电针治疗调节miR-183对噪声性耳聋模型耳蜗毛细胞VEGF表达的影响

目的:探讨电针治疗调节miR-183对噪声性耳聋(NIHL)模型耳蜗毛细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响与作用机制。方法:将雄性SD大鼠随机均分为空白对照组、NIHL组、NIHL+针刺组、NIHL+针刺+腺病毒(AAV)-NC组和NIHL+针刺+AAV-sp-miR-183组。针刺组取中渚穴进行刺激。利用AAV载体在NIHL大鼠中敲低miR-183。各组大鼠进行听觉脑干反应(ABR)评估与毛细胞计数。qRT-PCR分析大鼠耳蜗组织miR-183水平。蛋白质免疫印迹测定VEGF水平。结果:与对照组相比,NIHL组耳蜗组织中miR-183的水平降低,ABR阈值差与毛细胞的缺失率升高,耳蜗毛细胞VEGF表达的水平升高(P<0.05)。与NIHL组相比,NIHL+针刺组耳蜗组织中miR-183的水平上升,ABR阈值差与毛细胞的缺失率降低,耳蜗毛细胞VEGF表达的水平升高(P<0.05)。NIHL+针刺+AAV-sp-miR-183组与NIHL+针刺+AAV-NC组相比,miR-183的水平降低,ABR阈值差与毛细胞的缺失率升高,耳蜗毛细胞VEGF表达的水平降低(P<0.05)。结论:电针治疗可以通过上调miR-183进而促进NIHL大鼠耳蜗毛细胞VEGF的表达,降低噪音诱导的NIHL大鼠ABR阈值差增高与毛细胞损伤。

不同种属实验动物耳蜗毛细胞年龄相关性缺失的不同模式

目的展示自然衰老和耳聋相关基因遗传缺陷之间耳蜗毛细胞缺失的不同模式。方法用不同龄的长尾猴、南美栗鼠、豚鼠、Sprague-Dawley大鼠、CBA/CaJ小鼠、C57BL/6J小鼠、A/J小鼠、DBA/2J小鼠和侏儒灰色突变纯合子(dwg/dwg)小鼠作为受试对象。所有测试动物的耳蜗基底膜都被制作成平坦的耳蜗基底膜铺片。沿着耳蜗基底膜的全长,基底膜上所有的内外毛细胞都被完整计数,毛细胞的计数结果被输入到耳蜗图软件并自动生成每组实验条件的平均耳蜗图。结果在天然衰老的动物中,耳蜗毛细胞的缺失总是发生在老年阶段。与此不同的是,在耳聋相关基因缺陷的动物中,耳蜗毛细胞的缺失却是发生在青年阶段甚至幼年阶段。发生在天然老化动物的耳蜗毛细胞缺失总是呈均匀分布或从耳蜗的顶回向底回扩展。但是,发生在具有耳聋相关基因遗传缺陷动物的耳蜗毛细胞缺失却通常表现为从耳蜗的底回向顶回扩展。结论本实验观察结果表明,发生在天然衰老的不具备耳聋相关基因缺陷动物身上的年龄相关性耳蜗毛细胞缺失反映的是真正由衰老引起的耳蜗退化性病变,而发生在伴有耳聋相关基因遗传缺陷的年幼动物身上的年龄相关性耳蜗毛细胞缺失可能与耳聋相关基因的遗传缺陷有关。

增龄相关听力丧失小鼠耳蜗毛细胞表型与基因突变的关系

目的 观察增龄相关听力丧失 (AHL)小鼠耳蜗毛细胞病理改变的超微结构 ,为老年性聋病理生理及临床表现+基因表型提供形态学改变依据。方法 应用扫描电镜 (SEM)观察BALB/c小鼠耳蜗Corti器毛细胞的超微结构改变 ,测定动物ABR反应阈值。DNA提取PCR扩增分析基因型。结果 6月龄BALB/c小鼠耳蜗底回内外毛细胞有连续的缺失 ,静纤毛束有融合、散乱、变短和失去劲度。ABR阈值呈中到重度听力损失。证明种系特异的Ahl基因位点和基因功能。结论 耳蜗毛细胞静纤毛束融合、散乱、变短是老年性聋早期的主要病理改变 ,mdfw与Ah1的表现形式是同一基因位点 ,可能与myosin基因突变有关。

2型糖尿病小鼠内质网应激对耳蜗毛细胞退行性变的影响

目的:探讨内质网应激(ERS)对1%链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠耳蜗毛细胞退行性变的影响,阐明其作用机制。方法:选取清洁级1月龄雄性昆明小鼠20只,随机分为对照组和模型组,模型组小鼠采用腹腔注射40mg·kg^(-1) STZ建立2型糖尿病模型。尾静脉采血测定小鼠空腹血糖,通过听觉脑干反应(ABR)检测小鼠的ABR阈值,耳声发射测试(OAE)实验检测OAE阈值,应用小鼠耳蜗铺片技术计算小鼠耳蜗外毛细胞的缺损率,采用Western blotting法检测小鼠耳蜗毛细胞中GRP78、caspase-12、p-ERK和Nrf2蛋白表达水平。结果:与对照组比较,第2次注射STZ后7和14d模型组小鼠空腹血糖差异无统计学意义(P>0.05),21、28和35d空腹血糖明显升高(P<0.05),35d达到最高值。与对照组比较,模型组小鼠在8、12和24kHz各个频率的ABR阈值明显升高(P<0.05)。与对照组比较,低频刺激下模型组小鼠OAE阈值无明显变化(P>0.05),在中频和高频刺激下模型组小鼠OAE阈值明显升高(P<0.05)。小鼠耳蜗外毛细胞缺损主要集中在底回端,耳蜗中回和顶回外毛细胞缺损较少;与对照组比较,模型组小鼠耳蜗中的底回外毛细胞缺损率明显升高(P<0.05),中回和顶回外毛细胞缺损率略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,模型组小鼠耳蜗毛细胞中GRP78和caspase-12蛋白表达水平升高(P<0.05),p-ERK和Nrf2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:ERS能够引起糖尿病小鼠耳蜗外毛细胞缺损率和ABR脑干听力阈值升高,并降低p-ERK和Nrf2的蛋白表达水平,提示ERS可促进2型糖尿病小鼠耳蜗毛细胞的退行性病变。

急性缺氧条件下EP、CM、CAP以及耳蜗毛细胞的形态学变化

本实验用同一根玻璃微电极在豚鼠耳蜗中阶记录ＥＰ（ＥｎｄｏｃｏｃｈｌｅａｒＰｏｔｅｎｔｉａｌ，耳蜗内电位）、ＣＭ（ＣｏｃｈｌｅａｒＭｉｃｒｏｐｈｏｎｉｃｓ，耳蜗振电压）、ＣＡＰ（ＣｏｍｎｏｕｎｄＡｃｔｉｏｎＰｏｔｅｎｔｉａｌ，复合动作电位），观察在不同缺氧状态下，三者动态变化过程．发现在缺氧初始（１—２分钟），ＣＭ和ＣＡＰ随ＥＰ同步迅速下降；但缺氧３—６分钟时，ＣＭ下降缓慢，似一“平台”，而ＣＡＰ和ＥＰ继续同步下降；缺氧７—１２分钟时，三者又倾于平行。扫描电镜观察：ＩＨＣ（内毛细胞）表面由底四到三圈出现广泛分泌物和球状物，ＯＨＣ汐（毛细胞）表面出现局限性分泌物和球状物，静纤毛融合。结果表明：ＯＨＣ和ＩＨＣ的功能状态与氧代谢密切相关，ＣＭ直接受ＯＨＣ和ＩＨＣ结构变化的影响。ＣＭ下降过程中的平台，则可能与盖膜（ＴＭ）的压电效应有关。ＣＡＰ的变化不完全依赖于ＣＭ。

爆震后豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量观察

目的 :观察爆震后耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的变化。 方法 :复制强脉冲噪声致聋豚鼠模型 ,以脑干听觉诱发电位测试仪测定听神经脑干反应 (ABR)阈值 ,通过耳蜗铺片计算机图像分析行毛细胞计数 ,耳蜗病理切片螺旋神经节细胞计数。结果 :正常对照组和噪声暴露后 2 1d的实验组耳蜗钩回、第 1和第 2回毛细胞总数分别为 3 5 99± 15 9.6个 ,6 0 2 2± 98.4个 ;二下螺旋神经节细胞计数分别为 (5 1± 4.72 )个 ,(2 7± 6 .94)个 ,以上均数各组间相差显著。结论 :爆震后不仅 ABR阈值升高 ,毛细胞数减少 。

补肾健脾胶囊延缓老年性耳蜗毛细胞凋亡的实验研究

目的:观察补肾健脾胶囊对C57小鼠老年性耳蜗毛细胞损害的保护作用并探讨其作用机制。方法:选择刚出生的C57 BL/6J小鼠30只,随机分为对照组10只,补肾健脾胶囊组20只,其中对照组小鼠为常规饲料喂养;中药组小鼠常规饲料至出生后1个月时开始饮用补肾健脾胶囊溶液以代替日常饮水。两组至7月龄时终止实验。取出小鼠耳蜗,制作成耳蜗铺片,在光学显微镜下观察并比较两组小鼠耳蜗毛细胞退行性改变状况。结果:对照组C57 BL/6J小鼠出现耳蜗毛细胞损伤加重的趋势,且这种随着年龄增长而发生的耳蜗损害遵循着从底回逐渐向顶回发展的规律,同时外毛细胞的损害比同区域的内毛细胞严重。服用复方补肾健脾胶囊的小鼠与同龄对照组小鼠相比,耳蜗毛细胞损害则相对较轻。结论:补肾健脾胶囊可以延缓C57 BL/6J小鼠随着年龄增长而发生的耳蜗毛细胞凋亡,提示该中药胶囊可能具有对抗老年性耳聋的药理效应,其作用机制可能与提高细胞环核苷酸含量,调节核酸代谢,保护和稳定DNA结构等有关。

甲状腺素对豚鼠耳蜗毛细胞的保护作用

应用耳蜗外淋巴灌流技术、微电极技术及扫描、透射电镜技术，观察先服甲状腺素（１０ｍｇ）三次后行外淋巴灌流卡那霉素（１０－３ｇ／ｍｌ）１小时的豚鼠实验组（Ｔ／Ｋ）蜗内电位（ＥＰ），耳蜗微音电位（ＣＭ）和毛细胞的亚微结构变化，并与单纯灌流卡那霉素（１０－３ｇ／ｍｌ）的豚鼠对照组（ＫＭ）进行比较，发现３组动物ＥＰ无明显差异；实验组（Ｔ／Ｋ）的ＣＭ下降较对照组（ＫＭ）少，两者有显著差异；实验组动物外毛细胞损伤较对照组动物轻，提示甲状腺素可能直接作用于听毛细胞，减轻卡那霉素对内耳的毒副作用。

硫酸新霉素对新生大鼠离体培养耳蜗毛细胞的毒性作用研究

目的观察体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器经不同浓度硫酸新霉素处理后,各回毛细胞损伤情况。方法取新生大鼠完整耳蜗基底膜,体外培养12小时,存活贴壁后加药处理。对照组10个样本;3个实验组各10个样本,分别用终浓度为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L硫酸新霉素处理24小时。进行MyosinⅦa免疫荧光组织化学染色,在共聚焦显微镜下观察各回毛细胞缺失情况。分别选取10个图片进行毛细胞计数(每张图片截取100μm计数毛细胞个数),并利用CHISS软件进行统计分析。对照组除不加入硫酸新霉素外,其他培养条件均与实验组相同。结果硫酸新霉素对离体培养的新生大鼠耳蜗毛细胞具有损伤效应,且外毛细胞对硫酸新霉素的毒性作用比内毛细胞敏感。加入硫酸新霉素后,耳蜗毛细胞损失从底回外毛细胞开始,随着药物浓度增加,逐渐累及到中回,最后顶回受累,且损失程度随着浓度的递增而加重,以外毛细胞为甚。单纯体外培养的耳蜗毛细胞没有缺失。经完全随机设计方差分析可得:顶回正常组内毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、2mmol/L组无统计学差异,与新霉素4mmol/L组有统计学差异;中、底回正常组内毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、新霉素2mmol/L组、新霉素4mmol/L组均有统计学差异;顶回正常组外毛细胞数量与新霉素2mmol/L与4mmol/L组有统计学差异;中、底回正常组外毛细胞数量与新霉素1mmol/L组、新霉素2mmol/L组、新霉素4mmol/L组均有统计学差异。结论新生大鼠体外培养的耳蜗毛细胞随着硫酸新霉素药物浓度的增加损失越严重,且从底回向顶回发展,此与活体动物实验的损害规律基本相同,因此可作为耳毒性药物损伤后毛细胞再生研究的体外模型。

肾气丸对庆大霉素致聋豚鼠耳蜗毛细胞钙通道蛋白CaV1.3的影响

【目的】观察金匮肾气丸对庆大霉素(gentamycin,GM)中毒性耳聋豚鼠耳蜗毛细胞钙离子通道蛋白Ca V1.3表达的影响。【方法】将40只健康级白色红目豚鼠随机分为正常组,模型组,金匮肾气丸高、中、低剂量组,模型组豚鼠每日肌肉注射庆大霉素120 mg/kg连续10 d,金匮肾气丸高、中、低剂量组豚鼠分别每日肌肉注射庆大霉素120 mg/kg,同时给予剂量为20.3、13.5、6.08 g·kg-1·d-1的金匮肾气丸水煎剂灌胃给药连续10 d。采用免疫组织化学法检测各组耳蜗毛细胞Ca V1.3阳性表达平均光密度值。【结果】各组豚鼠毛细胞Ca V1.3钙离子通道蛋白平均光密度值比较,模型组较正常组显著降低(P<0.01),中药高剂量组较模型组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】金匮肾气丸对GM所致的豚鼠耳中毒具有一定的防治作用,可保护听功能。

豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛连接桥的超微结构观察

目的观察豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛连接桥的超微结构和功能。方法借助单宁酸样品处理技术,用扫描电镜观察了豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛的超微结构。结果豚鼠耳蜗外毛细胞的静纤毛之间存在着侧面连接桥,这些连接桥呈水平走向,将每一个毛细胞上的同一排和不同排的静纤毛连接起来。第1圈到第4圈外毛细胞静纤毛上均可观察到侧面连接桥。排列整齐,结构完整的静纤毛之间的连接桥就比较多。静纤毛排列紊乱时,这些连接桥就比较少。第1圈和第4圈毛细胞静纤毛的侧面连接桥多一些,而第2圈和第3圈毛细胞静纤毛的连接桥就少一些。静纤毛表面的小泡状结构多时,静纤毛之间的连接桥也就多一些,静纤毛表面的小泡状结构少时,静纤毛之间的连接桥也就少一些。结论耳蜗毛细胞静纤毛的侧面连接桥是一个独立的形态学结构,它在维持耳蜗毛细胞静纤毛束的结构和功能的完整性方面起重要作用。

豚鼠耳蜗毛细胞丝状肌动蛋白表达

目的研究正常生理状态下丝状肌动蛋白(F-actin)的结构特征和分布规律。方法应用免疫细胞化学方法,采用单克隆抗体及免疫荧光标记技术,借助荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜,逐层观察耳蜗毛细胞骨架蛋白-丝状肌动蛋白的分布特点。结果在连续的光学切片上,可以看到静纤毛、表皮板和外毛细胞(outerhaircells,OHCs)的周围环都有明亮的鬼笔环肽染色。除基底转外,其余各转皮板下网络(infracuticularnetwork,ICN)均有鬼笔环肽显色,外毛细胞侧壁着色亮度自基底转到顶转逐渐减弱。内、外柱细胞和Deiters细胞染色明亮,其中耳蜗各转外柱细胞头板的显色亮度都强于OHCs。结论豚鼠耳蜗OHCs中F-actin的结构和分布存在差异,内毛细胞(innerhaircells,IHCs)的结构和分布无差异,表明局部结构的梯度决定局部功能的差异。

miR-92a对耳蜗毛细胞株HEI-OC1放射性损伤的影响

目的探索miR-92a介导的耳蜗毛细胞放射性损伤机制。方法运用缩小RNA(miRNA)芯片技术检测耳蜗毛细胞株HEI-OC1放射前后miRNA的表达谱差异,qRT-PCR验证miR-92a在细胞照射后表达变化情况,对细胞转染阴性对照物、miR-92a模拟物及抑制物后,用MTT法检测耳蜗毛细胞放射后增殖能力的变化。结果芯片及qRT-PCR验证结果显示耳蜗毛细胞照射后miR-92a表达量明显升高(P<0.05);与阴性对照相比,转染了miR-92a模拟物的细胞在照射(2、4、8、16 Gy)后细胞活性明显下降(P<0.05),转染了miR-92a抑制物的细胞在照射(8、16 Gy)后细胞活性明显上升(P<0.05)。结论 miR-92a的过度表达加重了毛细胞的放射损伤,miR-92a可能是耳蜗毛细胞放射性损伤重要的调节因子。

孕期和哺乳期铁缺乏对新生豚鼠耳蜗毛细胞的影响

为观察孕期和哺乳期铁缺乏对新生豚鼠听功能及耳蜗毛细胞形态结构的影响,将18只怀孕豚鼠按体质量随机分为3组,每组6只,分别是重度铁缺乏组、中度铁缺乏组和对照组;在仔鼠出生后第9天断乳,乙醚麻醉,畸变产物耳声发射(DPOAE)检测听力状况;分离耳蜗,行全基底膜铺片,用TRITC标记的鬼笔环肽染色,观察耳蜗毛细胞。结果表明,孕期和哺乳期铁缺乏致子代豚鼠DPOAE幅值降低和耳蜗毛细胞缺失明显(P<0.05)。提示孕期和哺乳期铁缺乏可能损伤子代豚鼠耳蜗毛细胞发育并造成听力障碍。

耳蜗毛细胞凋亡早期的检测方法

目的:介绍一种耳蜗毛细胞凋亡早期的检测方法。方法:将豚鼠暴露于155dBSPL的脉冲噪声75次,于噪声暴露后5min解剖取耳蜗。采用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-labeledphalloidin)进行毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白的染色,DNA荧光染料碘化丙锭(propidiumlodide, PI)进行细胞核染色,标记鉴别毛细胞死亡方式。原位末端标记法(TUNEL)进一步确认凋亡的毛细胞,荧光显微镜下观察凋亡的毛细胞形态学变化。结果:异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽和PI双重染色发现毛细胞核发生轻微固缩时,其表皮板结构完好。TUNEL阳性标记物存在于固缩的细胞核内。结论:应用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽和PI双重染色法能够发现凋亡早期的毛细胞。

三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的比较

目的评估三种检测耳蜗毛细胞死亡模式方法的优缺点。方法以噪声暴露诱导灰鼠耳蜗毛细胞死亡,采用DNA荧光染料碘化丙锭(Propidiumiodide,PI)染色法,原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3染色法标记毛细胞死亡模式,对比三种检测方法。结果PI染色法可将正常、凋亡、坏死和缺失的毛细胞区分开来,TUNEL法能初步鉴别毛细胞死亡模式,Caspase-3标记可定性凋亡和坏死的毛细胞。结论PI染色法快速、简便、可靠、经济,可用于定量检测凋亡和坏死的毛细胞。

CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠全耳蜗毛细胞随着年龄增长不同损害模式的比较

目的探讨和比较CBA/CaJ与C57BL/6J小鼠全耳蜗毛细胞随着年龄增长不同损害模式与规律。方法选择年龄在6个月、12个月、18个月和24个月的CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠各32只,其中每个年龄各8只,全身麻醉下取耳蜗,进行全耳蜗基底膜铺片,将全耳蜗内、外毛细胞计数结果输入计算机并应用耳蜗图软件,按照对应的不同年龄进行两个鼠种耳蜗毛细胞密度对比和统计学分析。结果CBA/CaJ小鼠于12月龄耳蜗顶部外毛细胞开始出现轻度损失,伴随着年龄增加,外毛细胞损失继续扩大,以顶部向中部发展为主,后期内毛细胞也出现损失。从18月龄开始,耳蜗外毛细胞损失与上个年龄组比较均增加显著(P<0.05)。而C57BL/6J小鼠于6月龄耳蜗底部均已出现外、内毛细胞损失,而且以外毛细胞损失为主,此后伴随着年龄增加,毛细胞损失不断扩大,于6月龄开始,耳蜗外、内毛细胞损失与同龄CBA/CaJ小鼠比较均明显增加(P<0.05),12月龄开始与同鼠种上个年龄组比较均明显增加(P<0.05)。结论CBA/CaJ小鼠耳蜗毛细胞损害遵循着从顶部和底部两端开始,向中部延伸,但顶部毛细胞损害比底部严重的病变规律。C57BL/6J小鼠耳蜗毛细胞损害遵循着主要从耳蜗底部开始,逐渐向中部和顶部扩展的病变规律。外毛细胞损害比内毛细胞早。C57BL/6J小鼠毛细胞损害比CBA/CaJ小鼠早。提示两个鼠种均可作为老年性毛细胞凋亡研究动物模型,但以C57BL/6J小鼠模型更适合短期观察研究,两者间所出现的毛细胞变化差别可能与Cdh23基因是否变异和缺失有关。

EGCG对电离辐射所致豚鼠听功能和耳蜗毛细胞损伤的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对电离辐射所致豚鼠听功能和耳蜗毛细胞损伤的保护作用.方法 24只豚鼠,按照随机数字表法分为对照组、EGCG+辐射组及辐射组,每组8只.EGCG+辐射组及辐射组于造模前3 d开始腹腔注射EGCG(25 mg/1000 g)及等量的生理盐水,2次/d;对照组不做任何处理.在照射前第4天及照射后第8天检测所有豚鼠的听觉脑干诱发电位(ABR)阈值,照射8 d后于显微镜下计数毛细胞数量.比较三组的ABR阈值检测结果、耳蜗铺片及细胞计数.结果干预后8 d,EGCG+辐射组ABR阈值(38.1±3.3)dB低于辐射组的(49.4±8.6)dB,差异具有统计学意义(P<0.05);干预后8 d,EGCG+辐射组和辐射组的ABR阈值与干预前4 d的(19.3±5.5)、(21.0±3.7)dB对比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05).辐射组实验动物的耳蜗毛细胞数量降低,形态改变,排列杂乱不齐,造模成功;EGCG+辐射组显微镜镜检表明耳蜗毛细胞数与对照组相比有所降低,排列较为杂乱,但与辐射组相比形态结构较好.对照组耳蜗毛细胞计数为(1102.23±80.55)个,EGCG+辐射组耳蜗毛细胞计数为(758.56±143.27)个,辐射组耳蜗毛细胞计数为(527.00±165.23)个,EGCG+辐射组、辐射组耳蜗毛细胞计数均低于对照组,辐射组耳蜗毛细胞计数低于EGCG+辐射组,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论对豚鼠预防性注射EGCG能够有效降低电离辐射对听功能和耳蜗毛细胞损伤作用,对电离辐射所致的听力损伤具有一定的防护作用.