结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

为获得结核杆菌热休克蛋白 70在毕赤酵母中的分泌表达。构建了酵母表达质粒pPIC9K hsp70 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115 ,经PCR方法筛选出阳性菌落 ,在 0 .5 %甲醇诱导下分泌表达。所得产物经离心收集上清、超滤浓缩脱盐、亲和层析后 ,分别用SDS PAGE、Westernblot和动物免疫实验对上清中的重组Hsp70进行鉴定 ,并考察产物对DC的作用。经SDS PAGE、Westernblot分析表明表达的Hsp70表观分子量为 70kD并能特异性地与抗 Mt.Hsp70单抗结合 ,动物实验表明重组的Hsp70能在体诱导免疫应答。重组Hsp70能够诱导DC成熟并释放Th1型细胞因子。摇瓶发酵表达量达 12 0mg L ,占培养上清 30 %以上。

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP。方法根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列。将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒。将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒。Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Westernblot检测mtHSP70蛋白表达情况。结果酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达。结论含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础。

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的 :克隆结核杆菌热休克蛋白 70 (TBhsp70 )基因 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因 ,并将其克隆到pUC19中 ,进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX 4T 1中 ,构建重组表达质粒pGEX TBhsp70 ,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果 :成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实 ,与GenBank公布的序列一致。含pGEX TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,能够表达相对分子质量 (Mr)约为 96 0 0 0的融合蛋白。结论 :获得了TBhsp70基因 ,成功地构建了原核表达质粒pGEX TBhsp70 ,并在大肠杆菌得到表达 ,为其相关研究奠定了一定的基础。

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的:构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段,测序后插入HSP70基因的5'端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-E7-HSP70;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果:成功地构建了pGEX-E7-HSP70原核表达质粒;在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论:成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。

结核杆菌热休克蛋白70刺激表位在融合基因疫苗中的佐剂作用

目的:探讨结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)的刺激表位在肝细胞癌相关抗原661(HCA661)融合基因疫苗pCI-HCA661-mtHSP70中的佐剂作用,为提高基因疫苗的免疫效果提供依据。方法:18只BALB/c小鼠随机分为pCI-neo组、pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组,每组6只,分别肌肉注射100μg空质粒pCI-neo、重组质粒pCI-HCA661-mtHSP70C和pCI-HCA661-mtHSP70E,流式细胞术分析小鼠脾T细胞亚群变化;ELISA法检测体外培养脾细胞上清中干扰素γ(IFNγ)的含量及免疫小鼠血清中HCA661特异性抗体的滴度;体外特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验观察融合基因疫苗对肿瘤细胞的抑制作用。结果:pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+T淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+比值与pCI-neo组比较差异有统计学意义(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组的CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值均高于pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);在抗原肽刺激下,pCI-HCA661-HSP70E免疫组小鼠脾细胞培养上清中IFNγ含量较pCI-mtHCA661-HSP70C免疫组明显提高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组和pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组IFNγ含量均高于pCI-neo组(P<0.05)。pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组诱导的HCA661特异性抗体水平较pCI-HCA661-mtHSP70C免疫组显著增高(P<0.05);pCI-HCA661-mtHSP70E免疫组可以产生更强的CTL抗肿瘤效应。结论:mtHSP70刺激表位可以诱导机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答,发挥更强的佐剂作用。

小鼠甲胎蛋白与结核杆菌热休克蛋白70基因融合载体的构建及体外表达

目的 构建小鼠甲胎蛋白 (α Fetoprotein ,AFP)与结核杆菌热休克蛋白 70 (Mycobacteriumtuberculosisheatshockprotein 70 ,Mt.HSP70 )基因融合载体 ,并研究其在真核细胞中的表达情况。方法 以pcDNA3.1为基本单位构建AFP及与HSP70的融合表达载体 ,融合基因以G S G G S连接子连接 ;用脂质体将系列载体导入COS 7细胞 ,4 8h后以免疫化学方法检测其表达。结果 构建的AFP和HSP70的单独及融合表达载体导入COS 7细胞 4 8h后经RT PCR检测可扩增出相应片段 ,细胞免疫化学染色为阳性。结论 AFP和HSP70的单独及融合表达载体构建成功 ,并能在真核细胞中表达。

结核杆菌热休克蛋白70剂量相关的免疫调节作用

目的:验证HSP70的免疫调节作用是否和剂量相关。方法:不同剂量的结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)体外刺激未成熟的树突状细胞(DC),检测其对DC表面分子CD86以及IL-10表达量的影响。结果:0～50μg/ml浓度范围内的HSP70在体外可以促进DC表达CD86并呈现剂量依赖性,但是当浓度在50～200μg/ml范围时,HSP70抑制DC表达CD86。此外HSP70在体外也可以促进DC产生IL-10,并呈一定剂量相关性。大剂量的HSP70可以抑制NOD小鼠糖尿病的发生率并显著促进Treg的产生。结论:小剂量的HSP70在体外可以促进DC的成熟,大剂量的HSP70反而可以抑制DC的成熟并抑制NOD小鼠糖尿病的发生,这种抑制作用可能是通过产生IL-10和Treg引起的。

结核杆菌热休克蛋白70作为表位肽载体体外诱导HBV特异性免疫应答

目的在体外研究结核杆菌热休克蛋白70(TB.HSP70)作为乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)细胞毒性T淋巴细胞表位肽载体,诱导HBV特异性免疫应答。方法应用毕赤酵母分泌表达HSP70(P1)、HSP70-HBcAg(18-27)(P2)、HSP70-PreS2B(18-24)-PreS2Th(37-53)-HBcAg(18-27)(P3),用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹法鉴定各重组蛋白的表达。体外考察重组蛋白(P1、P2、P3)对慢性乙型肝炎外周血来源的树突状细胞和淋巴细胞的作用,流式细胞术评估树突状细胞的成熟,酶联免疫吸附测定法检测细胞因子白细胞介素(IL)-12p70、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌情况,TdR-3H掺入法检测淋巴细胞的增殖情况,应用经典51 Cr法检测重组蛋白诱导HBV特异性细胞毒活性。结果重组蛋白P1、P2、P3构建成功,P1、P2、P3能诱导树突状细胞成熟,上调CD1a、CD40、CD86表达,释放Th1型细胞因子IL-12p70、IL-1β和TNF-α,P3最能有效激活自体淋巴细胞成为细胞毒活性细胞,促进淋巴细胞增殖和IFN-γ的释放,而单独的HSP70无杀伤活性。结论 TB.HSP70可作为HBV HBcAg细胞毒性T淋巴细胞表位肽载体,提高T淋巴细胞表位肽的免疫原性,且含有B、Th表位的P3能更好地激活HBV特异性免疫应答。

单纯疱疹病毒2型gD蛋白-结核杆菌热休克蛋白70 DNA疫苗的免疫效应研究

目的研究单纯疱疹病毒2型gD蛋白-结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70-HSV2gD)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠出现的特异性免疫反应.方法用制备的Hsp70-HSV2gD DNA疫苗免疫小鼠3次,最后1次免疫后第4周测定小鼠血中特异性gD IgG抗体;分离小鼠脾淋巴细胞,用HSV2gD蛋白刺激后用MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定脾淋巴细胞培养液中干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-4浓度,用流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞CD4+、CD8+T细胞亚群.结果gD、gD+Hsp70和Hsp70-HSV2gD 3组均可刺激小鼠产生靶向HSV2gD蛋白抗体,诱导CD4+T细胞与CD8+T细胞增殖,刺激脾淋巴细胞增殖并分泌IFN-γ、IL-4.Hsp70-HSV2gD组在抗体水平、诱导CD4+T细胞与CD8+T细胞增殖、刺激脾淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ、IL-4均明显高于gD+Hsp70组、gD组,差异有统计学意义(P<0.05).结论Hsp70-HSV2gD DNA疫苗可以刺激小鼠产生比gD、gD+Hsp70组更强的特异性免疫反应,Hsp70-HSV2gD DNA疫苗中的Hsp70对HSV2gD抗原诱导的特异性免疫应答可能有促进作用.

结核杆菌热休克蛋白70-乙型肝炎表面抗原诱导特异性免疫反应

目的 研究体外构建结核杆菌热休克蛋白和乙型肝炎表面抗原复合物(HSP70-HBsAg)诱导针对乙型肝炎表面抗原特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础。 方法 考察体外构建HSP70-HBsAg复合物是否能引起小鼠的体液和细胞免疫;将复合物负载树突状细咆(D C),D C激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),检测其杀伤HepG2-S细胞的能力。 结果 HSP70-HBsAg复合物能引起小鼠的体液免疫和细胞免疫;HSP70-HBsAg和HBsAg均可诱导CD 81 T淋巴细胞的特异性CTL,而前者的诱导效果更强。 结论 体外构建的HSP70-HBsAg蛋白复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原蛋白诱导特异性免疫反应的能力,HSP70～HBsAg有望作为蛋白疫苗用于临床慢性乙型肝炎的免疫治疗。

HBsAg与结核杆菌热休克蛋白70融合质粒在真核细胞中的表达

目的 探讨HBsAg与结核杆菌热休克蛋白70（MtHSP70）融合表达质粒在真核细胞中的表达。方法 用真核表达质粒pCI-neo作为载体构建HBsAg及其与MtHSP70的融合表达质粒（PCI-S,PCI-S-HSP70）;用脂质体介导的转染法将重组质粒转染 HepG2细胞,48h后,采用RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA检测重组质粒在HepG2细胞中的表达。结果 质粒pCI-S和pCI-S-HSP70转染的HepG2细胞总RNA用RT-PCR可检测到目的基因mRNA的表达;pCI-S和pCI-S-HSP70转染的HepG2细胞用免疫细胞化学检测,结果显示在胞浆及核周有大量的阳性颗粒;ELISA检测pCI-S转染的细胞培养上清液HBSAg为阳性,而pCI-S-HSP70转染的细胞培养上清液HBSAg为阴性;在细胞裂解液中,二者转染的细胞均为阳性。结论 HBsAg与Mt.HSP70的融合表达质粒可在HepG2细胞中表达,但表达的融合蛋白不分泌出细胞外。

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:1采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,2应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为33.4798±2.0929、47.974±5.1628、47.0861±2.2033、7.4642±0.6791(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定

目的 构建人结核杆菌热休克蛋白 6 5 (HSP6 5 )重组卡介苗 (BCG)疫苗。方法 用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原 85B (Ag85B)的信号肽DNA序列 ,从 pCMV MTHSP 6 5质粒中扩增出HSP6 5全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒 pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5。利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中 ,经热诱导后 ,用SDS PAG电泳来观察其表达水平。利用Westernblot来检验HSP6 5的生物学活性。结果 酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明 ,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白 6 5DNA片段与报道结果完全一致 ,重组体的连接方向正确 ,阅读框与预期完全一致。热诱导后 ,重组BCG表达的 6 5kD (1kD =0 992 1ku)蛋白占菌体总蛋白的 35 6 7% ,占裂解物上清总蛋白的 74 0 9% ,表明重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP6 5的抗体特异性结合。结论 成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP6 5 ,重组的HSP6 5基因能在BCG中高效表达 ,表达的HSP6 5具有生物学活性 ,重组BCG疫苗构建成功。

共培养体系中重组结核杆菌热休克蛋白10对破骨细胞相关基因表达的影响(R68)

目的观察重组结核杆菌热休克蛋白10(CPN10)对成骨细胞(OB)-外周血单个核细胞(PBMs)共培养体系中破骨细胞生成及相关基因表达的影响。方法建立培养上清相通但二者互相不接触的成骨细胞一单个核细胞共育模型。实验分对照组和CPN10(10μg/ml)处理组。主要观察指标:①采用TRAP染色及扫描电镜检测破骨细胞生成及小牛骨磨片吸收陷窝,②应用Realtime PCR检测与破骨细胞生成相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。结果两组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在小牛骨磨片上形成吸收陷窝;但对照组所获TRAP阳性多核细胞数目、吸收陷窝数目及面积均显著小于CPN10组。Realtime PCR检测结果显示CPN10组与对照组相比NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG相对浓度分别为7.410±1.738、8.844±1.981、22.4272±2.058、2.445±0.2517(P<0.05),对照组各基因表达均显著低于CPN10组。结论 CPN10在成骨细胞-单个核细胞(OB-PBMs)共培养体系中可促进OC的生成及骨吸收,CPN10通过对成骨细胞的作用,致其分泌的OPG/RANKL比例失调,并上调破骨细胞相关基因NFATc1、c-Fos、RANKL、OPG的基因表达。

结核杆菌截短型热休克蛋白原核表达的实验研究

探讨结核杆菌的截短型热休克蛋白原核表达技术.以结核杆菌BCG疫苗株为模板,设计PCR引物扩增hsp65基因片段,再以pET32a(+)为载体构建pET-hsp65表达质粒.将pET-hsp65表达质粒转化大肠杆菌BL21,经0.5mM IPTG诱导后,截短型HSP65蛋白与pET32a(+)载体自身的硫氧还蛋白融合表达,融合表达蛋白的分子量约为49.8kDa.

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的 构建结核杆菌热休克蛋白 -65 (HSP65 )真核表达质粒 ,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达 .方法 用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因 ,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( +) ,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65 ;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549细胞 ,经G418筛选后获得抗性细胞克隆 ;用RT -PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达 .结果 经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确 ;RT -PCR检测结果发现 ,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性 .结论 真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 。