大豆蚜细胞色素氧化酶Ⅱ基因的克隆及其在捕食性天敌昆虫鉴定中的应用

利用通用引物,对大豆蚜Aphis glycinesMatsumura的细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列进行克隆和测序。测得的序列长度为810 bp,并与已在GenBank上登录的其他蚜虫COⅡ基因序列进行比较分析,验证其同源性,同时将该序列在GenBank进行了登记(登录号为DQ265743)。根据此片段的碱基序列设计了1对大豆蚜特异引物,其扩增片段约为270 bp;种特异性检验结果表明,该引物只对大豆蚜具有扩增能力,对其他相关蚜虫种类不具有扩增效果;并用此引物对大豆蚜捕食性天敌进行定性检测,结果表明,在取食过大豆蚜的异色瓢虫Harmonia axyridis、龟纹瓢虫Propylaeajaponica、大草蛉Chrysopa septempunctata幼虫以及小花蝽Orius similes成虫和幼虫等捕食性昆虫的中肠中均能检测到大豆蚜的DNA片段;而在未取食蚜虫的上述天敌中却未能扩增出来。

我国不同地区二尾蛱蝶线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ的DNA序列差异

通过对我国不同地区二尾蛱蝶线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ (COⅡ )DNA部分序列的比较分析 ,研究了二尾蛱蝶的遗传分化以及台湾海峡对其分化的影响。台湾和大陆二尾蛱蝶的COⅡ基因有0 75 %～ 1%的差异 ,估算其分化时间大约在 37 5～ 5 0万年前 ,台湾海峡可能有效地阻隔了两岸二尾蛱蝶的基因交流 ;台湾和大陆二尾蛱蝶间明显的基因差异可能与它们分属不同亚种有关 ,而大陆上不同地区的二尾蛱蝶也有较大的基因差异 ,推测大陆二尾蛱蝶可能存在 2个亚种。

幽门螺杆菌对细胞色素氧化酶基因Ⅱ表达的影响及其临床意义

目的观察幽门螺杆菌(H.pylori)培养滤液作用于胃癌细胞后,细胞色素氧化酶Ⅱ(COX-Ⅱ)mRNA及其蛋白表达的变化,探讨H.pylori致胃癌的可能分子机制。方法将6μl/mlH.pylori培养滤液与胃癌细胞分别作用4、8、12小时,收集细胞,提取RNA,应用RT-PCR和Western blot法检测各时间点COX-ⅡmRNA及其蛋白表达。结果正常情况下,胃癌细胞COX-ⅡmRNA稳定表达。H.pylori培养滤液分别作用4、8、12小时后,其表达量呈缓慢下降趋势,8、12小时的表达量显著低于对照组(P<0.05)。COX-Ⅱ蛋白的表达呈现相似的趋势。结论H.pylori可引起胃癌细胞线粒体编码基因COX-ⅡmRNA和蛋白的表达障碍,影响线粒体功能。

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查 2 5例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况 ,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病 (AD)性老年痴呆发生发展的关系。 方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板 ,进行巢式PCR扩增 ,最后采用DNA序列分析鉴定突变。 结果 在正常老人组 ,只扩增了 2 80bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因 (COX2 )扩增片段 ,而在老年痴呆患者中出现了 4 6 4bp和 2 80bp的多态性扩增片段 ,并且发现了 1个 32 0bp的新的线粒体DNA缺失片段 ,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象 ,COX2基因的 1条单链在np75 0 3处断裂 ,另 1条单链在np7785处断裂 ,这两个断裂的游离片段通过插入 1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。 结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。

核因子κB亚基65及细胞色素C氧化酶-Ⅱ在大鼠急性肝衰竭模型中的变化及意义

目的观察核因子κB亚基65(nuclear factor-κB,NF-κB p65)及细胞色素C氧化酶-Ⅱ(cytochrom eCoxidase-Ⅱ,COX-Ⅱ)在大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)模型中的变化。方法 Sprague-Dawley雄性大鼠40只随机分为5组:对照组、ALF4h组、ALF8h组、ALF12h组和ALF24h组。ALF组采用D-氨基半乳糖(800mg/kg)和脂多糖(100g/kg)联合腹腔注射构建ALF模型,对照组注射同等体积的0.9%氯化钠溶液。分别检测各组的ALT、AST、TBIL、ALB、PT、PTA及观察各时间点肝脏病理变化;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏内NF-κBp65的mRNA水平,分光光度法检测各组大鼠肝脏线粒体中的COX-Ⅱ活性。结果光镜结果显示,ALF8h组可见明显肝细胞凋亡,而12h组和24h组可见明显肝细胞坏死。ALF组中8h、12h及24h肝脏NF-κBp65的mRNA水平明显低于对照组(P均<0.001),24h最低。COX-Ⅱ的活性在ALF4h开始升高,8h达到高峰(与对照组比较,P=0.008),12h开始下降,24h下降更为明显。结论 ALF大鼠肝脏NF-κBp65的mRNA水平降低,肝脏线粒体COX-Ⅱ活性在凋亡阶段升高,后期降低。二者均参与了ALF中肝细胞凋亡的发生,同时NF-κBp65还可能抑制了ALF过程中肝细胞的再生。

乳腺癌线粒体细胞色素氧化酶-Ⅱ基因突变检测

目的研究乳腺癌患者线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶-Ⅱ区基因突变情况。方法采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对20例乳腺癌患者癌组织和和癌旁组织线粒体DNA的细胞色素氧化酶-Ⅱ区扩增并测序,检测突变情况。结果 20例乳腺癌患者癌组织中共有4例mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变,癌旁组织中共有2例mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变。在20例乳腺癌组织中共有4个位点发生了突变,其中引起编码氨基酸改变的突变有1个。结论 mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区突变与乳腺癌发生、发展有相关性。

益气活血中药复方对CVB_3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ表达的影响

目的:研究益气活血中药复方调控CVB3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochromeC oxidase subunitⅠ)及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ)表达的作用机制。方法:本实验用Wistar大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3(CVB3)感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆受CVB3攻击的宿主细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因。结果:细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ在中药组中呈高表达,病毒组中表达减弱或被抑制。结论:益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ的表达,有效保护心肌,阻断病程进度,实现治疗病毒性心肌炎的目的。

高盐摄入对盐敏感者血清细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ的影响

目的探讨高盐干预对盐敏感者血清细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ,COX-Ⅱ)水平的影响。方法选取陕西蓝田农村汉族44名成年人参与为期2周的慢性盐负荷试验,试验阶段包括基线期3天,低盐期(每天摄盐3 g,相当于钠51.3 mmol/d)和高盐期(每天摄盐18 g,相当于钠307.8mmol/d)各7天。每个阶段均测量血压,并收集血、尿标本。用ELISA法测定血清COX-Ⅱ浓度。结果盐敏感者中,低盐期血清COX-Ⅱ水平较基线期显著升高[(1.14±0.12)ng/ml比(1.45±0.13)ng/ml,P=0.019];而高盐饮食能够明显降低血清COX-Ⅱ的水平[(1.45±0.13)ng/ml比(1.02±0.13)ng/ml,P=0.003],而在盐不敏感者中未发现此变化。此外,两组血清COX-Ⅱ水平变化与收缩压呈显著负相关。结论膳食盐.的摄人能够影响盐敏感者血清COX-Ⅱ浓度,提示COX-Ⅱ可能参与血压盐敏感性的形成。

mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ突变与胃癌相关性的研究

目的检测胃癌患者线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶-Ⅱ突变情况,探讨mtDNA基因突变与胃癌发生的关系及其作用机制。方法采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对50例胃癌患者癌组织细胞色素氧化酶-Ⅱ扩增并测序,检测突变情况。结果 50例胃癌患者中共有13例患者mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ检测到突变,突变率为26%,类型以点突变G→A为主。在13例突变的胃癌组织中共有10个细胞色素氧化酶-Ⅱ发生了突变,其中引起编码氨基酸改变的突变有3个。结论mtDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ突变与胃癌发生发展有相关性。

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。

幽门螺杆菌对食管癌细胞凋亡及表达COXⅡ、Bax、Caspase-3的影响

目的:观察幽门螺杆菌(H.pylori,HP)作用于食管癌细胞(ECa-109)后细胞凋亡的情况以及细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochrome oxidaseⅡ,COXⅡ)、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达的变化,探讨H.pylori致癌的分子机制。方法:将H.pylori与ECa-109分别作用4、8、24 h,收集各组细胞,流式细胞术(FACS)检测凋亡情况;Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅡ、Bax、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达。结果:随着共培养时间的延长,COXⅡmRNA和蛋白的表达逐渐下降,而Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达逐渐上升,ECa-109凋亡增加。结论:H.pylori可抑制食管癌细胞线粒体编码基因COXⅡmRNA的表达,从而影响线粒体功能;H.pylori在体外可通过线粒体途径上调Bax、Caspase-3表达,从而诱导ECa-109凋亡。

酒精对小鼠NIT-1细胞胰岛素分泌及COXⅡ基因表达的影响

目的:观察酒精对小鼠NIT-1细胞胰岛素分泌功能的影响并初步探讨其机制。方法:体外培养的小鼠NIT-1细胞,经不同浓度酒精(0、50、100、200、400mmol/L)作用6、12、24h后,用放免法测定NIT-1细胞分泌胰岛素情况,半定量RT-PCR方法检测细胞色素氧化酶Ⅱ(cytochromeoxidaseⅡ,COXⅡ)基因mRNA的表达。结果:酒精作用6h,NIT-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加;作用12h、24h,葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低。酒精作用6h,COXⅡmRNA表达升高,12h表达开始降低,24h时高浓度组表达呈显著性降低。结论:酒精可增加或降低NIT-1细胞胰岛素分泌,与酒精作用时间、浓度有关。酒精导致COXⅡmRNA表达水平的改变很可能是酒精影响NIT-1细胞胰岛素分泌的机制之一。

抗霉素A抑制PC12细胞线粒体COⅡ基因表达

采用不同浓度的抗霉素 A(一种能提高线粒体内活性氧水平的线粒体抑制剂 )处理 PC12细胞 ,利用血细胞计数、台盼蓝排除法以及 MTT法进行细胞活性检测。实验证明 ,当抗霉素 A的浓度达到 15 0 μmol/L时 ,PC12细胞开始出现损伤 ;进一步采用 RNA斑点杂交和 RT-PCR技术分析发现抗霉素 A所致的细胞损伤和线粒体内细胞色素 C氧化酶亚基 (CO )基因表达下降有关。本研究证实线粒体介导的活性氧的产生能早期诱导线粒体细胞色素氧化酶的活性的改变 ,逐步引起

白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞氧化损伤的影响

目的探讨白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤干预的可能机制。方法以甲醛损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型,用不同浓度(6.251、2.5、255、01、00μmol/L)的白藜芦醇预处理PC12细胞2 h后,加入终浓度为80μmol/L甲醛作用24 h,并设氨基胍100μmol/L为阳性对照组。采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测细胞活力;分光光度法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;硫代巴比妥酸法测定MDA含量;黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;二硫对二硝基苯甲酸(DTNB)比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(iNOS)活性;并收集各组细胞,检测细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及mRNA的表达;Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞技术检查细胞凋亡情况。结果白藜芦醇能明显改善甲醛所致PC12细胞损伤,与甲醛处理组相比,细胞存活率随着白黎芦醇浓度的增加而加强,且100μmol/L白藜芦醇组细胞存活率为(92.66±3.27)%,高于氨基胍阳性对照组(〔82.18±2.06)%;〕在白黎芦醇6.25～100μmol/L浓度范围内,SOD、GSH-Px活性、COⅡ蛋白及mRNA表达水平随着白藜芦醇浓度增加而逐渐升高;LDH漏出量、NO、MDA含量i、NOS活性随着处理浓度的增加而逐渐降低。结论白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤具有保护作用,在一定范围内呈剂量-效应关系;能有效改善甲醛所致PC12细胞的氧化损伤,提高细胞存活率;这种抗氧化活性可能与抑制甲醛/ROS、甲醛/NOS/NO氧化应激途径、减轻线粒体损伤有关。

多刺蚁属细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ序列变异及其进化关系

从Gen Bank下载多刺蚁属26个不同种的细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COXⅡ)蛋白部分氨基酸序列进行分析,研究多刺蚁细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的氨基酸序列变异和系统进化关系。多刺蚁属种间存在氨基酸变异位点84个,占总氨基酸数目的 36%,而N端跨膜螺旋区氨基酸保守性最高。采用MEGA 4.0构建的邻接法(NJ)系统发育树表明:佛瑞尔刺蚁(Polyrhachis foreli)和甲胄刺蚁(Polyrhachis andromache)聚为一枝,双钩刺蚁(Polyrhachis bihamata)和叉形刺蚁(Polyrhachis ypsilon)聚为一枝,麦凯刺蚁(Polyrhachis mackayi)、澳洲刺蚁(Polyrhachis australis)和软毛刺蚁(Polyrhachis pilosa)三个种聚为一枝,这些种间亲缘关系较近;基于COXⅡ蛋白序列的系统发育关系分析与基于细胞色素b蛋白的系统发育关系既存在一致性,也存在一定的差异。多刺蚁属中序列变异度最大的4个种的COXⅡ对应的3D结构在螺旋和折叠排列方式上完全相同,表明多刺蚁属内COXⅡ序列变异并不影响其结构的形成。

核糖体小亚基RNA和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ基因在中国利什曼原虫系统发育学分析中应用的比较

目的比较核糖体小亚基RNA（small subunit ribosomal RNA．SSUrRNA）和细胞色素氧化酶亚单位Ⅱ（cytochrome oxidaseⅡ，COXⅡ）这2种分子标志在中国利什曼原虫系统发育学分析中的不同。方法提取利什曼原虫各虫株核基因组和线粒体基因组．PCR方法扩增中国不同地区利什曼原虫SSUrRNA和COXⅡ基因．扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序．序列碱基通过Clustal X软件比对，用DAMBE软件进行单倍型分析、Mega4软件计算遗传距离，Mrbayes3．1．2软件构建贝叶斯进化树。结果COXⅡ分析结果表明．流行于中国的利什曼原虫虫株未形成一个单系群：GS7和XJ771属于杜氏利什曼原虫复合体；10株利什曼原虫形成的6个单倍型（MHOM／CN/93/GS7,IPHL／CN／77／XJ771,MHOM／CN／84／JS1和MGER／CN／60／GS．GER20除外）形成1个单系群：而SSUrRNA分析结果表明：11株利什曼原虫（IPHL／CN／77／XJ771，MHOM/CN，93／GS7，MRH0／CN／88／KXG-2，MHOM／CN／84／JS1．MGER／CN／60／GS．GER20除外）形成一个独立枝；江苏株JS1和热带利什曼原虫聚在一起，不与杜氏利什曼原虫聚在一起。结论SSUrRNA和COXⅡ得出的结果较一致．但COXⅡ基因在分析利什曼原虫的系统发育关系时．可能是一个更可靠的遗传标志。

高本底辐射地区居民线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因表达水平研究

目的研究低剂量长期天然放射性高本底辐射地区（HBRA）人群的周围血线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ（COXⅡ）基因表达水平。方法随机选择HBRA和对照地区（CA）各50名年龄为50．0—59．0岁男性居民作为HBRA组和CA组。采集2组人群肘静脉血分离白细胞和血浆，实时荧光定量聚合酶链式反应测定白细胞中COX1ImRNA相对表达水平，酶联免疫吸附实验测定血浆中COXⅡ蛋白水平。结果HBRA组人群白细胞COXⅡmRNA相对表达水平高于CA组[（13．01±1．76）vs（1．00±0．23），P〈0．01]，HBRA组人群血浆中coxI蛋白水平与CA组比较，差异无统计学意义[1．10（0．58，1．56）vs0．88（0．44，1．57）mg／L，P〉0．05]。结论低剂量长期天然放射性高本底辐射能导致线粒体COXⅡ基因表达水平上升，可能与适应性反应机制相关。

中国境内不同地理型东方蜜蜂线粒体DNA tRNA^(leu)～COⅡ基因多态性研究

【目的】从线粒体水平上探讨中国境内不同地理型东方蜜蜂的系统发育关系,为东方蜜蜂亚种分化的研究及我国境内东方蜜蜂资源的保护与合理开发利用提供基础资料。【方法】采用公开的E2、H2引物对11个不同地理型东方蜜蜂线粒体DNA tRNAleu～COⅡ基因进行了PCR扩增、测序,并利用相关软件和网站进行了序列比较分析。【结果】该序列长度为471bp;序列中共有9个位点发生变异;序列相似性均在99%以上;限制性酶切分析表明:云南保山东方蜜蜂缺少一个SwaⅠ酶切位点;部分编码蛋白序列比对表明,海南海口和吉林安图东方蜜蜂各有一个氨基酸发生变异。与GeneBank上公开登录的国内外有关东方蜜蜂相关序列的比较表明,单纯利用非编码区序列对比,不能把日本蜜蜂同中国大陆的东方蜜蜂区别开来;COⅡ基因部分序列对比显示,东方蜜蜂的线粒体类型包括:日本-韩国型、中国大陆型、中国台湾型、马来西亚沙巴州-印度黑色蜜蜂型、中国海南型、印度黄色蜜蜂型、泰国南部型和印度黑色蜜蜂型。【结论】中国境内不同地理型东方蜜蜂存在着较明显的遗传分化,其中海南东方蜜蜂由于长期的海岛隔离形成了一个独特的类群,支持了通过形态学认定的海南东方蜜蜂为东方蜜蜂的一个新亚种的观点。本研究部分测序结果已在美国国家生物信息中心(NCBI)网站GeneBank上登录,登录号为:DQ385854,DQ388602～DQ388609。

天敌体内玉米蚜的COⅡ标记检测

以玉米蚜Rhopalosiphum maidis Fitch及玉米田的捕食性天敌为研究对象,筛选1对特异扩增玉米蚜细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列片段的引物。种特异性检验表明,该引物只对玉米蚜基因组DNA具有扩增效果,对与其同域发生的其他种类不具扩增作用;室内以该引物检测喂食单头玉米蚜的异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)成虫和大草蛉Chrysopa pallens(Rambur)成虫腹内靶标食物的衰变情况,结果表明,异色瓢虫成虫和大草蛉成虫阳性比率的半衰期分别为喂食后2·814和2·441h;对玉米田间捕食性天敌的检测结果表明,在所检测的6类群13种捕食性天敌中,大灰食蚜蝇幼虫、草蛉幼虫、异色瓢虫成虫和幼虫、龟纹瓢虫成虫和幼虫对玉米蚜的捕食作用检出率较高,大于40%。