结蛋白的纯化、抗体的制备及免疫组织化学鉴定

参考Small和Geisler两法加以改进。从鸡肫中提取纯化结蛋白,用淋巴结内微量注射法制备兔抗结蛋白抗体。用免疫组织化学染色法(PAP法)对抗结蛋白抗体作鉴定。结果:心肌、骨骼肌、平滑肌(除主动脉平滑肌)呈强阳性反应;胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、远端肾小管上皮细胞、汗腺分泌部上皮细胞部分呈弱阳性反应。

运动诱导骨骼肌损伤对结蛋白聚集体的影响

背景:蛋白降解是运动诱导骨骼肌损伤的重要原因,大强度的运动会导致蛋白错误折叠,易形成蛋白聚集体,损害骨骼肌超微结构。目的:初步探索运动诱导骨骼肌损伤中蛋白聚集尤其是结蛋白聚集体的发生,以期明确结蛋白聚集在运动诱导骨骼肌损伤中的作用。方法:将64只成年雄性SD大鼠(购自北京维通利华实验技术有限公司)随机分为安静对照组(n=8)和运动组(n=56),运动组又按运动后时相分为0,3,6,12,24,48,72 h组,每组8只。运动组大鼠进行一次跑台下坡跑运动(-16°,16 m/min,90 min),分别在运动后的相应时刻取比目鱼肌,使用透视电子显微镜观察损伤发生程度,采用Western Blot方法检测比目鱼肌难溶蛋白中泛素蛋白的表达,免疫荧光双标观察结蛋白聚集体的表达。实验获得北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(2016030A)。结果与结论:①透射电镜显示一次大负荷离心运动后,大鼠比目鱼肌部分位置肌节变宽,Z线断裂,肌原纤维断裂、扭曲,其中运动后12 h损伤最为严重,于运动后72 h完全恢复;②Western Blot方法检测显示一次大负荷离心运动后,骨骼肌中泛素蛋白表达总体呈先升高后降低的趋势,于运动后12 h达峰值,于运动后72 h恢复至安静对照组水平;③免疫荧光双标染色显示一次大负荷离心运动后,骨骼肌结蛋白聚集体表达总体上呈现先升高后降低的趋势,运动后12 h达到峰值,运动后24,48 h有所降低,72 h完全恢复安静对照组水平;④结果表明,结蛋白聚集可能是运动诱导骨骼肌损伤的原因之一。

离心运动对大鼠骨骼肌结蛋白分布和表达的影响——对骨骼肌损伤机制的研究

方法:4 8只7周龄雌性SD大鼠进行一次性下坡跑至力竭,取比目鱼肌进行desmin免疫组化染色,然后光镜观察切片,并用图像分析仪对免疫染色切片进行定量分析。结果:1 )离心运动后肌纤维局部desm in染色不同程度、不同范围地出现了变淡、模糊、甚至缺失,出现desmin阴性纤维;2 )与对照组相比,力竭运动后即刻desm in平均光密度显著降低,在力竭后1天降到最低点,随后desmin平均光密度开始逐渐上升,到第7天,desmin阳性区域的平均光密度均显著高于对照组C。desm in阳性面积百分比和积分光密度结果变化趋势一致,离心运动组desmin阳性面积百分比低于对照组,desmin阳性面积百分最低点出现在运动后第1天。结论:1 ) desmin细胞骨架破坏是离心运动诱导损伤的形态学标志;2 ) Desmin免疫组化染色可以作为评估骨骼肌早期损伤的工具。

结蛋白和波形蛋白在运动性肌肉损伤和再生过程中表达及意义的实验研究

采用重复跑跳运动模型 ,利用图像分析的方法对结蛋白和波形蛋白表达进行量化 ,并结合肌肉组织病理、超微结构的变化 ,对运动性肌肉损伤和再生的病理过程进行综合分析。实验中发现肌肉损伤和再生的病理周期约为3- 4周 ,这种周期特点与肌肉本身性质有关。在重复跑跳运动中 ,肌肉组织出现明显的适应性改变 ,但是这种适应性变化有一定限度。提示我们在训练过程中应该注意合理调整训练量和训练周期 ,防止肌肉损伤加重 ,促进肌肉再生 ,加速肌肉的功能恢复。

大鼠心肌挫伤后细胞结蛋白破坏与钙超载的实验研究

目的研究大鼠心肌挫伤(myocardial contusion,MC)后细胞结蛋白(desmin)的破坏与钙超载情况,评价心肌挫伤后结蛋白破坏与钙超载的关系。方法 110只SD大鼠按随机数字表法分为标准对照组(S组,n=10)、单纯致伤组(T组,n=50)和致伤+地尔硫卓组(D组,n=50),BIM-Ⅲ生物撞击机建立胸部撞击致心肌挫伤模型,致伤后D组腹腔注射盐酸地尔硫卓(0.5 mg/kg),分别于伤前,伤后2、4、8、24、48 h检测心肌细胞Ca2+浓度,免疫组化法及Western blot检测心肌细胞结蛋白变化情况,RT-PCR检测结蛋白mRNA表达变化情况。结果①T组伤后2 h心肌细胞Ca2+浓度较S组明显增高[(110.4±17.6)vs(74.0±9.3),P<0.01],伤后4 h达最高值(141.1±17.8)后逐渐下降,48 h恢复至伤前水平(78.6±10.3);②MC后早期即出现严重的结蛋白破坏,T组伤后8 h结蛋白表达量降至最低[与S组比较,(0.11±0.11)vs(1.23±0.27),P<0.01],24 h开始部分恢复,伤后48 h结蛋白表达增高且出现排列紊乱和无规则聚集的现象;③与T组比较,D组显著降低了伤后4、8 h细胞内Ca2+浓度[(84.6±9.7)、(89.3±11.8)],结蛋白表达量在伤后2、4 h两组相较无明显差异,但在伤后8 h,D组(0.55±0.18)高于T组(P<0.05);④T、D组结蛋白mRNA伤后表达增高,24 h达峰值,D组24 h后表达低于T组。结论 MC后早期结蛋白的破坏以细胞的机械损伤为主,随着细胞内Ca2+浓度增高,其介导的心肌结蛋白降解增加。通过伤后应用钙通道阻滞剂降低Ca2+浓度可有效减缓解结蛋白的降解破坏。

α-SCA、α-SMA和结蛋白与小鼠胚胎心肌发育成熟的关系(英文)

目的观察α-横纹肌肌节肌动蛋白(α-SCA)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和中间丝结蛋白在小鼠心脏发育过程中的时空表达特征,以探讨这些蛋白质表达与胚胎及生后小鼠心脏成熟的关系。方法用抗α-SCA、抗α-SMA及抗结蛋白单克隆抗体对胚胎及生后小鼠心脏连续切片进行染色。结果胎龄9 d,心室和流出道α-SCA、α-SMA表达较强,而结蛋白表达较弱。在心房,α-SCA、α-SMA的表达限于背侧壁和腹侧壁,静脉窦仅见少许α-SCA弱阳性细胞。心房和静脉窦则无结蛋白表达。α-SCA、α-SMA和结蛋白的表达于胎龄12 d达高峰。较高水平的α-SCA表达将持续到生后。心脏各部α-SMA和结蛋白表达于胎龄12 d后逐渐下降,但在右心室表达持续时间较长。出生后,结蛋白表达主要集中于明带Z线和闰盘。结论α-SMA和结蛋白在小鼠胚胎心脏表达的时空差异性表明小鼠胚胎心脏不同部位发育成熟的时间有差异,右心室成熟较慢。α-SMA表达可能与早期胚胎心脏的缓慢蠕动收缩有关。肌节的发育成熟需要较高的结蛋白表达。

不同力竭运动后大鼠心脏传导系统结蛋白mRNA和蛋白表达的变化及其在运动性心律失常发生中的作用

目的:探讨大鼠力竭运动后不同时相心脏窦房结、房室结和浦肯野氏纤维细胞骨架因子结蛋白在基因和蛋白水平的表达特点,为阐明运动性心律失常发生机制提供实验依据。方法:100只健康成年雄性SD大鼠随机分为一次力竭组(4组)、2周反复力竭组(4组)及其相应的安静对照组,每组10只。分别于力竭运动后即刻、4、12及24小时,先进行心电图(ECG)检测,随即应用激光显微切割技术定位并收集窦房结、房室结和浦肯野氏纤维细胞团,采用免疫荧光组化及实时荧光定量PCR检测分析结蛋白mRNA和蛋白表达。结果:不同力竭运动后,部分大鼠发生心律失常,本研究建立的运动性心律失常模型成功。一次和反复力竭运动后,大鼠窦房结结蛋白mRNA和蛋白表达水平规律基本一致,12小时窦房结结蛋白mRNA和蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。一次和反复力竭运动后,房室结结蛋白mRNA和蛋白表达规律基本一致,运动后24小时下降较明显(P<0.05)。反复力竭运动后4小时浦肯野氏纤维结蛋白mRNA和蛋白表达均显著低于一次力竭后(P<0.05)。结论:不同力竭运动后心脏传导系统各部位细胞骨架支撑因子结蛋白在mRNA和蛋白水平存在低表达,且反复力竭后心脏传导系统改变更明显,提示力竭运动可致心脏传导系统骨架因子结蛋白受损,可能是发生运动性心律失常的病理基础。

牛结蛋白基因启动子的克隆及功能的初步分析

旨在克隆牛结蛋白基因不同长度的启动子片段,并对其进行功能分析。本研究采用PCR法扩增牛结蛋白基因不同长度的启动子缺失序列,构建pGL3-desminpro双荧光素酶表达载体,使其转染牛骨胳肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,进行活性检测。同时转染牛MyoG和βα-actin基因启动子的表达载体,以比较结蛋白启动子和MyoG及α-actin启动子的表达活性。结果表明,牛结蛋白基因的132~2106 bp启动子都能不同程度的启动双荧光素酶报告基因在牛骨胳肌卫星细胞中的表达,且都具有肌肉特异性。300bp的结蛋白基因启动子活性最高,且高于牛MyoG和α-actin基因启动子的活性。从而筛选出300 bp的结蛋白基因启动子为活性较高且大小合适的肌肉特异性启动子,这为转基因肉牛的生产方面奠定了重要的基础。

复方鳖甲软肝方对肝星形细胞结蛋白、突触素表达的影响

目的观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体SD大鼠肝星形细胞(hepaticstellatecells,HSC)结蛋白、突触素表达的影响,以探讨其抗肝纤维化作用机制。方法将成年健康雄性SD大鼠75只,随机分为正常对照组、模型组、高、中、低剂量药物组共5组,并制备各组血清。采用大鼠HSC分离技术,将分离得到的HSC分别添加各组血清培养24,48,72h后,免疫组化检测各组HSC的结蛋白、突触素表达,并经图像分析系统作定量分析。结果培养24h正常对照组、高、中、低剂量药物组大鼠HSC结蛋白、突触素的表达(A值)(78.93±18.56,396.29±78.56;58.95±5.21,138.92±20.21;63.83±12.97,190.87±52.97;75.46±26.72,284.54±66.72)与模型组(119.69±23.84,528.79±26.84)比较,差异有显著性意义(P<0.05);培养48,72h各组结蛋白、突触素的表达(A值)与模型组比较,差异也有显著性意义(P<0.05)。除低剂量药物组外的其余各组大鼠HSC结蛋白、突触素表达与正常对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论复方鳖甲软肝方能显著抑制HSC结蛋白、突触素的表达,其抗肝纤维化作用机制可能与药物抑制HSC活化有关。

基于大鼠腰多裂肌损伤模型探讨电针“委中”穴对多裂肌超微结构及结蛋白表达的影响

目的观察电针"委中"穴对大鼠腰多裂肌损伤后超微结构及结蛋白(Desmin)表达的影响,探讨电针"委中"对多裂肌损伤后修复的部分作用机制。方法48只雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组、电针"委中"组,每组各16只,每组再随机分为4 d、7 d两个亚组,每组各8只。采用单次肌肉注射0.5%布比卡因盐酸盐(BPVC)建立多裂肌损伤的动物模型,电针"委中"组进行电针"委中"穴治疗,频率2/100 Hz,电流强度1~2 m A,20 min/次,1次/d,分别持续3 d、6d。空白组与模型组不进行针刺干预。造模后的第4天、第7天收集损伤多裂肌,采用透射电子显微镜观察损伤多裂肌超微结构的变化;分别采用免疫组织化学法和免疫印迹法观察不同时间点多裂肌Desmin的蛋白表达的变化。结果布比卡因注射导致多裂肌超微结构发生明显改变;免疫组织化学法和免疫印表明,与空白组比较,模型组多裂肌损伤后第4、7天Desmin的蛋白表达升高(P<0.01,P<0.01);与模型组比较,多裂肌损伤后第4天,电针"委中"组Desmin的蛋白表达升高(P<0.01),第7天,电针"委中"组Desmin的蛋白表达下降(P<0.01)。结论电针"委中"穴通过调节Desmin的蛋白表达,提前腰部多裂肌损伤修复时程的到来,促进再生肌纤维趋向成熟。

绝经后女性盆底功能障碍患者肛提肌中抗肌营养不良蛋白和结蛋白表达及意义

目的探讨抗肌营养不良蛋白和结蛋白mRNA的表达与绝经后女性盆底功能障碍(PFD)的关系。方法选择30例压力性尿失禁患者(SUI组)、30例盆底组织膨出患者(POP组)及6例无SUI和POP的直肠癌患者(对照组),术中行肛提肌活组织检查(活检),应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法检测肛提肌中抗肌营养不良蛋白和结蛋白的表达。结果 POP组和SUI组肛提肌中肌营养不良蛋白和结蛋白mRNA表达较对照组均降低(P<0.01)。POP组和SUI组比较,肛提肌中抗肌营养不良蛋白和结蛋白mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论绝经后女性盆底功能障碍性疾病的发生与女性肛提肌中抗肌营养不良蛋白及结蛋白的表达降低有关。

伊贝沙坦和培垛普利对左心室肥大时心肌连接蛋白43、结蛋白与肌钙蛋白T表达的实验研究

目的:探讨左室肥大时血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ型拮抗剂伊贝沙坦和血管紧张素转换酶抑制剂培垛普利对心肌连接蛋白43(CX43)、结蛋白与肌钙蛋白T(cTnT)表达的影响。方法:分假手术组、SD大鼠腹主动脉部分结扎的手术组及腹主动脉部分结扎的处理组即伊贝沙坦组(20mg·kg-1·d-1ig)、培垛普利组(2mg·kg-1·d-1ig)、两药联用组(伊贝沙坦组20mg·kg-1·d-1ig+培垛普利组2mg·kg-1·d-1ig),术后次周起干预8周,观察左室重量指数(LVMI)和心肌细胞横径(TDM),免疫组织化学检测心肌CX43、结蛋白与cTnT表达。结果:培垛普利组、伊贝沙坦组和联合用药组LVMI和TDM均显著低于手术组(P<0·05),手术组心肌细胞闰盘区域和侧侧连接的胞膜上均有不规则CX43表达;伊贝沙坦组、培垛普利和其联用组的CX43表达分布较有规律,主要以带状表达于闰盘;手术组心肌CX43、结蛋白、cTnT表达量明显少于伊贝沙坦组、培垛普利组和其联用组(P<0·05)。结论:左室肥大时伊贝沙坦和培垛普利有利于心肌CX43、结蛋白与cTnT的表达与分布,能减轻左室心肌肥大,减少心肌细胞损伤,促进心肌细胞骨架结构与缝隙连接的基本正常恢复。

胃肠道间质瘤CD117、CD34、SMA、S-100蛋白、Vim、结蛋白的表达及临床意义

目的探讨胃肠道间质瘤(GISTs)的临床病理诊断,以及CD117、CD34、SMA、S-100蛋白、波形纤维蛋白(Vim)、结蛋白表达的临床意义。方法回顾分析了35例手术后经病理确诊的GISTs临床资料及辅助检查结果,免疫组化检测肿瘤组织CD117、CD34、SMA、S-100蛋白、Vim、结蛋白等抗原标志物的表达,分析对GISTs的诊断意义。结果35例GISTs发生于胃11例、小肠11例、腹腔5例。主要临床表现有腹胀、腹痛、消化道出血、腹部肿块。肿瘤组织中CD117、CD34的阳性表达率分别为94.3%和91.4%,显著高于SMA、S-100蛋白、Vim、结蛋白的表达(P<0.001),也显著高于在平滑肌瘤中的表达(P<0.0001);GISTs中结蛋白的阳性表达率2.9%,显著低于CD117和CD34(P<0.05);也显著低于在平滑肌瘤中的表达(P<0.001)。结论GISTs多发生于胃和小肠,胃肠镜、超声内镜和CT检查对间质瘤有较大诊断价值,而CD117阳性、CD34阳性及结蛋白结蛋白阴性对GISTs有确诊意义。

梗死心肌骨骼肌卫星细胞移植后心肌细胞结蛋白变化

目的 观察骨骼肌卫星细胞梗死心肌移植后心肌细胞结蛋白的变化。 方法 自犬臀部取骨骼肌体外提取、培养、扩增骨骼肌卫星细胞 ,4′,6 -二脒基 - 2 -苯吲哚 (DAPI)荧光标记 ,经结扎的左冠状动脉前降支远端灌注移植入自体急性心肌梗死区域 ,2周、4周和 8周后将犬处死 ,取病理标本行免疫组织化学检测心肌细胞结蛋白表达、组织切片染色观察组织结构。 结果 在梗死区部位观察到带荧光的细胞核及肌纤维 ,部分已分化成横纹肌并以闰盘相连。正常区域心肌细胞结蛋白排列位于心肌细胞 Z线处 ,可见清晰显示的肌小节 ;梗死区心肌细胞结蛋白表达明显高于正常区域心肌细胞 ,但排列紊乱 ,整个心肌细胞均见阳性表达的结蛋白 ,未见肌小节 ;4周、8周时治疗组部分梗死心肌细胞已恢复排列并重见肌小节 ,但梗死区心肌细胞结蛋白表达仍明显高于正常区域心肌细胞 (P<0 .0 1)。 结论骨骼肌卫星细胞梗死心肌移植后对梗死心肌的组织结构起到了保护作用 。

蛋白激酶C在脂多糖致心肌细胞骨架结蛋白损伤中的作用

目的观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对心肌细胞结蛋白(desmin)结构形态和数量的影响,并探讨蛋白激酶C (protein kinase C,PKC)信号通路在LPS作用过程中起的作用。方法体外培养Wistar乳鼠心肌细胞,随机分为4组,分别是正常对照组、LPS组(100ng/ml LPS)、Calphostin C处理组(40mmol/L Calphostin C+100ng/ml LPS)和12-o-十四烷酰佛波醋酸酯- 13(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)处理组(100mmol/L TPA),每组分别处理6h和8h。使用免疫荧光技术标记心肌结蛋白,在共聚焦显微镜下观察细胞内结蛋白的结构、分布并计算细胞内结蛋白荧光强度。结果正常对照组结蛋白均匀分布于除细胞核的胞质内,并在局部有明显的聚集增加,荧光强度为(45.57±2.96);LPS 6h组结蛋白分布和荧光强度与正常组相比差异无统计学意义,LPS 8h组结蛋白在细胞内分布与正常相比差异有统计学意义,且荧光强度显著减弱(31.33±2.23,P<0.01);Calphostin C 6h和8h处理组的结蛋白分布以及荧光强度与正常组接近;TPA处理6h即可造成结蛋白荧光显著减弱(33.30±1.15,P<0.01),且结蛋白有异常的纤维样聚集。结论LPS可以影响心肌细胞内结蛋白的结构、分布和数量,并存在一定的时效关系,而Calphostin C可抑制LPS造成的心肌细胞骨架蛋白结蛋白的改变,而TPA则可在较短的时间内造成与LPS相似的结果,提示PKC可能参与了LPS对结蛋白破坏的过程。

升主动脉缩窄大鼠左室心肌细胞结蛋白重构

目的 :通过观察左室心肌细胞结蛋白在升主动脉缩窄后心肌肥厚期和心力衰竭期的表达 ,探讨心肌肥厚和心力衰竭发生的机理。方法 :制作大鼠升主动脉缩窄动物模型 ,间接免疫荧光技术检测游离心肌细胞内结蛋白的分布 ,WesternBlot技术检测新鲜心肌组织中结蛋白的表达。结果 :心肌肥厚组和心力衰竭组左室心肌结蛋白表达与对照组相比明显增多 ;心力衰竭组结蛋白纤维在心肌细胞内的分布与对照组相比无明显差异。结论 :心肌细胞结蛋白表达的改变是慢性后负荷性心肌肥厚向心力衰竭转变的重要因素.

肌肉标志结蛋白单抗的研制与初步应用

以鸡胗为材料提纯结蛋白,经鉴定后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立了能稳定分泌抗结蛋白单抗的杂交瘤细胞株AD1,其染色体中位数为77。AD1单抗属小鼠Igg1亚类;ELISA间接法测定AD1细胞培养上清抗体效价为10^(-4);酶联免疫印迹试验显示能特异地与结蛋白起反应;经ABC-AEC免疫酶组化法鉴定组织特异性,AD1单抗具有特异地识别肌肉组织和肌源性肿瘤的能力,能用于常规病理标本的石蜡切片。AD1单抗对肌源性肿瘤和非肌源性肿瘤的病理诊断与鉴别诊断具有重要应用价值。

转化生长因子β_1和波形蛋白及结蛋白在糖尿病大鼠肾皮质中早期表达的研究

目的 :探讨糖尿病大鼠早期不同阶段转化生长因子β1(TGF-β1)和波形蛋白 (vimentin)、结蛋白 (desmin)在大鼠肾皮质中表达的变化规律及其相互关系。方法 :建立 STZ诱导的 SD大鼠糖尿病模型 ;用 RT- PCR法半定量检测早期各观察时点糖尿病大鼠肾皮质中 TGF-β1和 vimentin、desmin m RNA的表达水平。结果 :1随着糖尿病病情的进展 ,TGF- β1和 vimentin m RNA的表达量分别从模型建立后第 7d和第 14 d起逐渐增多 (P=0 .0 0 1) ,desmin m RNA表达从第 14 d起却逐渐减少 (P<0 .0 5 )。 2糖尿病组的 TGF- β1与 vimentin的 m RNA表达呈正相关 (r=0 .74 0 ,P=0 .0 0 0 ) ,desmin与 TGF- β1的 m RNA表达呈负相关 (r=- 0 .6 95 ,P=0 .0 0 0 ) ,desmin与 vimentin的 m RNA表达也呈负相关 (r=- 0 .5 91,P=0 .0 0 2 )。结论 :糖尿病大鼠早期肾皮质中 TGF- β1和 vimentin的表达逐渐增多 ,desmin的表达却逐渐减少 ,提示 TGF- β1可能促进小管上皮细胞向成纤维细胞转化。