预后的关系。方法应用免疫组化方法检测50例胆管癌和20例正常胆管组织中Cyclin D1及p16蛋白表达水平,并结合胆管癌的病理学行为和临床随访资料进行分析。结果在胆管癌中Cyclin D1和p16蛋白阳性表达率分别为72.0%(36/50)和42.0%(21/50)。胆管癌中Cyclin D1表达阳性率显著高于正常胆管组织(P<0.05),而p16表达阳性率显著低于正常胆管组织(P<0.05)。Cyclin D1和p16表达与胆管癌分化程度、TNM分期、转移及患者生存期相关(P<0.05)。Cyclin D1和p16表达呈显著负相关(r=-0.68,P<0.05)。结论检测Cyclin D1和p16基因蛋白表达可作为评估胆管癌生物学行为和预后的参考指标。

粉防己碱对大鼠肝星状细胞增殖及细胞周期素D1，增殖细胞核抗原表达的调控

目的探讨粉防己碱（Tet）对肝星状细胞（HSC）增殖的调控机制。方法培养大鼠HSC，MTT法测Tet对HSC增殖的影响，免疫细胞化学法测Tet对HSC增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期素D1（CyclinD1）表达的影响。结果Tet在0．5-1mg／L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖（P〈0．05）。0．5，1mg／L Tet浓度组PCNA阳性表达细胞数与对照组有显著性差异（P〈0．01），两浓度组之间也存在显著性差异（P〈0．01）。Tet 0．5，1mg／L浓度组CyclinD1阳性表达细胞数与对照组有显著性差异（P〈0．01），两浓度组之间差异有显著性（P〈0．01）。结论Tet通过抑制细胞周期素Cy-clinD1，PCNA表达，使细胞周期停滞于G0／G1期，从而发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用。

女性非小细胞肺癌中细胞周期素D1和E的表达

目的探讨细胞周期素D1(cyclin D1)和细胞周期素E(cyclin E)在女性非小细胞肺癌中的表达及意义。方法采用免疫印迹方法检测cyclin D1和cyclin E在女性非小细胞肺癌组织(66例)和癌旁正常组织(66例)中的阳性表达率。结果女性非小细胞肺癌组织中cyclin D1和cyclin E的阳性表达率分别为45.5%(30/66),59.1%(39/66),显著高于癌旁正常组织。低分化癌、肿瘤直径>3 cm组cyclin D1的表达率高于中高分化癌、肿瘤直径≤3 cm组cyclin D1的表达率,cyclin E阳性表达率与肿瘤分化程度、肿瘤大小无关。淋巴结转移阳性组cyclin D1和cyclin E阳性率均高于淋巴结转移阴性组。cyclin D1和cyclin E的阳性表达率与肿瘤病理类型、临床分期的关联差异无统计学意义。cyclinD1表达阳性组的cyclin E阳性表达率高于cyclin D1表达阴性组,cyclin D1和cyclin E双阳性组淋巴结转移率明显高于非双阳性组。结论女性非小细胞肺癌组织中存在cyclin D1和cyclin E的过表达,提示cyclin D1和cyclin E可能是肺癌的潜在预报因子。

细胞周期素D1在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

目的研究口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中细胞周期素D1(Cyclin D1)的表达及意义。方法应用免疫组织化学Envosion法检测50例OSCC患者与10例正常黏膜组织中Cyclin D1蛋白在病理组织切片中的表达水平,并进行统计学分析。结果在50例OSCC标本中Cyclin D1主要表达在细胞核,也有少量表达在细胞浆。Cyclin D1在OSCC标本中的阳性表达率80.0%,明显高于在正常口腔黏膜组织中的表达率20.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。CyclinD1表达与OSCC病理分级、临床分期和是否有淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论 Cyclin D1蛋白的异常表达与OSCC的发生、发展有密切的关系,可作为OSCC治疗和预后的辅助性指标。

热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低的转录调控机制

目的:研究人的细胞周期素D1基因启动子热休克效应的表达调控机制.方法:以RT-PCR技术研究细胞周期素D1mRNA水平的变化;构建一系列人细胞周期素D1基因启动子报告基因质粒.通过报告基因方法确认细胞周期素D1启动子的热休克效应区.应用染色质免疫沉技术检测核心启动子区域的组蛋白乙酰化修饰情况.结果:热休克造成细胞周期素D1mRNA水平下降;报告基因结果显示人细胞周期素D1基因的热休克的效应区位于-50～+141bp范围.核心启动子区组蛋白H3第九位赖氨酸乙酰化程度降低.结论:热休克抑制人的细胞周期素D1基因的启动子转录活性,其效应区位于核心启动子的-50～+141bp范围.热休克效应与核心启动子区的组蛋白乙酰化程度下降有关.

细胞周期素D1在涎腺腺样囊性癌中的表达及意义

目的探讨细胞周期素D1(cyclinD1)在涎腺腺样囊性癌中的表达及其与涎腺腺样囊性癌的相关性。方法采用免疫组织化学SP法检测cyclinD1蛋白在12例正常涎腺组织(NSG),15例多行性腺瘤(PA)及41例涎腺腺样囊性癌(ACC)中的表达。结果cyclinD1在NSG、PA及ACC中的表达率分别为0、53.3%、68.3%,NSG与PA、ACC组差异均有统计学意义(P<0.05),PA与ACC组表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。cyclinD1在晚期病例中的阳性表达率和表达水平均高于早期病例,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论cyclinD1的高表达在涎腺腺样囊性癌的发生发展中起重要作用,检测其表达水平可用以辅助腺样囊性癌诊断及估计预后。

河南食管癌高发区居民食管癌和癌旁组织细胞周期素D1蛋白和mRNA的表达

目的 :探讨细胞周期素蛋白及mRNA表达变化与食管鳞癌发生之间的关系。方法 :采用免疫组织化学过氧化物酶标志的链霉卵白素 (SP)染色法和反转录PCR方法检测食管癌高发区河南省林州市手术标本的细胞周期素D1(cyclinD1)的蛋白表达水平和mRNA表达状况和特征。结果 :癌组织和癌旁组织中均出现不同程度的CyclinD1蛋白和mRNA表达 ,癌旁组织和癌组织CyclinD1免疫组化阳性和mRNA表达阳性率分别为 2 3 1%vs 3 8 4%和 87 5 %vs 81 3 % ,但二者间无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,但是 ,碘染色阳性癌旁组织CyclinD1免疫阳性率 ( 2 8 6% )明显高于碘染色阴性组 ( 3 6% )。结论 :CyclinD1与食管鳞癌癌变发生有关 。

甲状腺肿瘤雌激素受体亚型及细胞周期素D1的表达及意义

目的:探讨雌激素受体亚型ERα、ERβ和cyclinD1在人甲状腺肿瘤中的表达及其意义。方法:采用免疫组织化学S-P法对正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及甲状腺癌组织中ERα、ERβ和cyclinD1的表达进行了检测。结果:正常甲状腺组织和甲状腺腺瘤中ERα表达显著低于甲状腺癌(x2=1.59,P<0.05);正常甲状腺组织ERβ的表达显著高于甲状腺腺瘤和甲状腺癌(x2=2.69,P<0.05);甲状腺癌组织中cyclinD1的阳性表达明显高于甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织(x2=3.05,P<0.05)。三者的表达与甲状腺癌的临床分期以及有无淋巴结转移有关;并且对检查组进行相关性分析。结论:ERα高表达和ERβ低表达均可促进cyclinD1过度表达,从而使甲状腺上皮细胞增殖失控,进而导致甲状腺癌发生、发展和转移。

番茄红素上调细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达促进人外周血内皮祖细胞周期进展

目的探讨番茄红素对人外周血内皮祖细胞活性、周期调控的作用及其分子机制。方法体外原代培养人外周血内皮祖细胞,采用噻唑蓝法、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot方法检测番茄红素对内皮祖细胞活性、细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达情况。结果噻唑蓝比色实验显示,不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L)番茄红素能显著增加内皮祖细胞的生长能力,且呈一定的量效与时效关系;流式细胞仪分析显示,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞的G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多;逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot分析表明,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞中细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1表达上调。结论番茄红素对内皮祖细胞的促进生长作用,可能与上调细胞周期素依赖性激酶4、细胞周期素D1的表达,使G0/G1期细胞比例减少有关。

胃肠道间质瘤组织中Ki-67,细胞周期素D1和细胞间黏附分子-1的表达

目的：探讨胃肠道间质瘤（GISTs）组织中Ki-67、细胞周期素D1（Cyclin D1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达及其与肿瘤生物学行为的关系。方法：应用免疫组织化学sP法检测61例GISTs组织中Ki-67、Cyclin D1及ICAM-1的表达情况，分析上述指标与肿瘤临床病理学特征、危险度的关系。结果：GISTs组织中Ki-67标记指数（Ki-67 LI）〈1％、1％～5％和〉5％的例数分别为23例、17例和21例；Cyclin D1和ICAM-1阳性率为51％和59％。不同危险度组间Ki-67u和Cyclin D1的表达差异有统计学意义（P〈0．05）；不同危险度组间ICAM-1的表达差异无统计学意义；而有无复发转移组间ICAM-1表达差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：Ki-67、Cyclin D1可作为判断GISTs恶性程度的参考因素．ICAM-1与GISTs的复发转移有关。

信号转导与转录激活因子3、细胞周期素D1在胆管癌组织中的表达及意义

目的检测信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、细胞周期素D1(Cyclin D1)在胆管癌组织中的表达并分析其临床意义。方法采用免疫组织化学技术检测STAT3、Cyclin D1在70例胆管癌组织和15例非肿瘤胆道上皮组织中的表达情况。结果免疫组织化学结果显示70例胆管癌组织和15例非肿瘤胆道上皮组织中STAT3、Cyclin D1阳性表达率分别为61.4%、33.3%和42.9%、13.3%。STAT3、Cyclin D1蛋白在胆管癌组织中的表达均明显高于非肿瘤胆道上皮组织(P<0.05)。STAT3蛋白表达与胆管癌的临床分期、淋巴结转移和组织学分级明显相关(P<0.05);胆管癌组织中Cyclin D1蛋白表达与淋巴结转移和组织学分级明显相关(P<0.05)。STAT3与Cyclin D1表达呈明显正相关关系(P<0.05)。STAT3、Cyclin D1蛋白共阴性表达组生存时间明显长于共阳性表达组(P<0.01)。结论 STAT3、Cyclin D1可能是反映胆管癌发生发展的重要生物学指标。

乳腺癌中细胞周期素D1的表达及其临床意义

目的探讨细胞周期素D1（cyclinD1）的表达及其与乳腺癌生成发展及预后之间的关系。方法采用免疫组化染色检测乳腺癌标本中cyelinD1的表达，与相关临床资料进行分析，实验结果用SAS6．12统计软件，使用“扩展的Mantel—Haenasel统计法”进行分析。结果年龄≤50岁与〉50岁cyelinD1阳性率分别为31例（81．6％）及27例（73．0％），原位癌、导管内癌伴部分浸润、浸润性癌患者cyclinD1的阳性率分别是66．7％，50．0％，81．O％。根据临床分期（TMN分期）0期、I期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的cyelinD1阳性率分别为4例（66．7％），11例（61．1％），25例（80．6％），18例（90．0％）；有递增的趋势，且随着临床分期的增加细胞核染色cyclinD1阳性强度增加且差异有统计学意义。cyclinD1在乳腺癌中有高表达，且随乳腺癌的分期进展表达增高，有淋巴结转移、雌激素受体（＋）、P53（＋）的乳腺癌标本cyclinD1阳性表达率高。结论cyclinD1的表达与乳腺癌的形成发展及转移浸润有关，淋巴结转移多的乳腺癌cyclinD1表达高。cyclinD1与雌激素受体之间可能有独立作用，cyclinD1和P53可能相互作用共同参与了乳腺癌的形成。

DNA甲基化在热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低中的转录调控机制

目的研究DNA甲基化在热休克诱导的人细胞周期素D1基因启动子活性下降调控中的作用。方法 DNA甲基化通过甲基化特异性PCR方法检测。甲基化位点突变采用Stratagene公司定点突变试剂盒。甲基化位点的作用通过报告基因技术分析启动子活性确认。结果热休克处理可能造成细胞周期素D1基因启动子+65/67位点发生DNA甲基化,而突变该位点逆转了由报告基因活性分析研究的热休克效应。结论启动子+65/67位点的DNA甲基化可能调控细胞周期素D1的热休克效应。

端粒酶、细胞周期素D1在大肠癌中的表达及意义

目的 探讨端粒酶、细胞周期素D1(CD1)与大肠癌的发生、进展及预后的关系。方法 收集 2 4例手术切除的大肠癌标本 ,同时取距癌灶 5cm以外的癌旁组织及 10cm以外的正常组织。检测癌组织、癌旁组织及正常组织中CD1mRNA及端粒酶的表达。结果 1.2 4例大肠癌组织端粒酶阳性率 87.5 % ;癌旁组织阳性率 4 .2 %。癌旁组织和正常组织均与癌组织有显著性差异 (P <0 .0 1)。端粒酶活性在癌灶直径 >3cm的病例中明显高于癌灶直径≤ 3cm者 (P <0 .0 5 ) ;浸润深度达浆膜层者明显高于浸润至肌层者 (P <0 .0 5 ) ;有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 5 ) ;Dukes分期高 (C、D期 )的明显高于分期较低 (A、B期 )者。 2 .CD1mRNA的表达在大肠癌、癌旁及正常组织中有明显差异。CD1mRNA的表达在浸润至浆膜层组明显高于浸润至肌层组 (P <0 .0 5 ) ;有淋巴结转移组及晚期病变 (DukesB +C +D期 )组亦明显高于无淋巴结转移及早期病变 (DukesA期 )组 (P <0 .0 5 )。 3.端粒酶阳性病例的CD1mRNA表达明显高于阴性病例。端粒酶活性与CD1表达呈正相关。结论 1.端粒酶活化在大肠癌发生过程中起重要作用 ,并与大肠癌的进展、侵袭及转移有关。 2 .CD1过度表达与大肠癌的发生、发展及转移有关。 3.