绵羊肺炎支原体研究进展

【现状】绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)是引起绵羊和山羊呼吸系统疾病的主要病原之一,病羊以咳嗽、气喘、流鼻液、消瘦等为主要临床症状。【问题】由于该病原具有广泛的寄主范围,病程长,体外培养困难,对抗菌药物的敏感性难以测定,致使临床选药困难,用药依从性差。因此,目前该病防控缺乏便捷且行之有效的措施,具有较高的病死率,一旦发病对羊产业造成巨大经济损失。【对策】目前有效防控措施为疫苗免疫,但缺乏针对性强的商业化市售疫苗。根据目前抗病育种研究,可以针对绵羊肺炎支原体培育新抗病绵羊品种。【结论】疫苗防控是快速有效的防控措施之一,但由于流行病原无交叉保护性,且成本较高,无法满足新疆羊产业发展需要,因此,培育抗绵羊肺炎支原体的绵羊新品种十分必要且意义深远。

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

绵羊肺炎支原体的分离鉴定及药物敏感性分析

旨在通过收集陕西榆林市某羊场具有呼吸道病史的绵羊肺组织样本,开展病原微生物的分离鉴定及药敏试验。样本经培养后分离得到支原体疑似菌株,对可疑菌株进行形态学、生理生化鉴定,确定为疑似绵羊肺炎支原体(Mesomycoplasma ovipneumoniae)。通过16S rRNA特异性引物扩增获得361 bp目的基因片段。经测序后BLAST分析发现,分离菌株的基因片段均与绵羊肺炎支原体的Y98参考株(GenBank登录号:NR_025989.1)同源性为97.81%,在遗传进化树同一分支,将其命名为绵羊肺炎支原体SY-1菌株。按照梯度稀释SY-1菌液,采用解脲支原体(CCU)计数方法绘制其生长曲线,结果发现绵羊肺炎支原体的最高菌量可达到10^(9)CUU。药物敏感性试验结果显示,SY-1对多西环素高度敏感,对环丙沙星中度敏感,对头孢曲松、庆大霉素、苯唑西林、恩诺沙星和阿奇霉素均显示为低敏感度,而对利福平不敏感。本试验为羊场呼吸道疾病的防治和临床用药提供了参考。

绵羊肺炎支原体致病机制研究进展

绵羊肺炎支原体是引起羊传染性胸膜肺炎的重要病原之一,是一种以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎为特征的慢性呼吸道疾病,给羊养殖业造成了巨大的经济损失和动物生产力的下降。综合近期国内外关于绵羊肺炎支原体致病机制的文献报道,本文对Mo的黏附、免疫损伤机制进行了阐述,以期为我国绵羊支原体性肺炎的研究和防治提供参考。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

新疆部分地区规模化羊场羔羊多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、绵羊肺炎支原体的调查与分析

为了阐明新疆昌吉、石河子、阿勒泰、塔城及喀什5个地区规模化羊场多杀性巴氏杆菌(Pm)、溶血性曼氏杆菌(Mh)、绵羊肺炎支原体(Mo)的流行情况,试验采集以上5个地区290份6月龄内羔羊鼻拭子样本,提取DNA后采用PCR方法检测Pm、Mh、Mo特异性基因,统计Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率、单阳性率、双重阳性率和三重阳性率,对3种病原核酸个体总阳性率进行Spearman相关性分析,并分别统计3种病原在不同月龄、不同地区羔羊中的流行情况,采用卡方检验分别对有呼吸道症状和无呼吸道症状羔羊3种病原核酸的单阳性率、双重阳性率和三重阳性率进行差异显著性分析。结果表明:在290份鼻拭子样本中,Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率分别为6.21%(18/290)、67.24%(195/290)、61.03%(177/290),核酸单阳性率分别为0(0/290)、14.48%(42/290)、8.97%(26/290);Pm-Mh、Pm-Mo、Mh-Mo核酸双重阳性率分别为0.68%(2/290)、0(0/290)和46.55%(135/290),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率为5.51%(16/290)。Pm与Mh的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01),Pm与Mo的核酸个体总阳性率呈显著正相关(P<0.05),Mh与Mo的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01)。Pm主要在4月龄羔羊中流行,而Mh和Mo在各月龄羔羊中均普遍流行;Pm主要在石河子市和昌吉市流行,Mh和Mo在各地区均普遍流行。有呼吸道症状的羔羊Pm、Mh核酸单阳性率及Pm-Mo、Pm-Mh核酸双重阳性率与无呼吸道症状的羔羊均差异不显著(P>0.05);有呼吸道症状的羔羊Mh-Mo核酸双重阳性率极显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.05),Mo核酸单阳性率极显著低于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01)。说明新疆地区羊群存在Pm感染,Mh和Mo呈普遍流行趋势,因此应加强对易感羊群的病原学检测,做好新疆地区羊呼吸道疾病的防控工作。

绵羊肺炎支原体对盘羊杂交羊免疫功能的影响

旨在研究绵羊肺炎支原体(Mo)感染盘羊杂交羊后免疫功能的变化。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测免疫球蛋白(Ig)、核因子κB(NF-κB)信号通路相关细胞因子以及CD4浓度和CD8浓度;按照前期建立的绵羊支原体肺炎发病模型的方法,对6只盘羊杂交羊人工感染发病,设为感染组,另外6只盘羊杂交羊注射等量PBS为对照组;在攻毒第0、7、14、21和28天分别采集静脉血,分离血清,检测IgG、IgA、IgM、NF-κB、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-18(IL-18)、CD4与CD8的浓度。结果:与对照组相比,Mo感染导致盘羊杂交羊血清中IgA与IgM在14 d后显著升高(P<0.05),IgA、IgM、IgG在21 d后极显著升高(P<0.01);NF-κB与IL-1β水平在14 d显著升高(P<0.05),在21、28 d极显著升高(P<0.01);IL-17水平在28 d极显著提升(P<0.01);IL-18水平在21 d后极显著提升(P<0.01);CD4浓度及CD4/CD8比值在14 d显著降低(P<0.01),CD8浓度在14 d后显著升高(P<0.01)。综上,Mo感染盘羊杂交羊后,可刺激宿主的IgA、IgG、IgM水平升高,NF-κB、IL-1β、IL-17和IL-18表达水平上升,CD4浓度降低,CD8浓度升高,使宿主的细胞免疫与体液免疫功能均出现了异常。

绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体的制备

为了解绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白的免疫原性和生物学功能,并获得其鼠源多克隆抗体,试验先以绵羊肺炎支原体基因组DNA为模板,PCR扩增DnaJ基因,将该基因片段插入原核表达载体pET-42b中构建重组质粒pET42b-DnaJ,将重组质粒pET42b-DnaJ转化至BL21(DE3)感受态细胞中,获得重组菌pET42b-DnaJ/BL21(DE3);然后用IPTG对重组菌进行诱导表达,对表达的重组蛋白进行可溶性分析、鉴定和纯化;随后采用生物信息学软件对绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白进行生物信息学分析(亲水性、跨膜区域、B细胞抗原表位、磷酸化位点、二级结构、三级结构、亚细胞定位预测);最后用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并分别通过间接ELISA方法和Western-blot方法检测绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组表达菌在41.5 ku处出现目的条带,与预期大小相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,可与鼠抗His标签抗体特异性结合,纯化后重组蛋白在正确位置出现单一的特异性条带,质量浓度为0.24 mg/mL。经生物信息学分析,绵羊支原体DnaJ蛋白亲水性区域分布在第1~10,12~18,20~30,32~57,61~91,108~129,141~182,190~198,204~228,230~239,247~262,264~281,291~308,311~318,321~337,347~358,361~376位氨基酸位点;为膜外蛋白,无跨膜区域;存在13个B细胞抗原表位,分别分布在5~24,26,28,30~90,111~128,137~209,211~221,246~254,267~273,302~314,323~333,346~356,360~372位氨基酸位点;共存在67个磷酸化位点,其中包含35个丝氨酸位点、18个苏氨酸位点和14个酪氨酸位点;二级结构主要为无规则卷曲和α-螺旋,然后依次为延伸链、β-转角,参与这4种二级结构构成的氨基酸分别占氨基酸总量的48.40%、25.40%、19.79%、6.42%;预测的三级结构与二级结构结果一致;亚细胞定位于细胞质中。制备的绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白鼠源多克隆抗体效价为1∶12800,能与重组蛋白特异性结合。说明绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的免疫原性,由其制备的鼠源多克隆抗体效价较高、特异性较好。

宁夏地区绵羊肺炎支原体感染的流行情况调查

为初步掌握宁夏回族自治区绵羊(滩羊)感染绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)的流行情况,采用建立的Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,对2022-2023年间采集自宁夏地区不同县(区)的400份绵羊鼻拭子样本进行实时荧光定量PCR检测与分析,结果显示,宁夏地区的7个县(区),包括同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县等地的绵羊Mo的检测结果均有阳性。随机采集的绵羊鼻拭子400份中,检测出Mo阳性有329份,平均阳性检出率为82.25%。不同县(区)之间比较,同心县、灵武县、平罗县、永宁县、贺兰县、利通区和盐池县Mo阳性率分别为80.32%、93.42%、79.59%、78.18%、82.25%、80.43%和76.47%,其中灵武县的Mo阳性率最高,与其他几个县(区)的Mo检出率相比均差异极显著(P<0.01),盐池县最低。不同月龄之间比较,3~5月龄Mo检出率最高(100.00%),与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);6~8月龄Mo检出率次之,与1~2月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01);1月龄以内Mo感染率最低(10.00%),与3~5月龄和2~3岁羊检出率相比均差异极显著(P<0.01)。结果表明,所调查的宁夏地区7个羊养殖主要县(区)均有Mo感染,并且流行范围较广且阳性率高,其中滩羊在3~5月龄是Mo感染的高峰阶段。

绵羊肺炎支原体贵州临床分离株GZ1 p109基因序列分析与原核表达

为了探究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)贵州临床分离株GZ1 p109基因生物信息及重组蛋白p109的免疫原性,试验采用PCR扩增Mo p109部分基因并克隆至T克隆载体pMD-19T中,经DNA测序后进行生物信息学分析;将双酶切后的p109基因片段与原核表达载体pColdⅠ连接,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,用IPTG诱导重组蛋白表达,然后进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明:扩增得到的Mo贵州临床分离株GZ1 p109部分基因片段大小为576 bp,编码蛋白的分子量为21.33 ku,由192个氨基酸组成;p109蛋白的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,第1~17,24~35,52~63,72~122,138~148,150~153,161~173,182~192位的氨基酸区段抗原指数相对较高;Mo贵州临床分离株GZ1与Mo 274株(登录号为CP079199)的亲缘关系很近;试验成功构建了pColdⅠ-p109原核表达重组质粒,表达的目的蛋白大小为27 ku,该重组蛋白p109能够与抗Mo阳性血清发生特异性结合。说明试验制备的重组蛋白p109具备良好的免疫原性。

浅谈绵羊肺炎支原体病流行特征、诊断及防控

绵羊肺炎支原体(以前称为卵肺炎支原体)是一种称为嗜血支原体的小型反刍动物的表红细胞寄生细菌,通过苍蝇和受污染的器械进行传播。绵羊肺炎支原体感染会导致幼畜严重溶血性贫血和死亡。本综述总结了目前对羊肺炎支原体的研究,包括流行病学、病理学和临床表现、检测和鉴定、疫苗和控制。旨在为绵羊肺炎支原体感染的防控提供参考。

绵羊肺炎支原体感染小鼠肺泡巨噬细胞模型的建立

为建立小鼠感染模型进一步了解绵羊肺炎支原体的致病机理,将小鼠肺泡巨噬细胞设为对照组(非感染)、感染组(绵羊肺炎支原体感染)并分别进行48 h培养,观察2组细胞的形态变化;收集2组细胞沉淀提取DNA,按照特定PCR体系进行绵羊肺炎支原体检测;应用免疫荧光方法对感染情况进行检测验证。结果:与对照组相比,感染组细胞漂浮聚团较多,贴壁少;PCR检测可见Hsp70基因特异条带;小鼠肺泡巨噬细胞膜外可见橙色荧光。结论:绵羊肺炎支原体感染小鼠肺泡巨噬细胞模型建立成功。

从湖羊肺脏中分离绵羊肺炎支原体的鉴定

从新疆湖羊肺脏病料中分离出一株支原体XJ-3f,用其培养物人工感染80日龄健康绵羊,28d后剖杀,剖检可见肺表面肉粉色实变,显微病理变化为大灶性融合性肺炎。参考国际已知支原体16SrRNA序列,设计一对扩增700bp片段的通用引物,直接提取肺脏组织DNA进行PCR扩增并克隆、测序。将该序列与GenBank中33种支原体序列比较,结果证明该序列与绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)标准株Y-98同源性为99.9%,而与山羊支原体山羊亚种(M.capricolumsubsp.capricolum,Mcc)、丝状支原体山羊亚种(M.mycoidessubsp.Capri,Mmc)、丝状支原体丝状亚种LC型(M.mycoidessubsp.mycoidesLC,M.mmLC)等同源率为81%。以感染羊血清和Y-98与从发病羊肺脏中分离出的三株支原体菌体蛋白进行Westernblot,证明均与感染羊血清有特异性反应,且与Y-98相比无明显差异,故确定分离株为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia)。

绵羊肺炎支原体p113基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.

盘羊体内绵羊肺炎支原体的分离和鉴定

为查明某动物园的盘羊发生呼吸道疾病的原因,本研究在发病的盘羊群中无菌采集28份鼻腔棉拭子和1份肺组织病料样品。采用支原体专用培养基从4份鼻腔棉拭子和1份肺组织病料样品中分离出5株支原体,连续3次克隆纯化后,通过形态观察、理化试验、PCR及基因特征鉴定,证明分离到的支原体均为绵羊肺炎支原体(MO)。将支原体分离株气管接种4只60日龄健康绵羊,10 d后2只绵羊陆续出现呼吸症状,其中1只伴有明显的体温变化,峰值达41.2℃,其余3只人工感染羊和对照组的羊体温变化不明显。35 d迫杀剖检,1只人工感染羊的肺脏前叶粉色实变明显,显微病理变化主要呈现间质增生性肺炎,其它羊肺脏病变不明显;经培养鉴定和PCR检测,从4只人工感染羊的肺脏样品中再次分离出MO。结果表明引起盘羊发病的病原为MO,本研究为野生盘羊支原体肺炎的快速诊断和防治提供参考依据。

绵羊肺炎支原体P71蛋白分段表达及其间接ELISA方法的建立

为研究绵羊肺炎支原体(MO)P71蛋白免疫学相关功能及建立MO的快速检测方法,本研究采用PCR扩增MO P71基因片段,测序后利用生物学软件分析P71蛋白的抗原表位,选取抗原表位富集的3个基因片段P71-1(1 bp^516 bp)、P71-2(505 bp^1 338 bp)和P71-3(1 327 bp^1 905 bp)分别克隆至原核表达载体p ET-32a中进行表达。分别利用western blot和间接ELISA方法对表达产物的免疫原性、反应原性进行鉴定,以筛选的优势抗原蛋白为诊断抗原,通过对反应条件的优化,建立检测MO抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组蛋白P71-3产生的抗体效价最高,与MO阳性血清的结合能力最强,阴阳性临界值为:OD450nm值=0.292。该方法与口蹄疫、小反刍兽疫、副结核、羊布鲁菌病、结核阳性血清均无交叉反应,具有极强的特异性。组内组间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该方法与间接血凝试验对150份临床血清样品进行检测,结果显示,两者符合率为96.67%。本研究为进一步研制MO ELISA检测试剂盒奠定了基础。

中国部分地区绵羊肺炎支原体的基因多态性分析

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在我国部分地区的流行病学特征,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)及限制性片段长度多态性(RFLP)方法对26株Mo基因多态性进行了研究,并利用NTsys-2.10e软件对获得的多态性图谱进行了聚类分析。结果在相似系数为0.70时,26株Mo可分成6个RAPD群或6个RFLP群;相似系数为0.90时,分成18个RAPD群或18个RFLP群;相似系数为1.00时,分成25个RAPD群或26个RFLP群。结果表明,我国Mo存在高度的基因多态性,这种多态性与地域差异相关,与宿主来源也具有一定的相关性。研究结果为了解我国Mo的分子流行病学特征打下了基础,也为建立有效的Mo诊断方法和疫苗研制提供了参考依据。

山羊中绵羊肺炎支原体的分离及鉴定

从四川省乐至县发生胸膜肺炎性传染病的山羊群中采集12个鼻拭子及4个肺组织病料,进行病原分离培养和特异性PCR检测。结果从9个鼻拭子和4个肺组织中分离到支原体,经鉴定均为绵羊肺炎支原体,未发现丝状支原体簇成员及多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。结果表明,绵羊肺炎支原体是引起该山羊群发生胸膜肺炎的病原,同时说明绵羊肺炎支原体也是山羊支原体性肺炎的重要病原之一。