金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae Ma83)几丁质酶的纯化及性质

由金龟子绿僵菌Ma83菌株产生的几丁质酶经硫酸铵盐盐析,Sephadex G-100柱层析,DEAE-纤维素柱层析分离纯化后,得到SDS-PAGE均一样品。酶的最适反应温度为50℃,半失活温度为65℃;酶的最适反应pH值为5.0,酶在pH4.0～7.0范围内较稳定。Ag^+、Co^(2+)、K^+、Mg^(2+)对Ma83几丁质酶有激活作用,而Hg^(2+)、Zn^(2+)、Pb^(2+)对几丁质酶活力有抑制作用。经计算Ma83菌株几丁质酶对胶体几丁质的K_m值为1.05 mg/mL。

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达

几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。用RT-PCR方法,从分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae伽HN1中,扩增得到几丁质酶基因全长,此基因全长为1275bp,登录号为DQ011865,经Blastn分析此基因序列与M.anisopliae E6的chi1基因(AFD2749)同源率为96％。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-chi重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63．3％。菌体经冷冻与超声波破碎后,按DNS法可测得几丁质酶的活性。

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶与谷胱甘肽S-转移酶GST在大肠杆菌中的高效融合表达

使用RT-PCR方法,从高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliaeHN1中,克隆得到一个全长为1 275 bp的几丁质酶基因,经Blast分析此基因序列与M.anisopliaeE6的chi1基因(AF02749)同源率为96%。将此基因克隆到pGEX-6p-1载体上,使之与载体上一个约26kD大小的谷胱甘肽S-转移酶(GST)相连,构建pGEX-chi融合表达载体,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL 21中,经SDS-PAGE结果分析显示:表达出的融合蛋白大小为68 kD,此目的蛋白占表达总量的64.5%。经破碎处理后可检测到几丁质酶活性。

外源糖类和维生素对莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi孢子萌发的促进作用

莱氏绿僵菌Metarhiziumrileyi是重要的昆虫病原真菌,对鳞翅目害虫有很好的防治效果,但存在杀虫速度慢的缺点。为了提高莱氏绿僵菌孢子的萌发速度,缩短对寄主的致死时间,在孢子悬液中分别添加不同糖类和维生素类,以测定外源营养对莱氏绿僵菌孢子萌发的促进作用。配制含有不同浓度糖和维生素的SMY液体培养基后,接种M.rileyi孢子,25℃、180r/min振荡培养,每隔24h,用血球计数板镜检孢子萌发率。结果表明:接种24h后,以10g/L甘露糖、5g/L维生素B6和5g/L维生素C对孢子萌发的促进作用较好,孢子萌发率分别为3.50%、3.67%和0.83%;随着培养时间延长,10g/L甘露糖、5g/L维生素C依然对孢子萌发有较好的促进作用,5g/L维生素B6对孢子萌发的促进作用逐渐降低;进一步测定甘露糖和维生素C对孢子萌发的浓度效应,甘露糖浓度为25.0g/L时对孢子萌发的促进作用最好,维生素C浓度为0.2g/L时最好。以上结果表明,对M.rileyi孢子萌发促进效果最好的外源营养是甘露糖和维生素C,最适浓度分别是25.0 g/L和0.2g/L。

金龟子绿僵菌CQMa421对棉蚜、绿盲蝽的田间防效

棉花是我国重要的经济作物,虫害严重制约了棉花生产,造成棉农的经济损失。目前,化学杀虫剂仍是防治棉花虫害的主要手段,长期使用化学杀虫剂导致棉蚜Aphis gossypii、绿盲蝽Apolygus lucorum产生抗药性,降低防治效果。本研究使用80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂防治棉蚜、绿盲蝽,室内生测结果表明,金龟子绿僵菌CQMa421能有效侵染棉蚜和绿盲蝽,随着浓度的升高,对棉蚜和绿盲蝽的毒力增强。田间试验结果表明,该药剂能有效控制棉花主要害虫棉蚜和绿盲蝽。采用1200 mL/hm 2用量,药后14 d对棉蚜的防效达94.42%;采用1350 mL/hm 2用量,药后14 d对绿盲蝽的防效分别达到87.25%(新疆),91.62%(湖北)。

棕色绿僵菌胞外酶的诱导及发酵液生化特性研究

为了研究不同液体培养基及诱导物对棕色绿僵菌作用过程中胞外酶的最佳诱导条件和发酵液的生化性质,从而在对家畜外寄生虫进行防治过程中更好地利用该菌,在前期研究基础上,试验使用培养效果较好的3种液体培养基加入不同诱导物对棕色绿僵菌进行液体发酵培养,检测发酵液的蛋白质含量、蛋白酶活性、磷酸酶活性以及杀蝇蛆效力等,确定该菌产生胞外酶和杀虫作用最适的培养基与诱导物。结果表明,蝇蛆三期幼虫诱导的枸橼酸培养基发酵液蛋白质浓度较高达404.45 mg/L、蛋白酶活性42.28 U/mL、酸性磷酸酶活性37.06 U/L、碱性磷酸酶11.04 U/L,同时杀蝇蛆效力也是最高的,达60%。因此,枸橼酸液体培养基是产生胞外蛋白质最佳培养基,较好的诱导物为蝇蛆三期幼虫。说明不同培养基及诱导物对棕色绿僵菌的代谢进程会产生显著影响,导致其代谢过程中分泌的蛋白质含量、蛋白酶和磷酸酶的活性产生明显差异,对杀蝇蛆效率产生影响。

棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配杀蝇蛆的增效作用

为了研究棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)与高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)复配在蝇蛆防控中的应用,试验测定了高效氯氰菊酯和棕色绿僵菌的相容性,以及单一棕色绿僵菌组、棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯复配制剂组杀蝇蛆毒性试验。结果表明,即使在较高浓度的下,高效氯氰菊酯对棕色绿僵菌的菌丝生长情况、孢子萌发率和孢子产量等无显著影响;高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联合使用确实可以增加棕色绿僵菌对蝇蛆的致死率,其中孢子浓度为1×10^(8)个/mL、1×10^(7)个/mL对蝇蛆的累计死亡率分别从90.0%、86.7%提高到100%;孢子浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(4)个/mL的累计死亡率分别从86.7%、50%和36.7%提高到93.3%、70%和63.3%。说明棕色绿僵菌与高效氯氰菊酯相容性良好,可以一起使用。低剂量的高效氯氰菊酯与棕色绿僵菌联用应用可以降低高效氯氰菊酯的使用量并提高生物防治效果。

棕色绿僵菌最适培养基和杀蝇蛆分生孢子浓度探究

为了研究昆虫寄生性真菌—棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)的最适培养基和杀蝇蛆分生孢子浓度,试验对棕色绿僵菌在不同固体培养基、液体培养基、氯化钠浓度和pH值条件下的生长特征和产孢能力进行了测定,并分别统计不同浓度(1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL)分生孢子悬液处理后第3,5,7天的蝇蛆累计死亡率。结果表明:棕色绿僵菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的菌落直径最大(8.40 cm),然后从大到小依次为PPDA固体培养基(8.20 cm)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(8.10 cm)、枸橼酸固体培养基(7.20 cm)、大豆蛋白胨固体培养基(4.90 cm)、玉米粉琼脂培养基(4.70 cm);在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的分生孢子产量最高(4.830×10^(7)个/mL),然后从高到低依次为PPDA固体培养基(3.070×10^(7)个/mL)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(1.770×10^(7)个/mL)、枸橼酸固体培养基(1.580×10^(7)个/mL)、大豆蛋白胨固体培养基(0.260×10^(7)个/mL)、玉米粉琼脂培养基(0.053×10^(7)个/mL);在萨氏液体培养基中培养第7天时的菌丝干重最高(10.6 mg/mL),然后从高到低依次为马铃薯液体培养基(8.0 mg/mL)、沙氏葡萄糖液体培养基(7.1 mg/mL)、玉米浸液液体培养基(0.2 mg/mL);在萨氏液体培养基中培养第7天时的分生孢子产量最高(5.29×10^(7)个/mL),然后从高到低依次为马铃薯液体培养基(2.86×10^(7)个/mL)、沙氏葡萄糖液体培养基(2.71×10^(7)个/mL)、玉米浸液液体培养基(1.53×10^(7)个/mL)。棕色绿僵菌在氯化钠浓度为0.15 mol/L或pH值为8的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养第21天时的菌落直径最大,分生孢子产量最高。用棕色绿僵菌分生孢子悬液(浓度分别为1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL、1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL)处理第3天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为13.3%~40.0%;处理第5天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为26.7%~66.7%;处理第7天,家蝇三期幼虫的累计死亡率为40.0%~90.0%。浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL的分生孢子悬液处理第7天时家蝇三期幼虫的累计死亡率显著高于浓度为1×10^(4)个/mL、1×10^(5)个/mL的分生孢子悬液(P<0.05),且浓度为1×10^(6)个/mL、1×10^(7)个/mL和1×10^(8)个/mL的分生孢子悬液处理第7天时家蝇三期幼虫的累计死亡率之间差异不显著(P>0.05)。说明棕色绿僵菌的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基和萨氏液体培养基,培养基最适氯化钠浓度为0.15 mol/L、pH值为8;棕色绿僵菌分生孢子悬液对蝇蛆有较强的侵染杀灭作用,推荐的杀蝇蛆浓度为1×10^(6)个/mL。

莱氏绿僵菌Mr006鉴定及对草地贪夜蛾致病力

收集草地贪夜蛾致病性莱氏绿僵菌,丰富昆虫病原真菌资源,为草地贪夜蛾绿色防控生防制剂开发提供依据。采用形态学和ITS-r DNA序列分析相结合的方法对菌株Mr006进行了鉴定,以浸渍法生物测定了该菌株对草地贪夜蛾幼虫和蛹的致病力,并进行了田间应用效果评价。结果表明,分离的Mr006菌株鉴定为莱氏绿僵菌;该菌株对草地贪夜蛾幼虫、蛹均有致病力,用孢子浓度为1×10^(7)孢子/mL接种后,1~5龄幼虫的校正死亡率分别为91.16%、88.38%、70.71%、53.03%和22.73%,蛹的校正死亡率为76.26%;对草地贪夜蛾1~5龄幼虫和蛹的LC50分别为3.55×10^(4)、8.23×10^(4)、3.63×106、4.16×10^(7)、4.23×10^(8)和2.57×10^(5)孢子/mL;用孢子浓度为1×10^(8)孢子/mL接种后,1~5龄幼虫和蛹的LT50值分别缩短至3.47、3.94、4.90、6.73、9.01 d和4.02 d。田间喷施莱氏绿僵菌Mr006分生孢子悬浮液后20 d,对草地贪夜蛾田间防治效果可达64%以上,持效性较好。莱氏绿僵菌Mr006对草地贪夜蛾致病力强,具有较好的生防潜力。

金龟子绿僵菌制剂对二化螟的防效及体内相关酶活性的影响

用剂量为1.6×10^(7)/mL的金龟子绿僵菌CQMa421制剂处理二化螟幼虫,测定该制剂对二化螟幼虫的毒力及其对幼虫总蛋白含量及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等3种保护酶活性和羧酸酯酶(CarE)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、碱性蛋白酶(AKP)和谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)等4种解毒酶活性的影响。结果表明:经金龟子绿僵菌制剂处理后,二化螟幼虫的存活率呈持续下降趋势,半致死时间(LT_(50))为7.23 d,第10天死亡率为56.89%,说明金龟子绿僵菌制剂对二化螟幼虫具有显著毒力;金龟子绿僵菌制剂处理3d时,二化螟幼虫蛋白质含量最高;POD、CAT、SOD等3种保护酶活性分别在处理2、4、5 d时达到最高,分别为198.76、19.59和12.90 U/mg,均显著高于对照组相应酶的活性;4种解毒酶GSTs、AChE、CarE和AKP最高活性分别约为对照组的1.68、1.68、1.27和1.62倍,说明经金龟子绿僵菌制剂CQMa421处理后,二化螟幼虫体内稳态遭到破坏,进而受到毒害。

绿僵菌粗毒素对竹织叶野螟幼虫血细胞的影响

通过测定不同浓度梯度(200、500、1000、2000、5000 mg·L^(-1))绿僵菌粗毒素对竹织叶野螟幼虫的杀虫活性,及竹织叶野螟幼虫取食绿僵菌粗毒素(浓度为5000 mg·L^(-1))后其血细胞浓度和形态的变化,研究绿僵菌粗毒素对织叶野螟幼虫血细胞的影响。结果表明:以浓度为5000 mg·L^(-1)的绿僵菌粗毒素,采用浸叶法喂食4~5龄竹织叶野螟幼虫9 d后,幼虫的累计校正死亡率达97.37%,致死中时为3.91 d。竹织叶野螟幼虫取食粗毒素后,随着处理时间的延长其体内总血细胞浓度先升高后下降,在处理时间为2 d时达到最大值,为5.92×10^(6)个·mL^(-1),极显著高于对照(P<0.01)。各血细胞中,粒血细胞浓度、浆血细胞浓度均随着处理时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势,且均在处理时间为2.0 d时达到最高值,分别为26.99×10^(5)、22.85×10^(5)个·mL^(-1),极显著高于对照(P<0.01);原血细胞、珠血细胞浓度分别在处理时间为1.5、2.0 d时达到最高值,极显著高于对照(P<0.01),随后急速下降;而类绛色血细胞浓度随着处理时间的延长总体呈下降趋势。在对竹织叶野螟幼虫取食绿僵菌粗毒素后其各类血细胞比例分析中发现,粒血细胞比例较高,为42.1%~47.9%,浆血细胞随着处理时间的延长比例显著升高(P<0.05),在处理时间为3.5 d时比例升至最高,为39.9%。显微观察发现,幼虫取食绿僵菌粗毒素后,当处理时间为2 d时,血细胞出现破裂、空泡化、内含物外流等现象。可见,绿僵菌粗毒素对竹织叶野螟幼虫有较强的毒力,且2~3 d对其血细胞的浓度和形态有较大影响。

miR-120对台湾乳白蚁抵御绿僵菌的免疫反应的影响

本研究探究了miR-120在台湾乳白蚁Coptotermes formosanus抵御绿僵菌Metarhizium anisopliae的免疫反应中的作用。研究发现通过对台湾乳白蚁注射miR-120 agomir以增加白蚁体内miR-120的含量后,台湾乳白蚁的存活率降低约35%,绿僵菌对台湾乳白蚁的致死率提升约55%,同时显著抑制了台湾乳白蚁对绿僵菌的趋避反应。双荧光素酶报告系统等试验证实了miR-120靶向结合免疫基因Draper。通过对Draper进行注射法RNAi后,得到了类似于注射miR-120 agomir后的结果。研究结果表明,miR-120通过抑制靶基因Draper的表达,抑制了台湾乳白蚁抵御绿僵菌的免疫反应,最终导致台湾乳白蚁的存活率显著下降。该结果有助于进一步理解白蚁的免疫机制,并为开发抑制白蚁免疫防御反应的技术方法提供理论基础,有助于促进白蚁生物防治的发展。

平沙绿僵菌SG-A两种培养基比较及其对瓜绢螟的致病活力

为比较平沙绿僵菌SG-A在两种培养基上的生物学特性及对瓜绢螟不同虫态的致病力,室内测定了平沙绿僵菌SG-A在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和萨氏培养基(SDAY)上培养14 d后的菌落大小、产孢量及孢子萌发率等指标,并采用浸虫法测定了对瓜绢螟不同虫态的致病力。结果表明,平沙绿僵菌SG-A在PDA培养基中培养14 d后的产孢量显著高于SDAY培养基,菌落大小和孢子萌发率差异不显著。平沙绿僵菌SG-A对瓜绢螟2龄、4龄幼虫和蛹均存在较高的致病力,孢子浓度越大,致病力越高,其中对蛹的致病力最高,LC_(50)为1.93×10^(5)个·mL^(-1),当孢子浓度为1×10^(8)个·mL^(-1)时,处理8 d蛹的累积死亡率为90%,2龄和4龄幼虫的累积死亡率也分别达到86.67%和83.33%,但4龄幼虫出现死亡的时间要早于蛹和2龄若虫,LT_(50)为2.60 d。综上所述,平沙绿僵菌SG-A对瓜绢螟各虫态均具有较高的致病力,可进一步挖掘其生防潜力。

莱氏绿僵菌与常见化学农药的相容性研究

为明确莱氏绿僵菌Nr5772菌株与常见化学农药的相容性,本研究采用平板法测定了5种杀菌剂(苯醚甲环唑、甲基硫菌灵、戊唑醇、嘧菌酯、吡唑醚菌酯)和5种杀虫剂(吡虫啉、联苯菊酯、啶虫脒、阿维菌素、毒死蜱)对莱氏绿僵菌菌丝生长的影响。结果表明,5种杀菌剂几乎完全抑制莱氏绿僵菌的生长,相容性极差。杀虫剂联苯菊酯EC_(50)为12926.61 mg/L,与莱氏绿僵菌的相容性最好;吡虫啉、阿维菌素、啶虫脒EC_(50)分别为724.21、264.60、158.49 mg/L,远高于田间常规使用剂量,与莱氏绿僵菌也具有良好的相容性;毒死蜱的EC_(50)为283.38 mg/L,接近其田间常规使用剂量,对莱氏绿僵菌具有较强的抑制作用。综上,在本试验条件下,苯醚甲环唑等5种杀菌剂完全不能与莱氏绿僵菌混用,联苯菊酯、啶虫脒、阿维菌素和吡虫啉4种杀虫剂可与莱氏绿僵菌混用。

《Plos Pathogens》刊发黄勃团队绿僵菌病毒研究最新进展

近日,我校林学与园林学院黄勃教授团队首次在国际知名学术期刊《公共科学图书馆病原体》(《Plos Pathogens》)(IF=7.464,中科院1区,TOP期刊)发表了题为《一种新双分病毒调控虫生真菌大孢绿僵菌的产孢、压力应答、杀虫能力和次生代谢产物》(《A novel partitivirus orchestrates conidiation,stress response,pathogenicity,and secondary metabolism of the entomopathogenic fungus Metarhizium majus》)的研究论文。

金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435对红火蚁毒力及聚硅氧烷的增效作用研究

为探索红火蚁Solenopsis invicta的生物防治方法,本文系统评估了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421和球孢白僵菌Beauveria bassiana ZJU435对红火蚁的毒力以及聚硅氧烷对其的增效作用,并评估了两株虫生真菌对红火蚁的田间防治效果。结果显示,以处理第10天时的死亡率计算,金龟子绿僵菌CQMa421对红火蚁工蚁的致死中浓度LC_(50)为9.16×106孢子/mL;以8×10^(8)孢子/mL的死亡率计算,其对红火蚁工蚁的致死中时LT_(50)为3.534 d。以处理第10天时的死亡率计算,球孢白僵菌ZJU435对红火蚁工蚁的致死中浓度LC_(50)为1.5×10^(5)孢子/mL;以1×10^(9)孢子/mL的死亡率计算,其对红火蚁工蚁的致死中时LT_(50)为0.218 d。混入0.5μL/mL及以上浓度的聚硅氧烷可显著提高低浓度金龟子绿僵菌CQMa421及球孢白僵菌ZJU435对红火蚁毒力。田间试验结果显示,混入0.5μL/mL聚硅氧烷的3.2×10^(7)孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421和4×10^(7)孢子/mL球孢白僵菌ZJU435对红火蚁的综合防效分别为83.99%和90.44%,低于商品制剂0.1%茚虫威饵剂的综合防效93.89%。研究结果表明,金龟子绿僵菌CQMa421和球孢白僵菌ZJU435对红火蚁具有较高毒力,在红火蚁生物防治中具有较高开发潜力。

苦皮藤素与绿僵菌复配对茶角胸叶甲的毒力及田间防效

为筛选茶角胸叶甲有增效作用的复配药剂并评价其田间药效,通过胃毒触杀联合毒力法测定苦皮藤素和绿僵菌在不同配比下对茶角胸叶甲的共毒系数。室内毒力测定表明苦皮藤素和绿僵菌的配比3∶2、4∶1和7∶3的共毒系数分别为178.10、160.42和134.74,说明复配药剂对茶角胸叶甲有增效作用。综合联合毒力以及用药成本因素,选用苦皮藤:绿僵菌为4∶1的配比做田间药效试验。结果表明,处理后3 d、7 d对茶角胸叶甲的防效分别为73.98%和81.87%,高于单剂处理。

金龟子绿僵菌生物药剂防治稻飞虱的田间药效试验

为了探讨生物药剂80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂对稻飞虱的防效,开展了80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂与常规化学药剂(60%吡蚜·呋虫胺可湿性粉剂、80%烯啶·吡蚜酮水分散粒剂和25%吡蚜酮悬浮剂)及80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂不同用量(975、1 125、1 275 mL/hm^(2))飞防稻飞虱的田间药效试验。结果表明,药后3、7、14 d,生物药剂80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂975 mL/hm^(2)处理对稻飞虱的防效均低于常规化学药剂,在速效性、持效性方面略显不足。药后14 d,80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂1 125 mL/hm^(2)处理对稻飞虱的防效超过85%,不及化学药剂,但也能将稻飞虱控制在安全范围内,且其对水稻植株和天敌生物表现出很好的安全性,不污染环境。建议在稻飞虱防治中应用金龟子绿僵菌CQMa421类生物药剂,可在虫量较少时应用。

国内外杀虫绿僵菌(Metarhizium spp.)制剂专利申请现状与分析

本文通过检索并分析绿僵菌制剂领域的专利申请文件,从中获得了国内外专利申请发展趋势、主要专利申请人、专利地区分布情况等信息,分析了该领域中涉及的主要技术分支,这对促进我国真菌农药的研究和应用具有积极意义。