用于细胞排列的介电泳微流控芯片制备与实验研究

设计并制作了一种应用于细胞排列的介电泳微流控芯片,以实现细胞的非接触、批量排列。芯片主要包括PDMS微通道和“台阶”形ITO微电极。运用仿真软件COMSOL分析了微电极所形成的电场分布,确定了最大电场强度的位置；利用MEMS加工工艺制备了ITO微电极和PDMS微通道,PDMS微通道与带有ITO电极的载玻片经过氧等离子表面处理后,对准键合获得最终的微流控芯片。通过不同频率下的介电泳实验,实现了酵母菌细胞的介电泳运动,并确定了正、负介电泳运动的电场频率。结果表明,酵母菌细胞在溶液电导率为60μS/cm的环境下,1-10kHz时,发生负介电泳运动；0.5-10MHz时,发生正介电泳运动；50kHz时,没有发生介电泳运动。并在施加8Vp-p,5MHz交流电压信号的条件下,实现了酵母菌细胞沿“台阶”形电极边缘直线排列。

利用傅立叶变换研究阔叶材纤维细胞排列

利用傅立叶变换图象处理技术来测定阔叶材横切面纤维细胞排列,把表示每一个纤维细胞的半径为10个像素点的圆盘点图,进行傅立叶变换,再做能量光谱图的角度分布图,其最大值表示纤维细胞的排列。通过傅立叶变换图像处理发现垂柳和闽楠的纤维细胞在斜向上的排列分别为110°和125°。木材纤维细胞排列参数为数字化识别木材提供了新依据。

利用傅里叶变换研究侧柏细胞排列

利用傅里叶变换图像处理技术来测定针叶材侧柏横切面早材细胞排列,把表示每一个细胞的半径为十个像素点的圆盘点图,进行傅里叶变换,再做能量光谱图的角度分布图,其最大值表示细胞的排列。通过傅里叶变换图像处理发现侧柏的细胞在斜向上的排列为15°。木材细胞排列参数为数字化识别木材提供了新依据,也为进一步分析其物理力学性质提供新的理论研究方向。

基于微流控芯片的细胞排列和迁移的实验研究

由于细胞的异质性,细胞的排列和迁移往往是研究者实现各种细胞复杂电操作首要解决的基本问题.利用具有平行电极的微流控芯片,对单一的食管鳞癌KYSE180细胞的迁移运动进行了研究;借助具有变间距的平行电极的微流控芯片,研究了两种混合细胞血癌NB4细胞和酵母菌细胞的迁移规律,并通过COMSOL Multiphysics仿真软件分析了不同细胞的迁移运动随电极宽度和电极间隔宽度的变化而变化的规律.实验结果表明,细胞的迁移运动受制于电极加载信号的电场频率和细胞缓冲液的电导率两个关键因素;混合细胞的迁移实验研究表明在上述条件下细胞分离的最佳频率容易获得,这为基于复杂芯片结构的细胞分选实验奠定了基础。

间隙闭合的形状演化及细胞排列行为

间隙闭合(Gap closure)是胚胎发育、伤口愈合和排除凋亡细胞的关键过程。完美的间隙闭合对组织形成的完整性至关重要。然而,目前对间隙闭合的演化机制尚不清楚。以前的研究表明,细胞伪足的主动伸出和超细胞肌动球蛋白环的收缩是驱动间隙闭合过程的两个主要驱动力。但是这两个驱动力的作用机制不清楚。比如,这两种机制是如何驱动细胞的极化和向间隙内部持续迁移的?哪种机制决定了间隙形状的演化,例如间隙闭合过程中是选择圆形、椭圆,还是狭缝形状?

微加工技术在细胞形状和排列控制中的应用

背景:精确控制细胞形状、实现细胞体外排列对细胞生物学、组织工程和再生医学研究及应用均有极其重要的意义,而目前对控制细胞几何形状和诱导体外排列的方法缺乏系统性的研究和表述。目的:总结并讨论表面化学修饰技术、表面拓扑学改造技术加工制备细胞生长基底的方法,以及实现细胞形状和排列控制的可行性和最新进展。方法:作者检索1995至2017年百链云数据库和Pub Med数据库中与微加工方法对细胞形状和体外排列影响相关的文献,并进行系统整理、归纳总结和分析。结果与结论:随着微纳米加工技术的发展和对细胞生物学行为的深入研究,表面化学修饰、表面拓扑学改造、纤维支架等方法逐步被建立,以实现细胞形状的精确控制和体外排列。表面微图案化、微柱、微孔阵列等拓扑结构能够精确控制细胞几何形状,而基底表面拓扑形貌对细胞排列占据更重要的支配作用,可将基底表面化学修饰作用和拓扑形貌作用相结合更好地实现细胞体外排列。合适的基底结构可用于精确控制细胞的形状、调控干细胞的分化抑或诱导细胞的定向排列、促进细胞融合和分化等。

细胞高通量捕获和排列方法的最新进展

背景:细胞是生命体活动的基本单位,理解生命体过程中的规律,需要以研究细胞为基础来深入探索细胞间的联系和行为。大多数的生物测定都是基于大细胞群体,但是其缺点是无法忽略细胞异质性的影响,并且失去了在细胞应答过程中重要的瞬时数据。目前对实现单细胞捕获和诱导体外排列来研究细胞具体行为的方法缺乏系统性的表述和研究。目的:总结并讨论微流控技术、微接触印刷技术及利用力学、电学及磁学来制作细胞捕获陷阱的方法及实现后续排列、生长、铺展、分化控制的可行性和最新进展。方法:作者检索1995至2017年百链云数据库和Pub Med数据库,纳入与单细胞捕获及筛选微加工方法相关的文献,并进行系统整理、归纳总结和分析。结果与结论:共检索到文献241篇,按照纳入和排除标准筛选后,共纳入35篇文献。通过阅读、总结和分析,结果表明:随着微纳米级加工技术的逐步成熟及它在细胞生物学和医学研究中的逐步深入,微流控技术和微接触印刷技术既是目前研究的重点又被很多研究者进行了一定程度的改进,除此之外一些新的材料也逐步应用。微流控技术在细胞捕获率方面有着领先的优势,而改进后的微接触印刷技术更注重细胞的后续铺展及排列。在不损害细胞活性的前提下,精准的细胞捕获和排列以及合适的后续培养环境,对引导细胞的铺展、融合及分化方面至关重要。

组织工程肌细胞定向排列方法的研究进展

应用计算机检索PubMed数据库及Web of Science数据库,检索关于细胞定向排列方法的文章,中文检索词为"肌细胞排列,组织工程,表面结构约束,表面化学修饰,力学刺激,电磁刺激"。总结近年来关于组织工程肌细胞定向排列方法,对其进行简要的综述,分析关键技术,探讨存在的问题并展望发展前景。肌细胞排列在细胞骨架重组、膜蛋白迁移、核基因表达和ECM重塑的过程中起到至关重要的作用。同时,对组织再生和调节组织的力学性能也有很大的影响。因此,细胞排列成为生物力学,细胞生物学,组织工程和再生医学应用中的关键技术。随着纳米和微制造等技术的发展,目前常用表面结构约束,表面化学修饰,外界刺激等方法,能有效诱导肌细胞定向排列,为进一步的细胞分化和形成肌小管提供条件。但是,目前的研究仍然存在一些不足,例如,马血清对细胞排列分化的促进机制仍不明确,仿生结构研究较少,极低频磁场对细胞排列的影响仍属空白等,是肌肉组织工程亟待解决的技术难点。最后,文章总结了在未来技术发展中,通过细胞精准打印,开发智能材料等新工艺,新材料控制细胞定向排列,不仅奠定了大尺寸三维支架制造和再生医学领域的理论基础,也是功能性肌肉组织的前瞻性研究方向,并将最终实现多层组织的集成,为临床应用提供研究基础。

果蝇卵发育过程中卵上皮细胞的极化与排列行为

目的研究果蝇卵室发育过程中卵上皮细胞的形态与排列行为。方法建立模拟果蝇卵室发育过程的有限元模型,并开发描述材料生长的ABAQUS UMAT用户子程序。基于有限元方法模拟果蝇卵室第8阶段（S8）到第10阶段初始阶段（S10）的发育过程,通过分析上皮细胞层在卵剖面上主应力的方向和面内最大剪应力的分布,预测上皮细胞的极化和排列行为。结果上皮细胞的排列方向与最大主应力的方向一致,而细胞的长细比与其最大剪应力成正比。结论果蝇卵上皮细胞的极化和排列行为由组织内的应力控制。

基于染色质和代谢重塑的力学记忆调控间充质干细胞增殖和平滑肌分化的机制研究

目的干细胞响应和记住来自微环境的力学信号,通过力学记忆调控其命运进而影响疾病治疗和再生效果。本研究旨在探究单轴拉伸载荷下基于染色质和代谢重塑的力学记忆对间充质干细胞的命运调控机制。方法对间充质干细胞加载不同振幅、频率、持续时间和加载周期的间歇单轴拉伸,通过免疫荧光染色,Real-time PCR,转录组测序,si RNA和Western blotting等手段,检测相关蛋白及基因的表达,探究力学记忆相关机制。结果实验结果表明,振幅是间歇拉伸诱导细胞转向后有序排列记忆的主要因素,而频率和持续时间是影响细胞有序排列记忆的次要因素。同时,F-肌动蛋白、黏着斑和细胞核形变比细胞排列更容易被间歇拉伸重塑。其次,发现间歇拉伸可诱导细胞形成转录记忆,并保持持续的高代谢活性。此外,间歇拉伸可促进间充质干细胞的增殖和平滑肌向分化,并通过H3K27me3介导持续性的染色质凝集影响间充质干细胞的分化效率。有趣的是,力学记忆可通过直接接触传递,加载间歇拉伸后的细胞可以重塑静态细胞的代谢稳态,并促进其增殖活性。结论间歇拉伸通过染色质和能量代谢重塑介导的力学记忆促进间充质干细胞的增殖和平滑肌分化。

成骨细胞对不同牵应力的力学生物学响应研究

目的拉伸成骨细胞可以调节细胞的增殖分化等。目前的研究主要集中在应变大小、加载时间和频率上,忽略了不同加载类型产生的各个方向不同应变的影响。考虑到细胞在体内也经受复杂的力学环境,故探究不同加载类型的应变对成骨细胞的影响,可以进一步理解细胞的力学反应机制,并指导组织工程支架设计。方法通过改制Flexcell设备对成骨细胞MC3T3-E1分别施加横向应变与轴向应变的负比值(NR)为0,大小为3%、6%、9%的应变和大小为6%,NR为-1、0和0.2的应变。利用CCK-8检测细胞增殖,通过免疫荧光获得细胞骨架粗细、细胞与细胞核面积等参数,计算YAP表达的核质比。对细胞进行光学拍照,观察牵张类型对细胞排列的影响。结果相较于其他所有应变组,成骨细胞MC3T3-E1在受到应变为6%,NR为0%的应变时,增殖速度更快,细胞核面积和细胞质面积更大,细胞骨架更粗,细胞核厚度更低,细胞核内的YAP增加。大小为6%时,NR为-1的应变没有明显改变细胞的排列,NR为0相比于0.2的应变细胞更快且均匀的垂直牵张方向排列。结论大小为6%,NR为0的应变使细胞骨架变粗,增加了对细胞核的压力,使细胞核变扁,促使YAP向细胞核内转移,从而促进了细胞的增殖。同时该应变也加速了细胞垂直于牵张方向应变排列的过程。

有序排列微模板培养角膜基质细胞及其细胞生物学变化

目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组,平板组作为对照组。将角膜基质细胞悬液以1×105/mL细胞密度接种于培养板中,倒置显微镜下观察细胞生长情况,苏木精-伊红染色观察细胞排列的形态学差异,免疫荧光法检测培养板上细胞的波形蛋白,实时监测显微镜下观察24h窄间隔组细胞的接触指引特性及细胞的动态生长过程。结果培养第1天倒置显微镜下见3组培养细胞贴壁生长状态无明显区别,窄间隔组和宽间隔组细胞逐渐围绕沟槽接触指引生长,表现为有序排列,且窄间隔组较宽间隔组明显。苏木精-伊红染色和免疫荧光染色显示培养的细胞在窄间隔组沟槽的接触指引下呈有序排列,呈现10余层细胞排列的平行板层结构。3组细胞波形蛋白免疫荧光染色均呈阳性反应。实时监测显微镜下可见窄间隔组细胞体部首先贴壁,在接触指引下生长,而细胞在干燥环境下的凋亡始于细胞伪足突起处。结论利用CO2激光打标机制备的有序排列微模板可获得有序排列的角膜基质细胞,有利于在接近生理状态条件下角膜基质层的构建。

剪切应力对生长在微图案表面内皮细胞骨架排列、黏附、迁移和凋亡的影响

背景:微纳米尺寸的表面修饰法为解决心血管植入物材料表面的内皮化问题提供了一个有效方法。剪切应力在心血管植入物内皮化过程中起着重要作用。目的:综述剪切应力对生长在微图案表面上内皮细胞骨架排列、黏附、迁移和凋亡的影响。方法:作者检索2002至2017年Pub Med数据库和中国知网数据库关于剪切应力对生长在微图案表面上内皮细胞影响的文献,英文检索词为"micropattern,flow shear stress,endothelial cells",中文检索词为"微米拓扑结构,微图案,剪切应力,内皮细胞"。结果与结论:对生长在微图案表面的内皮细胞施加平行剪切应力,可促进微丝沿微图案长轴方向排列,促进内皮细胞沿剪切应力方向迁移,上调内皮细胞FAK的磷酸化水平,增强内皮细胞的黏附能力,并改善内皮细胞的活性。有研究认为平行剪切应力促进微管沿微图案长轴方向排列,另有研究认为平行剪切应力对微管排列无影响。有些文献发现垂直剪切应力破坏生长在微图案表面的内皮细胞的微丝和微管结构,减弱微丝和微管沿微图案长轴方向排列的程度,降低内皮细胞的黏附能力和细胞活性;有些文献发现垂直剪切应力未破坏生长在微图案表面内皮细胞骨架的结构与排列,仍能促进内皮细胞沿剪切应力方向的迁移。此外,剪切力大小影响内皮细胞的迁移,随着剪切应力的增大,生长在微图案表面上的内皮细胞沿剪切应力方向迁移的数量增多。

石墨烯远红外光波房对红细胞缗钱状排列的影响

目的观察石墨烯远红外光波房改善红细胞缗钱状排列的效果。方法29例试验志愿者按随机数字表法分为治疗组(21例)与空白对照组(8例)。治疗组用远红外光波房治疗30 min,空白对照组不接受任何试验措施干预。观察两组红细胞缗钱状排列改善情况。结果治疗组处理后红细胞缗钱状排列的即时改善效果明显,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。连续干预5 d,末次使用设备4 h后,治疗组的红细胞缗钱状排列得到改善,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论石墨烯远红外光波房可改善红细胞缗钱状排列。

心肌条件培养液对体外骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的:观察心肌培养液中可溶性细胞因子对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞诱导分化过程的影响;方法:10μmol/L 5氮胞苷(5-aza)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化后,实验分为两组:5-aza诱导组常规培养基培养,5-aza诱导+心肌条件培养组以1∶1混合的心肌条件培养液培养,观察与比较两组细胞形态,免疫细胞化学法和western blot技术分析心肌特异蛋白表达。结果:5-aza组细胞排列紊乱,5-aza诱导+心肌条件培养组细胞呈集落样排列,可见肌管形成,自诱导2周开始两组均见肌钙蛋白I(troponin I)阳性细胞,而troponin I、结蛋白(desmin)、连接蛋白-43(connexin-43)在诱导2周开始表达,3、4周达高峰,各时间点两组蛋白表达没有明显差异;结论:心肌条件培养液对心肌细胞的体外分化过程没有促进作用,但是可以加强体外诱导生成的心肌样细胞之间的有机排列。

传出迷走神经电刺激对大鼠肠缺血再灌注后肝细胞超微结构的影响

目的观察传出迷走神经电刺激对大鼠肠缺血再灌注后肝细胞超微结构的影响。方法24只Wis-tar大鼠双侧颈迷走神经切断后,随机分为3组(n=8):①肠缺血再灌注组(Ⅱ/R组):暴露腹腔后夹闭肠系膜上动脉(SMA)1 h,开放再灌注2 h;②传出迷走神经刺激组(EVNS组):在夹闭前及再灌注开始均以5 V,2 ms和1 Hz强度的电能持续刺激迷走神经远端20 min;③对照组(C组):假手术处理即仅暴露腹腔,不行SMA夹闭及电刺激。所有动物在再灌注2 h时处死,取一小块左肝中叶组织行电镜检查,并测量肝细胞线粒体的二维平面形态计量学参数和三维平面形态计量学参数。结果电镜下观察,C组的肝细胞排列整齐,线粒体正常。Ⅱ/R组的肝细胞内粗面内质网扩张,线粒体明显肿胀、嵴排列紊乱不清,胞浆疏松化;细胞间隙增宽,连接分开,异染色体增多并有边集,部分肝细胞核固缩、变小,有变性和坏死的肝细胞。EVNS组的线粒体结构损伤较上组明显减轻;细胞间连接可见,细胞核稍肿胀,核膜基本完整,偶见核固缩。与Ⅱ/R组比较,C组及EVNS组的线粒体数、表面积密度、粒子数密度、比表面均较大(P<0.05,或P<0.01),面积、周长均较小(P<0.05)。结论传出迷走神经电刺激能减轻Ⅱ/R后肝细胞超微结构病变,对Ⅱ/R肝损伤有显著保护作用。

用于流式细胞仪的超声聚焦系统的仿真与设计

介绍了一种利用超声驻波对颗粒进行二维聚焦的方案,其可用于流式细胞仪中微量(少于82μL)细胞样品的上样,无需鞘液即可实现颗粒在管道中央的逐个排列,并能以高至0.5 m L/min的速度依次通过检测区。该方案避免了颗粒在管道中的随机分布现象,提高了流式细胞检测的准确性,分析后的样品还能被无稀释地回收再利用。从驻波形成、声阻抗匹配、颗粒在声场中的受力分析等理论出发,着重仿真分析了驻波场中颗粒在不同参数下的运动路径。在理论模型的基础上搭建了1.462 MHz频率驱动的方形毛细管实验平台,利用10和20μm直径的聚苯乙烯微球验证了超声聚焦颗粒的可行性,实验表明低流速、高声场强度时聚焦更紧密,大颗粒比小颗粒更易聚焦。该结论与仿真结果一致。

SD大鼠肌硬膜桥的细胞发育特征

肌硬膜桥是枕下区深层肌经寰枕后膜、寰枢后膜连接上颈段硬脊膜的结缔组织桥,目前对肌硬膜桥的组成、连接方式及纤维组成等已有详细描述,但关于肌硬膜桥发育学方面的研究甚少。SD大鼠已被证实存在肌硬膜桥结构,本研究以SD大鼠胚胎(E)为研究对象,采用组织学方法观察胎鼠颈枕部及肌硬膜桥在各发育时期的细胞组成及形态变化,以揭示肌硬膜桥的细胞发育规律。胎鼠标本制作石蜡切片,并进行HE及铁苏木染色后观察枕颈部交接区的细胞组成及形态特点。结果显示:①E12~E13d,该区域的细胞成分以星形多突起状、核仁明显、胞质浅染的间充质细胞为主,同时存在少量散在的梭形成纤维细胞;②E14~E17d,该区域的细胞成分以成纤维细胞为主,可见成纤维细胞核仁明显、细胞突起交织成网状,且细胞排列呈腹侧紧密、背侧松散的分层现象;③E18~E21d,可见在该区域由紧密排列的成纤维细胞和纤维细胞组成硬脊膜,其与背侧的枕下肌组织间为排列松散、交织成网状的成纤维细胞构成的寰枕后膜和寰枢后膜,呈长梭形、胞体较小、胞质较少、胞核深染的纤维细胞也开始出现。综上,肌硬膜桥细胞在E13d以前,颈枕交界区细胞以间充质细胞为主;E13~E17d,以成纤维细胞为主;E18d开始,成纤维细胞逐渐转化为纤维细胞。