口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot and mouthdiseasevirus,FMDV)China/99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM T 3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx 4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx 3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS PAGE可检测到分子量约为59 1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31 4%。Westernblotting分析证明表达产物能被FMDV阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白基因及其表达产物免疫学试验

用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、ＶＰ３重组质粒ＤＮＡ及其大肠杆菌表达产物全菌裂解液油乳剂苗肌肉注射１４日龄仔鸡，免疫后１４和２１ｄ测定血清ＥＬＩＳＡ抗体效价，并于免疫后２１ｄ用ＩＢＤＶ南京野毒株攻击。结果显示：（１）ＶＰ２基因重组质粒ＤＮＡ除可诱导产生较高的ＥＬＩＳＡ抗体外，还可明显降低仔鸡ＩＢＤＶ攻击所引起的急性发病率和死亡率；（２）ＶＰ３－ＧＳＴ融合蛋白表达产物全菌裂解液可较早地诱导产生ＥＬＩＳＡ抗体，但对ＩＢＤＶ野毒株攻击只提供部分保护；（３）ＶＰ２和ＶＰ３表达产物无明显协同作用。

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。

番鸭细小病毒国内分离株主要结构蛋白基因的克隆和序列分析

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计1对引物,应用PCR技术扩增MDPV FS株的VP2-VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2-VP3结构蛋白基因克隆到T载体上,MDPV FS株基因大小为1764bp,编码528个氨基酸,对插入片段进行序列测定。结果表明,我国分离的MDPV FS株基因序列与国外发表序列的同源性为98.6%,与已发表的YZ株同源性为99.5%,可见番鸭细小病毒结构蛋白基因较保守。

计算机在IBDV主要结构蛋白基因PCR引物设计中的应用

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是引起世界养禽业重大经济损失的重要病原之一。至今国外已从分子水平揭示了20多株病毒的全部或部分结构蛋白基因,并进一步揭示了 IBDV 抗原变异是由 VP2基因存在一个高度可变区引起的,不同毒株 VP3基因也有一定差异。单抗ELISA 和血清中和试验表明,中国 IBDV 有多种血清亚型,且与国外毒株存在一定差异。使用现有的疫苗有一定的盲目性。因此了解中国地方株分子流行病学、掌握其抗原变异监测方法及筛选疫苗用病毒编码基因十分必要。PCR 已被广泛地应用于 IBD 基因诊断和克隆表达。但由于中国 IBDV 地方株结构蛋白基因序列至今尚无公开报道。

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR-2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6基因的引物,利用RT-PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18-T载体并测序.应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1株的序列进行比较.结果显示,这5个毒株与CH-1a、HB-1(sh)、BJ-4、ATCC VR-2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6的核苷酸同源性分别为87.2%～98.7%、85.4%～96.8%、91.8%～98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%～97.6%、84.5%～95.5%、94.8%～98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1%～58.3%、54.4%～57.0%、62.2%～64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%～56.7%、54.0%～57.0%、78.0%～80.3%.基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV与HB-1(sh)株的亲缘关系比较近.

禽流感病毒新疆分离株1/96(H14N5)非结构蛋白基因克隆及序列分析

研究应用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒分离株 A/ Chicken/ Xinjiang/ 1 / 96(H1 4 N5) ,提取病毒基因组及病毒感染鸡胚绒毛尿囊膜细胞信使 RNA,运用 RT-PCR技术扩增病毒分离株的 NS1和 NS2基因 c DNA,克隆后进行序列测定。序列测定后分析结果表明 。

旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达

用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T5 4克隆作为核酸探针 ,对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选 ,获得 1个全长 14 6 4bp的cDNA分子。该cDNA含有 1个 12 90bp的开放阅读框架 (ORF) ,Blastn同源性分析表明 ,与其它已知生物基因序列无明显的同源性 ,为一新的cDNA。该ORF编码 1个 42 9个氨基酸残基组成的多肽 ,其分子质量理论推导值为 49.9ku ,等电点为 5 .6 ,在 12— 14及 10 3— 10 5氨基酸残基处分别有 2个糖基化位点NLS及NVS ,在C末端 344— 40 9氨基酸残基处有 1个FYVE锌指结构域 (ProfilePS5 0 178)。Blastp同源性分析表明 ,与广东管圆线虫 (Angiostrongyluscantonensis) 6 6 .0ku蛋白 ( gi/ 1743430 )同源性最高 ,为 39.0 %。在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达 ,表达蛋白占菌体蛋白的 2 4%。

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。

鹅细小病毒辽宁株主要结构蛋白基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank登陆的鹅细小病毒B株全基因组的核苷酸序列,设计合成一对引物,用PCR方法对GPV LN-1/06株的主要结构蛋白基因进行克隆,并对克隆的片段进行序列测定,用生物信息学软件进行序列分析。结果表明:所扩增的GPV LN-1/06株的基因长度为1605bp,包括VP3完整的开放阅读框,共编码534个氨基酸。与登录的20株国内和国外的GPV的VP3基因序列进行同源性分析表明,GPV LN-1/06株与其他20株VP3基因的核苷酸同源性较高,从93%至99%,说明GPV的VP3基因较为保守。系统进化树分析表明GPV-LN01/06病毒株与HG5/82为一组,具有较近的亲缘关系。本试验首次获得辽宁地区鹅细小病毒流行株的主要结构蛋白基因(VP3)的核苷酸序列,为研究国内外GPV的遗传演化规律提供参考资料。

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至pGEM-Teasy载体上。序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达。以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1:3000.Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段。

口蹄疫病毒Akesu/O/58株结构蛋白基因的克隆和细胞受体结合位点初探

将Akesu/O/58口蹄疫病毒分离株牛舌皮毒适应乳鼠,通过RT-PCR法分别获得了该病毒结构蛋白基因vp1和p1。结果表明:vp1和p1基因分别为639 bp和2 208 bp,与Akesu/O/58细胞适应株FMDV的vp1和p1基因核苷酸序列的同源性分别为83.9%和84.7%,氨基酸序列的同源性为89.7%和95.1%。本试验分离株与OHK99、O1K、Tai wan97病毒株的细胞受体结合位点均为RGD(Arg-Gly-Asp),而Akesu/O/58细胞适应株的细胞受体结合位点为SGD(Ser-Gly-Asp)。

人类博卡病毒结构蛋白基因VP2的克隆与表达

采用PCR方法扩增出人类博卡病毒结构蛋白基因VP2,通过双酶切、连接、转化等方法将VP2基因克隆到原核表达载体pMAL-c2x上,构建重组质粒pMAL-c2x-VP2,通过双酶切检测重组质粒构建成功;用0.8 mmol.L-1IPTG诱导融合蛋白表达,经SDS-PAGE检测、Western Blot分析,证明目的蛋白得到了表达。可为目的蛋白的纯化及结构和功能的研究、相应抗体的制备打下坚实的基础。

鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物,经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物;将目的条带纯化并回收以后,克隆到pMD18-T质粒载体中,对插入片段进行序列测定,并与已发表的IBVS1、N基因序列进行了比较和分析,表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBVS1和N结构蛋白基因。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株结构蛋白基因的克隆及结构特征分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了6对引物,应用RT-PCR方法对PRRSVGS株部分片段进行基因的扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行拼接,并与国内外分离毒株进行核苷酸以及推导氨基酸序列同源性比较.结果发现PRRSVGS毒株结构蛋白基因全长3819bp,包括ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个阅读框,分别编码GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白;与BJ-4、CH-1a、HB-2(sh)/2002和VR-2332美洲株等核苷酸的同源性在87.9%～97.1%,推导的氨基酸同源性在88.3%～97.1%;而与LV和Euro毒株的同源性差异显著,核苷酸同源性在56.0%～70.0%,氨基酸同源性在54.9%～77.6%.构建的系统发育树证明该毒株在基因型上属于美洲型.

禽呼肠孤病毒μNS非结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)M3基因序列,设计并合成了一对跨越μNS非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV的10个毒株进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果表明,10个毒株μNS蛋白基因ORF的核苷酸序列全长均为1908 bp,编码635个氨基酸。这10个毒株之间的核苷酸及推导的氨基酸同源性分别都在98%以上。将它们与哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)、番鸭呼肠孤病毒(DRV)等进行核苷酸及推导的氨基酸序列比较,并进行遗传系统树分析,结果表明ARV与MRV有较大的差异,与DRV差异较小。

猪流感病毒H1N1亚型天津分离株核蛋白、基质蛋白、非结构蛋白基因克隆与序列分析

从天津地区不同猪场分离到6株H1N1亚型猪源流感病毒(SIV)。根据GenBank发表的H1N1亚型SIV的核蛋白(NP)、基质蛋白(M)及非结构蛋白(NS)基因序列,分别设计3对引物,将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行测序分析。遗传进化分析结果表明:A/swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)位于同一分支上,属于古典型H1N1猪谱系;A/swine/Tianjin/TJ3/2006(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ8/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸在遗传进化树中均与A/Dunedin/2/2000(H1N1)组成一个大分支,可能起源于人谱系;A/swine/Tianjin/TJ6/2009(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ7/2009(H1N1)NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Jiangsu/s15/2011(H1N1)位于同一分支上,属于类禽H1N1猪谱系。本试验对6株H1N1亚型SIV的NP、M及NS全基因序列进行分析,在一定程度上揭示了天津地区H1N1亚型SIV的基因进化与流行情况。

PRRSV JX0708株结构蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中登录的美洲型PRRSV JXA1株基因组序列设计合成了4对引物,应用RT-PCR技术对PRRSV JX0708株结构蛋白基因进行扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行分析,并与国内外分离株进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性比较.结果表明:PRRSV JX0708株结构蛋白基因长约3 186bp,分为ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个基因区;与国内分离的高致病性PRRSV美洲型毒株HuN、GD、JXA1、LN和普通毒株CH-1a以及经典毒株VR-2332和疫苗毒株pMLV的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别为88.0%～100.0%和83.5%～100.0%;而与欧洲型经典毒株LV和Euro-1的同源性差异显著,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为64.0%～69.7%和53.3%～79.9%.遗传进化分析表明,PRRSV JX0708株在基因型上属于美洲型,同时美洲型PRRSV的变异存在某种地域和时间跨度上的相关性,但每个结构蛋白基因的变异并不严格遵从这种规律,而有所差异.