基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统的猪脑心肌炎病毒样颗粒的表达及鉴定

脑心肌炎(encephalomyocarditis)是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)引起的以猪的脑炎、心肌炎为主要特征的病毒性人畜共患病,可感染多种哺乳动物,目前国内尚无有效疫苗。本研究旨在开发一款安全有效的疫苗以防控该病。采用P1、3CD共表达的构建策略,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得EMCV病毒样颗粒(virus-like particals,VLPs)并将其免疫小鼠,初步评价其在小鼠体内的免疫应答效果。结果显示,免疫组小鼠特异性抗体滴度达到1∶192以上,中和抗体滴度达到1∶64以上,且与ISA206佐剂混合使用可诱导机体产生更高的抗体水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α细胞因子水平均可达到20 pg·mL^(-1),且明显高于PBS组。综上,本研究获得的EMCV病毒样颗粒疫苗可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫应答,还能诱导炎症细胞因子的产生,有助于激发机体的免疫反应,增强疫苗的保护效果,为EMCV的防控提供了理论依据和技术储备。

基于多模态超声图像特征的Logistic回归模型预测三阴性乳腺癌病灶肿瘤浸润淋巴细胞表达的临床价值

目的探讨基于多模态超声(包括二维超声、剪切波弹性成像、超声造影及自动乳腺全容积成像)图像特征的Logistic回归模型术前预测三阴性乳腺癌(TNBC)病灶肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)表达的临床价值。方法选取经病理证实的TNBC女性患者99例,根据TILs表达水平将其分为TILs低表达组41例(TILs表达水平<20%)和TILs高表达组58例(TILs表达水平≥20%),应用二维超声获取病灶形态、方位、边缘、内部回声、后方回声、钙化等特征,剪切波弹性成像检测病灶剪切波速度(SWV),自动乳腺全容积成像获取病灶有无汇聚征、晕环征、导管改变等特征,超声造影获取起始增强时间、增强强度、增强方向、增强模式、局灶性充盈缺损、周围血管征、增强后病变范围等特征。比较两组多模态超声图像特征的差异;应用多因素Logistic回归分析筛选预测TNBC病灶TILs高表达的独立影响因素,并建立回归模型。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析回归模型预测TNBC病灶TILs高表达的诊断效能。结果TIls高表达组二维超声图像特征形态规则、边缘光整、后方回声增强、内部回声不均匀,以及超声造影图像特征高增强、局灶性充盈缺损占比均高于TIls低表达组,差异均有统计学意义(均P<0.05);两组自动乳腺全容积成像特征及SWV比较差异均无统计学意义。多因素Logistic回归分析显示,形态规则、边缘光整、后方回声增强、高增强及局灶性充盈缺损均为预测TNBC病灶TILs高表达的独立影响因素(OR=6.858、3.824、5.909、1.945、6.522,均P<0.05);建立的回归模型为:Logit(P)=-2.989+1.925×形态规则+1.341×边缘光整+1.776×后方回声增强+0.665×高增强+1.875×局灶性充盈缺损;其预测TNBC病灶TILs高表达的ROC曲线下面积为0.772。结论基于多模态超声图像特征的Logistic回归模型对术前预测TNBC病灶TILs表达有一定的临床价值。

哺乳动物细胞表达系统研究进展

哺乳动物细胞表达系统具有强大的翻译后修饰功能,表达的重组蛋白更接近人源构象,因此被广泛用于治疗性重组蛋白的生产,其中应用最广泛的是中华仓鼠卵巢细胞。基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等研究的不断深入促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。本文立足于哺乳动物细胞表达系统的研究现状,对表达载体的优化、宿主细胞和位点特异性重组等方面的最新进展进行综述。

血清微小核糖核酸-133a、微小核糖核酸-126、髓系细胞表达触发受体-1、肺表面活性蛋白A表达水平与脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征风险及预后关系

目的:研究血清微小核糖核酸-133a(miR-133a)、微小核糖核酸-126(miR-126)、髓系细胞表达触发受体-1(TREM-1)、肺表面活性蛋白A(SP-A)表达水平与脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)风险及预后的关系。方法:将248例脓毒症患者根据其是否发生ARDS分为无ARDS组(97例)和ARDS组(151例),统计两组血清miR-133a、miR-126、TREM-1、SP-A表达水平;分别根据脓毒症并发ARDS患者病情严重程度及入院后28 d预后情况将其分为轻度组(51例)、中度组(73例)、重度组(27例)及存活组(122例)、死亡组(29例),比较不同病情严重程度及预后脓毒症并发ARDS患者血清miR-133a、miR-126、TREM-1、SP-A表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-133a、miR-126、TREM-1、SP-A对脓毒症并发ARDS患者预后的预测价值。结果:ARDS组血清miR-133a、miR-126、TREM-1表达水平高于无ARDS组,血清SP-A表达水平低于无ARDS组(均P<0.05)。轻度组、中度组、重度组血清miR-133a、miR-126、TREM-1表达水平呈升高趋势,血清SP-A表达水平呈降低趋势,组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。死亡组血清miR-133a、miR-126、TREM-1表达水平高于存活组,血清SP-A表达水平低于存活组(均P<0.05)。血清miR-133a、miR-126、TREM-1、SP-A联合预测脓毒症并发ARDS患者预后的曲线下面积(AUC)值高于四者单独检测(均P<0.05);敏感度比较,血清SP-A、TREM-1高于血清miR-133a、miR-126及联合检测,血清SP-A高于血清TREM-1,联合检测高于血清miR-133a、miR-126(均P<0.05);特异度比较,血清miR-133a高于血清TREM-1、SP-A及联合检测,血清miR-126、联合检测高于血清TREM-1、SP-A(均P<0.05)。结论:血清miR-133a、miR-126、TREM-1、SP-A表达水平与脓毒症并发ARDS患者病情的发生和发展均关系密切,四者联合对脓毒症并发ARDS患者预后具有较好的预测效果。

人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究

通过PCR法直接克隆了 2 .36 6kb的人乳铁蛋白基因cDNA序列及 80 0bp的山羊 β.M乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,并连接到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA的重组质粒pLNCXHLF ,并导入到小鼠乳腺癌细胞株MA.M 782中 ,G418及PCR筛选获得阳性单克隆细胞 ,增殖后 ,转染细胞利用海藻酸钠固定化包埋培养 ,经激素诱导 ,培养液上清通过Western印记检测证明 ,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白 ,分子质量为34kDa;ELISA法测出 ,每升培养基 (含 10 5个细胞 )重组蛋白最高表达量为 6 5mg ;抗菌实验表明 ,所获得的重组人乳铁蛋白具有抑制大肠杆菌生长的作用 ,而且比人乳铁蛋白标准品作用更强。

电针对急性痛风性关节炎大鼠踝关节髓样细胞表达激发受体表达的影响

目的探讨电针对急性痛风性关节炎（AGA）大鼠受试踝关节滑膜组织髓样细胞表达激发受体（TREM）-1表达的影响。方法将40只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、电针组,每组各10只;正常组常规喂养,其余采用尿酸钠溶液注射法建立AGA模型。造模前2 d,正常组与模型组按20 ml/kg予以生理盐水灌胃,西药组按1 mg/kg予以秋水仙碱溶液灌胃,电针组选取受试侧三阴交、解溪、昆仑,频率1.5~2 Hz,电压9V,电流强度1~3 m A,疏密波,留针20 min,1次/d,连续9 d。分析各组大鼠关节功能障碍,采用ELISA法检测受试踝关节滑膜组织中肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-1β的含量,采用免疫组化及Western blot法检测TREM-1表达。结果与正常组比较,模型组大鼠功能障碍指数显著增高（P〈0.01）,TNF-α和IL-1β含量显著增高（P〈0.05）,受试踝关节滑膜组织TREM-1表达明显增加（P〈0.05）;与模型组比较,西药组和电针组大鼠功能障碍指数显著降低（P〈0.01）,TNF-α和IL-1β含量显著降低（P〈0.05）,受试踝关节滑膜组织TREM-1表达明显降低（P〈0.05）;西药组与电针组比较,均无统计学意义（P〉0.05）。结论电针治疗AGA的机制可能是通过抑制TREM-1的表达。

APS IgG通过非Fc受体途径诱导血液单核细胞表达TF活性

目的 :探讨抗磷脂综合征 (AntiphospholipidSyndrome ,APS)患者血清IgG体外诱导血液单核细胞表达组织因子(TissueFactor,TF)活性的作用及其作用途径。方法 :利用纯化的APS血清IgG及其F(ab’) 2 片段 ,以及抗磷脂结合蛋白 (如 β2glucoproteinⅠ ,β2 GPI)单克隆抗体RP 1分别刺激新鲜分离的外周血单核细胞 ,通过因子Xa的生成量 ,判断单核细胞TF活性的表达。结果 :与健康人血清IgG比较 ,APS患者血清IgG以及RP 1显著增强单核细胞的TF活性 ;外源性 β2 GPI可加强APSIgG的这一诱导作用 ;从APSIgG中纯化出的F(ab)’2 片段具有与完整IgG分子相同的刺激效应。结论 :抗磷脂抗体 ,主要为抗β2 GPI,以与抗原特异结合方式 ,通过非Fc受体途径诱导血液单核细胞表达TF活性 ,成为APS患者血栓形成的机理之一。

牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化E．coli BL21（DE3），成功地获得了重组菌E．coli BoPrP（23～242）、E．coli BoPrP（100～242）、E．coli CaPrP（25～241）和E．coli CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。

神经前体细胞表达下调蛋白9在胰腺癌组织中的表达及临床意义

目的检测神经前体细胞表达下调蛋白(NEDD)9在胰腺癌和癌旁组织的表达情况,分析其与胰腺癌进展、预后的关系。方法收集2005年8月-2010年12月于无锡市第三人民医院治疗的98例胰腺癌患者的癌和癌旁组织样本,应用免疫组化技术检测患者胰腺癌和癌旁组织中NEDD9的表达,并对NEDD9表达与胰腺癌临床病理特征的关系进行分析。计数资料组间比较采用χ2检验。结果胰腺癌组织中NEDD9的高表达率明显高于癌旁组织(57.1%vs 41.8%,χ2=4.592,P=0.032)。胰腺癌组织NEDD9的表达与患者TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移相关(χ2值分别为45.02、20.41、36.21,P值均<0.001);与性别、年龄、肿瘤部位、有无肝转移无相关性(P值均>0.05)。结论 NEDD9可能在胰腺癌的发展和侵袭转移中起着一定的作用,有可能作为评估胰腺癌预后的分子指标和治疗靶点。

Notch信号分子于小鼠牙髓干细胞样细胞表达的研究

目的 研究Notch基因在小鼠牙髓干细胞样细胞表达。方法 采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液 ,调整细胞密度为 1× 10 4 个 孔细胞 ,干细胞培养液培养 14d,挑选细胞克隆扩增 ,提取细胞的总RNA ,反转录聚合酶联反应 (RT_PCR)检测Notch基因的表达。结果 小鼠牙髓细胞呈集落状生长 ,克隆形成率约为 1 6～ 2 5个 10 4 细胞 ,所形成的集落细胞结合紧密 ,细胞胞体小、胞核大 ,RT_PCR结果显示Notch的mRNA在牙髓干细胞样细胞中有表达。结论 培养的集落状生长的小鼠牙髓细胞具有干细胞增殖快的特性 ,Notch基因于牙髓干细胞中表达 。

降钙素原、髓系细胞表达的触发受体-1联合临床肺部感染评分对呼吸机相关性肺炎的早期诊断价值

目的:探讨降钙素原(PCT)、髓系细胞表达的触发受体-1(TREM-1)联合临床肺部感染评分(CPIS)对呼吸机相关性肺炎(VAP)早期诊断的临床意义。方法:采用前瞻性观察性研究方法,以78例有创机械通气患者为研究对象,所有患者均在机械通气后第1、3、7天采集外周血及肺泡灌洗液标本并进行检测,同时进行CPIS,根据治疗后评估,将78例患者分为VAP确诊组(45例)与非VAP确诊组(33例),应用ROC曲线评价PCT、TREM-1、CPIS联合指标对VAP的早期诊断价值。结果:两组的PCT、TREM-1、CPIS差异有统计学意义(P<0.01)。第3天联合指标的诊断效能最高,PCT、TREM-1、CPIS联合指标对诊断VAP的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为80.4%、100.0%、93.5%、100.0%。结论:结合PCT、TREM-1、CPIS综合分析可以显著提高诊断的特异性,对VAP的早期诊断有较好的实用性。

白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p的原核细胞表达及鉴定

目的原核细胞表达白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p,鉴定重组蛋白质的抗原性。方法用比对软件对白念珠菌H3K4甲基转移酶与其他物种甲基转移酶进行比对。选择与人类无同源性的抗原特异性片段,以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Set1-208p的编码基因,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白质表达。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊侵袭性白念珠菌感染(IC)患者血清进行抗原性鉴定。结果成功克隆了白念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Set1-208p基因并诱导表达,获得了纯化的重组肽段,所得蛋白质分子量(Mr)约为29 000,带有His标签,经western blot鉴定,诱导的重组蛋白可与IC患者血清特异性反应。结论成功诱导表达了具有良好抗原反应性的Set1-208p重组蛋白质,为建立相应的抗原、抗体ELISA检测方法提供基础。

真核细胞表达的重组蛋白VEGF-C对白血病细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:VEGF-C/VEGFR-2,3信号通路可诱导血管/淋巴管新生,促进实体肿瘤浸润和转移。近年来研究表明VEGF-C及其受体也在血液肿瘤细胞中表达,但其对白血病细胞的作用尚不清楚。本文拟探讨转染VEGF-C的CHO细胞(CHO/VEGF-C细胞)分泌的重组蛋白VEGF-C对VEGFR-3+白血病细胞的增殖及化疗药物诱导的凋亡的影响。方法:利用鸡胚绒毛尿囊膜观察CHO/VEGF-C细胞培养上清中重组VEGF-C诱导血管新生的作用。用RT-PCR和流式细胞术检测血液肿瘤细胞株中VEGF-C受体表达水平。采用噻唑蓝(MTT)法检测VEGF-C对白血病细胞株(NB4及K562)增殖的影响;AnnexinV/PI双染流式细胞术检测凋亡细胞以观察VEGF-C对化疗药物(Etoposide,DNR,AS2O3)诱导的VEGFR-3+阳性白血病细胞株的凋亡的作用。结果:CHO/VEGF-C细胞上清中的重组蛋白VEGF-C可以诱导鸡胚绒毛尿囊膜的血管新生。9例血液肿瘤细胞株中,NB4、HEL和RPMI8226表达VEGFR-3,HEL和TF-1表达VEGFR-2。与对照组(CHO/pcDNA3.1细胞上清)相比,重组蛋白VEGF-C可以促进VEGFR-3+白血病细胞NB4增殖(P24h=0.006,P48h=0.018),而对VEGRR-3-白血病细胞K562则没有明显作用;重组蛋白VEGF-C还具有抑制化疗药物(Etoposide、DNR、As2O3)诱导的NB4细胞凋亡的作用(P=0.019,0.013,0.042)。结论:重组蛋白VEGF-C不仅可诱导血管新生,而且可能通过VEGFR-3信号途径促进白血病细胞增殖及抗凋亡;推测VEGF-C/VEGFR-3信号途径可望作为白血病治疗的靶点。

细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库构建及巨噬细胞表达蛋白cDNA的克隆与差异表达

以雌性杂色鲍为对象,以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌,利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSHcDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子,进行菌液PCR鉴定,计算文库重组率为98.18%,文库容量为1.37×106pfu。将重组子测序,经BLAST一致性搜索比对分析,有一重组片段含有穿孔素(Perforin)保守结构域,为巨噬细胞表达蛋白(MEP)类穿孔素部分cDNA序列,片段大小为1551bp,连续编码517个氨基酸残基,申请GenBank登录号为EU272049。经半定量PCR和荧光定量PCR差异显示分析,发现在细菌感染状态下MEP基因在血淋巴细胞中存在明显的上调表达现象。

暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析

cdsRDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5基因,序列分析表明HpdsRCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于GroupdsRV类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pdsRFastdsRBac-HpdsRCDA5,转染昆虫细胞sf9,WesterndsRblot分析表明HpdsRCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42dsRkdsRDa的蛋白。利用qdsRRT-PCR方法分析HpdsRCDA5基因组织表达,结果显示HpdsRCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpdsRCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpdsRCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpdsRCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。

不同剂量X射线照射对小鼠巨噬细胞表达CD80和CD86的影响

采用免疫组织化学法观察了X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞及体外照射对培养的小鼠巨噬细胞株J774A .1细胞表达CD80和CD86的影响。结果表明 ;全身照射和体外照射时 2GyX射线诱导CD80表达增高均较 0 .0 75Gy为早 ,而CD86对两种剂量的反应无明显区别。剂量效应关系的研究表明 ,CD80和CD86的表达无论全身照射或体外照射时均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时出现第二个峰值的剂量则全身照射高于体外照射。实验结果显示 。

白血病抑制因子及受激活调节正常T细胞表达和分泌因子对血流感染脓毒症患者的诊断及预后评估价值

目的研究血清白血病抑制因子(LIF)及受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)对血流感染(BSI)脓毒症患者的诊断及预后评估价值。方法选择2021年1月~2022年7月期间我科收治的脓毒症患者,检测抗生素治疗前的血清LIF、RANTES水平;根据血培养结果分为BSI组和非BSI组,BSI组包括革兰阳性(G^(+))菌感染和革兰阴性(G^(-))菌感染患者,评估患者的28 d预后。结果BSI组血清LIF和RANTES水平高于非BSI组(P<0.05);BSI组中G^(-)患者血清LIF和RANTES水平高于G^(+)患者(P<0.05);BSI组中死亡的G^(-)患者血清LIF和RANTES水平高于存活的G^(-)患者(P<0.05),BSI组中死亡的G^(+)患者血清LIF和RANTES水平与存活的G^(+)患者比较差异无统计学意义(P>0.05);血清LIF和RANTES对脓毒症患者BSI、BSI脓毒症患者G^(-)菌感染具有诊断价值,对G^(-)菌感染导致BSI脓毒症的预后具有评估价值。结论血清LIF和RANTES是诊断BSI脓毒症、评估细菌感染类型以及G^(-)菌感染导致BSI脓毒症预后的潜在标志物。

髓样细胞表达激发受体-1在大鼠急性胰腺炎继发感染早期肺损伤时的表达

目的:探讨重症急性胰腺炎继发感染(SISAP)早期肺损伤时髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)的表达变化。方法:24只大鼠随机分为对照组(C组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、重症急性胰腺炎继发感染组(SISAP)组。通过腹腔注射L-精氨酸、大肠杆菌造模,24h后取血及腹水行细菌培养;测定血淀粉酶活性、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及TREM-1表达变化;胰腺及肺组织进行病理学评分;Real-timePCR和Western Blot分别检测肺组织中TREM-1mRNA和蛋白的表达。结果:血和腹水细菌培养阳性率:C组为0/8,SAP组为1/8,SISAP组为8/8;SAP组和SISAP组胰腺和肺组织病理评分及血淀粉酶活性均明显高于C组(P<0.05),且SISAP组较SAP组增高;SAP组和SISAP组的CRP、TNF-α均明显高于C组(P<0.05),但两组之间差异无统计学意义;血清TREM-1ELISA检测显示:SAP组和SISAP组均明显高于C组(P<0.05),且SISAP组较SAP组增高(P<0.05);Real-timePCR和WesternBlot分别检测肺组织TREM-1mRNA及蛋白表达,结果与血清TREM-1ELISA检测相似。结论:SISAP引起的早期肺损伤中TREM-1表达明显增高。

姜黄素对爪蟾卵母细胞表达人低密度脂蛋白受体的影响

目的在爪蟾卵母细胞中建立人低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor,LDL- R)表达系统,并研究姜黄素降脂作用的分子机理。方法将含人LDL R的表达质粒p3 7LDL导入细胞核中,用免疫荧光、配体荧光以及免疫胶体金标记透射电镜等方法检测细胞膜上LDL- R的表达情况;用不同浓度的姜黄素对爪蟾卵母细胞人LDL- R基因的表达进行干预,并用酶联免疫吸附分析法测定LDL- R的表达量。结果人LDL -R基因在爪蟾卵母细胞膜上得到表达;姜黄素具有增强其表达的作用,且有明显的量效关系。结论姜黄素降血脂和抗动脉粥样硬化的作用途径之一可以是通过促进LDL- R基因的表达,增加细胞对低密度脂蛋白胆固醇的吸收,从而降低血清胆固醇。