扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究

目的应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法。方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA。根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析。结果采用改良5′RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因。结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因。应用改良5′RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。

蝎毒对人肝癌Bel-7404细胞端粒酶活性的影响

目的 :观察蝎毒 (BMK)对人肝癌Bel 740 4细胞端粒酶活性的影响。方法 :不同浓度的BMK处理体外培养的人肝癌Bel 740 4细胞 72h ,聚合酶链反应 端粒重复扩增 (PCR TRAP)法测定端粒酶活性 ,四甲基偶氮唑盐比色 (MTT)法测定细胞增殖抑制。结果 :BMK可抑制Bel 740 4细胞端粒酶活性 ,随BMK浓度增大 ,端粒酶活性抑制增强。MTT结果显示BMK抑制Bel 740 4细胞增殖且抑制有浓度依赖性。结论 :端粒酶活性的抑制可能是BMK发挥抗癌活性的作用机制之一 。

采用随机聚合酶链反应方法对临床样本中未知核糖核酸病毒检测的研究

目的探索一种不依赖于病毒培养,直接对临床样本中未知核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)病毒作出鉴定的分子生物学方法。方法对经前处理后的临床样本提取病毒RNA,进行随机聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增,通过对扩增产物的纯化、克隆、测序以及序列的在线比对,根据同源性确定核酸片段的来源,并最终实现对未知病毒的鉴定。对临床样本的前处理以及前处理方法的优化,即通过冻融、离心、过滤、聚乙二醇浓缩,以及核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的处理,尽可能地去除样本中的无关核酸,以增大病毒核酸在样本中所占比例,提高阳性检出率。结果通过对样本前处理方法的改进,从病毒载量为4.8×103Copy/ml(拷贝/毫升)的含漱液样本中,以70%的阳性克隆率检测出未知RNA病毒。结论所建立的方法能提高对RNA病毒鉴定的阳性率,这将在不明原因传染病病原体的鉴别诊断中,发挥重要的作用。

山乌桕叶片DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

为研究南方优良乡土彩叶树种山乌桕的遗传多样性,并为山乌桕种质培育研究提供技术参考。以山乌桕叶片为试验材料,对山乌桕ISSR-PCR反应体系进行优化,比较试剂盒法、改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基硫酸钠(SDS)法对山乌桕叶片DNA的提取效果,并利用单因素试验和L 25(53)正交试验对DNA模板用量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、退火温度和循环次数进行优化。结果表明,试剂盒法和改良CTAB法均可获得较高浓度和质量的DNA,都是提取山乌桕叶片DNA的良好方法;山乌桕叶片ISSR-PCR反应体系中,DNA模板用量对扩增效果影响最大,2×Taq Master Mix添加量的影响最小;山乌桕叶片ISSR-PCR的最优反应体系为:总体积20μL,其中含20 ng DNA模板1.5μL、2×Taq Master Mix 8.0μL、引物浓度0.8μmol·L^(-1)。山乌桕叶片ISSR-PCR的反应程序为:94℃预变性5 min、94℃变性30 s、51.9℃退火45 s、72℃延伸90 s、40个循环,72℃延伸10 min、4℃保存。

ApoE基因多态性与冠心病患者抑郁情绪的关系

目的:了解ApoE基因多态性与冠心病患者抑郁情绪的关系。方法: 用聚合酶链反应扩增技术和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对26例冠心病伴抑郁者、30例冠心病不伴抑郁者和30例健康对照组的载脂蛋白E基因(ApoE)进行分析,用汉密尔顿抑郁量表(HRSD)评定抑郁。结果: 冠心病伴抑郁组的ApoEε4等位基因频率显著高于对照组(P<0.05),而其它等位基因频率在各组中的差异无统计学显著性(P>0.05)。携带ε4等位基因者HRSD(因子分中的运动迟缓、绝望感分)、HAD(包括D因子分和A因子分)总分以及总胆固醇水平均高于非携带ε4等位基因的患者,但在认知损害、体重、睡眠障碍因子得分上的差异没有统计学显著性。结论: ApoE基因多态性与冠心病抑郁情绪有一定的关联,尤其是ApoEε4等位基因在冠心病患者抑郁情绪的发生中可能起重要作用。

DNA芯片在乙型肝炎病毒基因突变分析中的应用

目的:探讨DNA芯片在乙型肝炎病毒基因突变分析中的应用及临床意义。方法:应用聚合酶链反应扩增乙型肝炎患者血清中HBVDNA,采用膜显色DNA芯片法检测HBVDNA前C区1896位,基本核心启动子区(BCP区)1762、1764位,P区528、552位突变。结果:未接受抗病毒药物拉米夫定治疗的6例HBsAg+、HBeAg+、HBeAb-的患者血清中未检测到病毒变异,13例HBsAg+、HBeAg-、HBeAb+的患者中检测到前C区1896位变异9例,BCP区1762、1764位变异11例,13例HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+的患者中检测到前C区1896位变异4例,BCP区1762、1764位变异13例,未检测到P区基因变异;15例接受拉米夫定治疗48周后的HBVDNA阳性患者中,检测到前C区1896位变异5例,BCP区1762、1764位变异6例,P区528位变异2例,P区552位YVDD变异4例,YIDD变异7例。结论:前C区1896位、BCP区1762、1764位突变较多的出现在HBeAb+的患者中并与HBeAg的阴性表型相关,BCP区1762、1764位突变与HBeAg/HBeAb血清转换密切相关,而P区528、552位突变更多的出现在接受拉米夫定治疗后的患者中,与拉米夫定耐药相关;膜显色DNA芯片法用于乙型肝炎病毒基因突变分析,简便、快速、特异性好,适合临床推广应用。

黑麂粪便DNA的简易提取方法

收集九龙山自然保护区野外自然条件下的黑麂粪便样品,用无水乙醇保存于-70℃冰箱,经十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解液温浴粪便、酚/氯仿抽提及聚合酶链反应(PCR)纯化试剂盒纯化等步骤提取黑麂粪便DNA,并扩增线粒体DNA细胞色素b基因和2个微卫星位点进行检测;同时提取黑麂肌肉和皮毛样品的DNA作为对照.结果显示,该方法可以从粪便中提取到高质量的黑麂DNA,并可进行有效扩增,为黑麂及其他濒危鹿科动物的非损伤取样提供了一种简易方法.

神经型烟碱性胆碱能受体α4亚单位基因多态位点1860(C→T)与吸烟的相关性 以流行病学和病例调查为基础的抽样调查

目的:分析神经型烟碱性胆碱能受体α4亚单位基因CHRNA4多态1860(C→T)与吸烟的相关性。方法:抽取2000年北京地区流行病学调查年龄>50岁的男性健康老年人227名,2000/2002于北京宣武医院就诊的男性原发性帕金森病患者123例,共350例,在被调查者均知情同意的条件下详细调查其吸烟史包括年吸吸烟量、吸烟起时间和吸烟时间。提取所有参与者白细胞的基因组DNA,用聚合酶链反应扩增CHRNA4基因含1860(C→T)多态位点的片段,用变性高效液相色谱检测1860位基因型,测序证实变异碱基。统计分析帕金森病组与健康老年人组的1860位等位基因频率的Hardy-Weinberg吻合度检验,用SPSS9.0分析1860位变异与吸烟的相关性。结果:按意向处理分析,350例均进入结果分析。①健康人和帕金森病患者比较:227名男性健康老年人,68.3%吸烟;123例男性帕金森病患者中,35.0%吸烟,两组差异显著(P<0.001),帕金森病组与健康老年人组1860位基因型与等位基因Hardy-Weinberg检验无差异,因此将两组合并,分为吸烟与不吸烟组,总计56.9%男性吸烟。②吸烟者和不吸烟者比较:吸烟者CHRNA41860位等位基因T的频率高于不吸烟者(33.3%,23.3%,P=0.003),当前吸烟者1860T基因频率增高更为明显(35.0%,P=0.003);1860位等位T基因对年吸烟≥300包者的危险度高于年吸烟量<300包者,对吸烟持续时间≥30年者危险度高、对开始吸烟年龄<20岁者的危险度高20岁以后开始吸烟者。结论:男性中国人CHRNA4基因1860(C→T)多态与吸烟行为相关,1860等位基因T是吸烟的易感基因,并与吸烟量,吸烟持续时间和开始吸烟年龄相关;T等位基因对当前吸烟的危险度更高。

-Am表型家族发生664G>A突变形成一新的A等位基因

背景 Am表型表现为红细胞上A抗原弱表达，但唾液中A抗原数正常。本文报道-Am家族成员的分子遗传学分析。研究设计与方法以聚合酶链反应扩增和克隆Am男性先证者的ABO基因第八外显子区域，而后作序列分析。对于Am血清中a-1，3-N-乙酰基氨基半乳糖基转移酶(A-转移酶)活性以及表达的Am转移酶进行了分析。

PCR-SSP对潜在输血需要住院患者ABO基因分型的检测效果与意义

【目的】调查潜在输血需要住院患者的ABO血型基因,分析ABO表型相同输血中ABO基因型的错配输血几率。【方法】对502例潜在输血需要的住院患者,采用血清学方法和聚合酶链反应-序列特异性扩增技术(PCR-SSP)检测ABO血型的表型及基因型。比较两种方法学对ABO血型表型的一致率;统计各ABO等位基因及各ABO基因型的频率;并分析潜在输血需要的住院患者在接受ABO血型表型相同的输血时,ABO基因错配输血几率。【结果】血清学与PCR-SSP对502例潜在输血需要的住院患者的ABO表型识别的一致率为100%。PCR-SSP技术检测出患者中常见ABO基因5个(O1、O2、A1、B1及A2)以及ABO基因型16个(O1O2、O1O1、B1O1、A1O1、A1O2、B1O2、O2O2、A1B1、A1A1、B1B1、A2O1、A2O2、A2B1和A1A2),而血清学仅能识别ABO表型。潜在输血需要住院的患者在接受ABO血型表型相同的随机输血中,与供者之间ABO基因型的错配率分别为:A型65.98%,B型57.39%,O型56.95%,AB型22.55%。【结论】PCR-SSP能识别ABO基因型,不仅可以作为血清学的有力补充,而且可能揭示输血治疗中不明原因的输血不良反应的临床原因,具有重要临床意义。

桉树焦枯病菌内参基因的筛选

为筛选出桉树焦枯病菌在盐胁迫及侵染桉树叶片两种条件下表达稳定的内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式扩增反应(RT-q PCR)技术分析了桉树焦枯病菌中7个常用内参基因(GAPDH、α-tubulin-1、α-tubulin-2、18S rRNA、ubiquitin、β-actin、β-tubulin)的mRNA差异表达情况,并采用ge Norm软件分析了它们在两种条件下的表达稳定性。结果表明,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下表达最稳定的基因,且不需要引入第3个基因;18S rRNA和α-tubulin-1为侵染桉树叶片下表达最稳定的基因,但需引入第3个基因GAPDH。因此,ubiquitin和α-tubulin-2为桉树焦枯病菌在NaCl胁迫下较适合的内参基因,而18S rRNA、α-tubulin-1和GAPDH为侵染桉树叶片较适合的内参基因。

c-myc基因在慢性粒细胞白血病患者中表达的意义

目的探讨c-Myc基因与慢性粒细胞白血病之间的关系。方法应用逆转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)技术检测30例CML(其中慢性期11例,加速期8例,急变期11例)和10例对照(正常骨髓6例和非恶性血液病4例)骨髓单个核细胞中c-myc基因的表达,分析c-myc基因与CML患者不同临床阶段之间的关系。结果 c-myc基因在CML不同临床分期的表达水平均有所升高,CML慢性期患者和对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05),CML加速期和急变期患者c-myc基因表达水平均明显高于慢性期和对照组(P<0.05),CML急变期患者较加速期患者c-myc基因表达水平更高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 c-Myc基因在CML加速期和急变期的表达明显升高,提示c-myc基因高表达可能是CML病情进展与急变的机制之一。c-myc基因表达水平在CML患者病程监测中具有重要意义,甚至可能作为c-myc基因抑制剂应用于CML的依据。

中国汉族人及维吾尔族人Rh血型基因结构多态性研究与分析

目的 研究中国汉族及维吾尔族家系的RHD基因结构。方法 采用聚合酶链反应 -序列特异性引物扩增 (PCR -SSP)方法 ,对汉族和维族Rh阴性家系的D基因结构多态性进行研究。结果 中国人RHD基因结构具有多态性 ,特别是带有C的个体 ;82例RHD血清学阴性个体中 ,完整携带十个外显子的有 14个样本 ,部分携带的有 6个样本 ,8个样本为完全缺失。结论 中国汉族人群与高加索人种有着显著的不同 。

徐州汉族人ABO血型及HAB分泌型基因分型研究

目的 研究徐州汉族人群ABO血型及HAB分泌型基因多态性分布特征并用于解决临床输血中血型血清学鉴定难题。方法 用快速盐析法提取外周血标本中的DNA ,用PCR SSP扩增ABO血型、HAB分泌型等位基因。结果 1 0 4名健康、无血源关系的徐州汉族人ABO血型基因频率分别为A1:0 .1 53 8,A2 :0 .0 962 ,B :0 .2 4 52 ,O1:0 .50 4 8,O2 :未检测到 ( χ2 =6.73 2 3 ,P >0 .2 5,符合Hardy Weinberg公式 ) ;HAB分泌型基因频率分别为分泌基因Se:0 .980 8,非分泌基因se:0 .0 1 92 ( χ2 =0 .0 4 2 1 ,P >0 .75,符合Hardy Weinberg公式 )。 1份用血清学方法不能确定ABO血型的标本 ,用基因分型定为BO1型。结论 PCR SSP是一种方便、可靠的血型基因定型技术 ,与血型血清学方法相比本文非分泌基因se的频率显著偏低 ,4例血清学定为非分泌型个体用该方法鉴定基因型为Se/Se,间接提示G4 4 7A和G757A突变不能完全覆盖我国汉族人群的非分泌基因se。

类孟买型ABO基因的检测

为研究类孟买型ABO基因的分子基础 ,在吸收放散试验、唾液血型物质凝集抑制等血清学试验基础上 ,用PCR SSP法对 5例类孟买型样本进行ABO血型的基因定型 ,并进行ABO基因第 6、第 7外显子测序。结果表明 ,本研究的 5例类孟买血型样本 ,经PCR SSP法基因定型 ,其ABO基因型分别为A10 2B1、A10 2B1、A10 2O1、A10 2B1、B1O1;经直接测序实验 ,该 5例样本的ABO基因测序结果与PCR SSP基因定型结果相一致 ,未检测出新的点突变。结论 :应用PCR SSP方法可对类孟买型个体进行常规ABO基因定型 ,具有简便、快速、可靠的特点。

ARMS法在检测肺癌晚期患者肿瘤组织和血浆表皮生长因子受体基因突变中的应用

目的 应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ARMS-PCR）检测晚期肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变,探索两者间的一致性。方法 同时收集53例未经治疗的肺癌Ⅲb～Ⅳ期患者的原发灶肿瘤组织和外周血,分别提取DNA,采用ARMS-PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和21外显子突变,对结果不一致的标本用微滴式数字PCR法对外周血标本进行验证。结果 血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为51.4%（17/33）,特异度为100%;血浆EGFR基因的突变率为29.4%;16例血浆和组织结果不一致的标本,数字PCR检测的结果与血浆游离DNA检测的结果一致。结论 血浆游离DNA为监测Ⅲb～Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源,ARMS法是检测血浆游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。

TaqMan探针结合COLD-PCR原理定量检测JAK2 V617F突变率研究

目的建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的方法。方法应用TaqMan/MGB探针技术,结合较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(COLD-PCR)基因扩增原理,采用Real-Time PCR分析系统,通过JAK2V617F突变率和其循环阈值(Ct值)的标准曲线,建立TaqMan-COLD-PCR测定方法,并对9例骨髓增殖性疾病(MPD)患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测,探讨其应用价值。结果建立的TaqMan-COLD-PCR方法检测JAK2V617F突变率的检测下限为0.1%,100%-0.1%的JAK2V617F突变率与其测定的Ct值间呈明显的线性关系。对9例MPD患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中6例患者的JAK2V617F突变阳性,突变率范围为18.5%-50.9%,经测序确认全部符合。结论 TaqMan-COLD-PCR方法可高灵敏度、定量检测外周血中JAK2V617F突变率。该方法将明显提高MPD疾病的诊断灵敏度,并有助于疾病治疗过程中治疗效果的监测。

907例非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变特点及与临床特征的关系。方法收集907例NSCLC肿瘤组织,分别提取DNA,采用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)扩增EGFR基因29种突变。结果 907例NSCLC中,359例(39.6%)EGFR基因有突变,其中18、19、20、21外显子单独突变分别为6例(0.7%)、152例(16.8%)、8例(0.9%)、170例(18.7%),共见突变类型7种;热点突变类型为19外显子缺失(构成比42.3%)和21外显子L858R突变(构成比45.1%)。女性患者突变率高于男性患者(56.9%vs 25.7%,P<0.05),腺癌患者突变率高于鳞癌患者(49.0%vs 10.0%,P<0.05),未发现EGFR基因突变率与标本来源、年龄和肿瘤细胞比例相关。结论 NSCLC患者EGFR基因突变以19、21外显子突变为主,突变率以腺癌患者和女性较高。