重组羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用

用RT-PCR方法克隆了大鼠羧肽酶原B的cDNA编码序列,将其重组到原核表达质粒pT7-473中,并在大肠杆菌中以包涵体方式获得高表达。SDS-PAGE电泳及灰度扫描显示表达量达菌体总蛋白的35%,表达产物融合了表达质粒上的6His。在变性条件下,经Ni-NTA柱纯化,得到羧肽酶原B,在复性液中进行稀释复性后,胰蛋白酶切得具酶活性的羧肽酶B,然后经DEAE-FF分离纯化获得较纯的羧肽酶B(28.5mg/L),比活为13.5u/mg。用RP-HPLC分析胰蛋白酶+羧肽酶B酶解胰岛素原C肽三聚体的酶解产物,证明该重组的羧肽酶B可替代提取的羧肽酶B应用于胰岛素原C肽的制备工艺中。

羧肽酶B研究进展

羧肽酶B是重组胰岛素生产中的一个必需工具酶,同时在蛋白质测序等领域中也得到广泛应用。文章综述了羧肽酶B的结构、测活方法、性质、稳定性及储存条件、提取方法、基因工程方法生产羧肽酶B的研究及重组羧肽酶B的性质等。

鼠抗人肥大细胞羧肽酶截短体抗体的制备与鉴定

目的建立检测人肥大细胞羧肽酶(hMCCP)的双抗体夹心ELISA法,以hMCCP截短体免疫小鼠,制备鼠源性多克隆抗体。方法PCR法扩增hMCCP-N118基因片段,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化目的蛋白。用纯化重组蛋白免疫小鼠,制备抗hMCCP-N118抗体。间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。结果hMCCP截短体在大肠杆菌中高效表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗hMCCP-N118抗体,效价达1∶6 400,该抗体能特异结合hMCCP。结论成功地制备了效价高、特异性好的鼠抗hMCCP截短体抗体。

拟南芥丝氨酸羧肽酶类蛋白家族的基因组学分析

基于隐马可夫模型,利用已知丝氨酸羧肽酶(SerineCarboxypeptidases,SCP)氨基酸序列作为训练集,搜索拟南芥全蛋白质组数据库,鉴定了54个推定的SCPL(丝氨酸羧肽酶类,SerineCarboxypeptidaseLike)基因,详细分析了各基因的结构特征、染色体定位与编码的蛋白质序列,发现7个可能最近发生复制事件的基因簇聚区,并且其SCPL基因广泛存在交替剪接方式。系统进化分析表明,88.9%基因编码的蛋白质属于双链羧肽酶Ⅰ或Ⅱ亚族,仅11.1%蛋白质属于单链羧肽酶Ⅲ亚族,暗示SCP蛋白不仅具有独特拓扑结构的催化中心与高度保守的“α/β水解酶折叠”三级结构,其DNA或蛋白质序列特征也可以作为系统进化研究依据。

猪胰腺羧肽酶B提取工艺中的激活条件与稳定性研究

目的研究猪胰腺羧肽酶B提取工艺中的激活条件以及激活后粗酶液的稳定性,并对酶进行纯化。方法胰腺匀浆、激活,硫酸铵盐析进行初步提取,采用疏水色谱、离子交换色谱和分子筛等方法进行纯化,对胰腺匀浆后的粗酶激活条件进行了研究,考察了不同保存条件下粗酶液的稳定性。结果纯化后的羧肽酶B经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯。比活为152 u/mg,纯化过程的活性总回收率为51%。粗酶液中羧肽酶B的激活受各种条件影响,特别是激活温度和激活时间,4℃下激活80 h,或37℃下,激活6.5 h,均可获得最大酶活,激活后的粗酶液可直接于35%(NH4)2SO4中保存,保存60 h的酶活损失小于5%。结论通过调整激活温度与激活时间可以获得猪胰腺羧肽酶B粗酶液最大的激活效果,激活后的粗酶液可于35%(NH4)2SO4中短期保存。

血清肥大细胞羧肽酶与支气管哮喘的相关性研究

目的:检测支气管哮喘患者外周血中肥大细胞羧肽酶的含量,研究其与哮喘患者FEV 1(%)、IgE的关系,探讨其在支气管哮喘发病机制中的作用。方法:35例临床确诊为中重度持续性支气管哮喘患者作为病例组,均行肺功能及IgE水平检测,依据血清IgE水平将支气管哮喘患者分为IgE升高组(n=20)和IgE正常(n=15)。另外,选取22名健康者作为对照组,采用ELISA法检测受试者血清肥大细胞羧肽酶水平。比较支气管哮喘患者与健康者血清中肥大细胞羧肽酶水平;分析血清肥大细胞羧肽酶水平与IgE及肺功能的相关性。结果:IgE升高组患者血清肥大细胞羧肽酶水平明显高于IgE正常组(P<0.05);支气管哮喘急性发作期患者血清肥大细胞羧肽酶水平明显高于健康对照组(P<0.05);另外,哮喘急性发作期患者血清肥大细胞羧肽酶水平与患者FEV(%)呈明显的负相关;缓解期血清肥大细胞羧肽酶水平与FEV1(%)无相关性(r=-0.421,P=0.012;r=-0.284,P=0.099)。结论:血清肥大细胞羧肽酶可能参与了支气管哮喘急性发作的气道炎症反应。

羧肽酶研究进展

羧肽酶(Carboxypeptidase)是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,广泛存在于高等植物、动物组织及真菌中,主要分为丝氨酸羧肽酶(EC3.4.16.-)、金属羧肽酶(EC3.4.17.-)和半胱氨酸羧肽酶(EC3.4.18.-)3个亚类。作者综述了羧肽酶的研究进展,主要包括羧肽酶的应用、性质、来源分布、克隆表达及研究意义,并对其研究前景进行了展望。

利用米曲霉羧肽酶由玉米蛋白粉制备高F值寡肽

本文简述了酶法水解玉米醇溶蛋白制备高F值寡肽的主要工艺步骤。重点考察了米曲霉固态发酵产生羧肽酶的影响因素,碱性蛋白酶和米曲霉羧肽酶两次酶解蛋白后的寡肽分子量分布,活性炭吸附去除寡肽中芳香族氨基酸的效果。

活血化瘀消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠肾组织血管紧张素转化酶相关羧肽酶表达的影响

目的观察活血化瘀消癥通络中药对糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织血管紧张素转化酶相关羧肽酶(ACE2)表达的影响,探讨该药对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制。方法采用链脲佐菌素诱发糖尿病肾病大鼠模型,分为正常组、模型组、洛汀新组及活血化瘀消癥通络中药组。测定各组大鼠尿蛋白(urine protein,Upro)、糖化血红蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG),分别用光镜及电镜观察各组大鼠肾脏结构改变,应用免疫组化技术及图像采集分析系统测定各组大鼠肾组织ACE2蛋白的表达。结果中药组可降低尿Upro、BUN、Scr、TC、TG水平(P<0.05),减轻肾小球基底膜增厚程度,升高ACE2表达。结论活血化瘀消癥通络中药可能部分是通过调节肾脏ACE2表达从而减轻细胞外基质沉积,保护糖尿病肾病大鼠的肾功能。

兔抗人肥大细胞羧肽酶抗体的制备与鉴定

目的:以原核表达的人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)免疫家兔,制备兔抗hMC-CP多克隆抗体并进行鉴定。方法:在大肠杆菌中诱导表达重组hMC-CP,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗hMC-CP多抗,并以间接ELISA测定抗体效价,以Western blot鉴定抗体的特异性。结果:成功地表达并纯化了hMC-CP,以纯化的重hMC-CP组免疫家兔成功制备了兔抗hMC-CP抗体,ELISA结果显示效价达1∶6 400,Western blot分析表明该抗体能特异结合hMC-CP。结论:以纯化的重组hMC-CP为免疫原,成功地制备了效价、特异性较强兔抗hMC-CP抗体,为进一步建立简便的hMC-CP检测方法及进一步研究hMC-CP生物学功能打下了良好的基础。

羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究

目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关。为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN)。CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用。CPN是分子量280kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83kD调节亚单位。核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA。前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录。前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用。核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621nt)。CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达。方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MluⅠ和NheⅠ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点。用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上。核心启动子经MluⅠ和NheⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞。结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1％琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp。重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功。脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加。通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达。结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础。

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases,SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24h后,以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列,命名为ZmSCP。结果显示,该基因全长为1874bp(GenBank登录号为JF682634),开放阅读框为999bp,编码332个氨基酸,相对分子量为36.505kD,等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性,同源性比例范围为42%～81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近,属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域,属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明,ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下,总体均呈诱导表达的趋势。其中,在立枯丝核菌AG1-IA诱导下,ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势,第1次诱导出现在接菌后24h,然后下降,第2次诱导出现在接菌后60h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下,ZmSCP基因表达均呈现上调趋势,表达高峰均出现在胁迫后48h。

人羧肽酶A的cDNA克隆和原核表达

目的:获得人羧肽酶A基因,为进一步构建、表达抗人精浆蛋白单链抗体/羧肽酶A融合蛋白,用于前列腺癌的抗体导向酶-前体药物疗法奠定基础。方法:从人正常肺组织中提取总RNA,经反转录PCR分离人羧肽酶A基因,并克隆入pUC19质粒中,用全自动荧光测序仪测定其序列。将该目的基因插入pBV220载体,并转入大肠杆菌DH5α中,经热诱导表达重组蛋白。结果:获得了人羧肽酶A基因(由1251bp组成,可编码417个氨基酸),与国外发表的人羧肽酶AcDNA序列一致。表达的重组蛋白以SDSPAGE分析,在Mr为49000左右处出现1条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的17%。结论:成功地克隆人羧肽酶A基因,为构建表达抗人精浆蛋白/羧肽酶A的双功能抗体奠定了基础。

雅致放射毛霉3.2778羧肽酶性质及其活性中心结构的研究

固态发酵雅致放射毛霉菌株(Actinomucor elegans)3.2778得到羧肽酶粗酶液,以N-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)为底物,采用镉-茚三酮法测定羧肽酶水解产物。结果表明:雅致放射毛霉3.2778羧肽酶最适作用pH值范围为6.5～7.2,最适作用温度范围在40℃～45℃,最适作用温度为40℃,在30℃～40℃具有良好的温度稳定性。0.99mmol/L金属离子中,Mg2+对羧肽酶活力表现出显著的促进作用,酶活提高37%;而Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+可以抑制绝大部分酶活,残留的相对酶活力约10%。9.1mmol/L金属蛋白酶抑制剂1,10-邻菲啰啉(OP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基磷酰氟(DFP)均可以完全抑制该酶活性,同时,对巯基有修饰作用的蛋白酶抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶有强烈的抑制作用。因此,推断该酶可能是一种丝氨酸羧肽酶,其活性中心有丝氨酸残基和二硫键结构,酶活受Mg2+激活。

紫外线-氯化锂复合诱变选育羧肽酶高产菌株

对米曲霉3.042进行了紫外线-氯化锂复合诱变,筛选制霉素抗性突变株,并进行固体发酵筛选试验,共筛选出了5株正突变株。经固体发酵筛选实验,获得了一株遗传性状稳定的羧肽酶高产菌株。

尿羧肽酶B激活肽在重症急性胰腺炎中的临床应用价值

重症急性胰腺炎Severe Acute Pancreatitis，SAP）是普外科中的一种常见病。其发病急，临床表现复杂，病程进展迅速，极易引起多脏器功能损害，病死率高达20％，因此快速准确诊断SAP并及早治疗十分重要。淀粉酶（Amylase，Amy）或脂肪酶（Lipase，Lip）检测是诊断急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）常用的实验方法，但其灵敏性和特异性不尽如人意。尿液羧肽酶B激活肽（Carboxypeptidase B Activation Peptide，CAPAP）胶体金检测卡是一种新的诊断SAP的实验方法。本研究旨在评估CAPAP检测对SAP的诊断价值。

鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定

为了在毕赤酵母中表达鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,PEG1000介导转入毕赤酵母GS115细胞,在甲醇的诱导下,实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达。通过发酵条件的优化,使用BMGY(pH6·0)培养基,添加0·5%的酪蛋白水解物,于28℃,在起始OD600达10·0时,每隔12h补加0·5%的甲醇,重组酵母GS115-proCPB表达的产物量可达到最高(500mg/L),表达时间可达120h,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上。通过纯化条件的优化,采用两步疏水层析,可使目的蛋白的纯度达96%以上,蛋白得率达38%,重组proCPB活化后所得CPB的比活力可达110u/mg(CPB标准品为180u/mg)。相对分子量测定表明重组蛋白的分子量与理论值极相近,N-端氨基酸测序进一步表明proCPB基因在毕赤酵母中得到了正确的表达和翻译后加工修饰。

羧肽酶A/B亚家族

羧肽酶A/B是一类水解蛋白质或多肽C 端氨基酸残基的外肽酶。众多学者对其特性、结构及功能进行了深入的研究,最近的研究显示羧肽酶A/B具有一些新的功能。此文拟对羧肽酶A/B亚家族成员的特性、结构特征。

植物丝氨酸羧肽酶及其类蛋白的研究进展

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases,SCP)是一类属于α/β水解酶家族的蛋白酶,在植物生长发育过程中参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节,并且在许多生化途径包括次生代谢产物的生物合成、催化酰基转移、除草剂共轭和种子萌发相关蛋白质降解中起重要作用。介绍和评述了植物丝氨酸羧肽酶及其类蛋白的种类、特点、功能及其基因的表达调控,并对植物丝氨酸羧肽酶及其类蛋白的研究方向和应用提出了展望。

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidaseA1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.