SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。

M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测肺炎克雷伯菌

一直以来,人类健康都在承受着病原微生不同程度的威胁,其中肺炎克雷伯菌是常见的条件致病菌之一,当机体免疫力低下时,容易发生炎性病变,从而引起肺炎、尿路感染和败血症等院内感染。综合分析肺炎克雷伯菌的致病特征,认为快速、准确地从患者血液中检出病原菌,对感染患者进行及时的治疗具有重要意义。方法 传统病原微生物的检测有培养法、免疫检测或者生化鉴定等方法,随着分子生物学技术不断发展,使病原微生物的快速和灵敏检测成为了可能,结合我们新型的聚合酶链式反应技术,产生新的实验方法,探讨分析M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测的可行性以及临床样本中病原菌核酸的最优提取方法。结果 在已经建立的PCR方法中的引物作为内引物的基础上,根据RAA的引物设计原则设计RAA反应过程的外引物,筛选出最优引物对,建立RAP的方法和检测技术,预期核酸扩增特异性达到100%,检测下限达到10CFU/mL。结论 分析肺炎克雷伯菌的病原学特征、基因的特点,建立了这套灵敏度高、特异性强、反应迅速可靠的M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术,使得检测血液样本中的肺炎克雷伯菌更具特异性,有助于发现早期细菌感染患者并给予其及时的治疗,为今后肺炎克雷伯菌的准确诊断提供了新的选择。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测中的研究进展

数字聚合酶链式反应(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)技术是一种新兴的核酸绝对定量分析技术,无须标准品和绘制标准曲线,通过极限稀释样品和泊松概率分布原理就可以精准检测样本初始的DNA拷贝数,具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特性,在食品安全核酸检测领域具有较好的发展潜力。本文介绍了dPCR技术的基本原理和特点,分析了dPCR技术在食品安全核酸检测领域的研究现状,并对其在食品安全中的应用前景进行展望,以期为促进dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用提供一定参考。

细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用分析

探究细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用价值。方法 选取我院就诊的800例腹泻患者作为检验样本(2021.11~2023.11期间),使用细菌培养方法,聚合酶链反应(PCR)检测方法,探讨不同年龄段患者的细菌性痢疾检出率。结果 聚合酶链反应(PCR)检测检出率:(75.00%),(33.33%),(50.00%),(41.67%),(40.00%),(27.14%),(33.33%),(60.00%),(50.00%),(55.25%)优于细菌培养阳性检出率:(2.78%),(2.22%),(3.33%),(5.00%),(2.00%),(4.29%),(3.33%),(6.67%),(5.00%),(3.25%),(p值小于0.05)。结论 细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中,聚合酶链反应(PCR)检测方法,应用价值更为理想,可准确的评估患者是否存在细菌性痢疾疾病,有助于临床医师结合检测数据,为患者后期治疗提供理论借鉴依据,进一步改善患者的治疗效果,有临床推广及借鉴意义。

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10^(1)CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。

聚合酶链式反应(PCR)用于检测环境水体指示菌的研究

对聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ） 快速检测水体指示菌———大肠菌群（ｔｏｔａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ） 和大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） 进行了研究．采用的两对引物分别扩增了ＬａｃＺ基因的约２６０ｂｐ 和ＵｄｉＡ 基因的约１５０ｂｐ ＤＮＡ 片段．引物Ⅰ和引物Ⅱ最低能分别扩增１０ － ６μｇ 或１０ －８ μｇ 基因组ＤＮＡ．整个检测工作在采集水样后５ —６ｈ 内完成．与常规水质检测法相比，ＰＣＲ 法具有快速，准确的特点。

聚合酶链式反应(PCR)荧光检测研究

本文研究了荧光能量传递技术 (fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET) ,建立了一套基于该理论在聚合酶链式反应 (PCR)中用于荧光检测和溯源性研究的实验装置 。

应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒

为建立并优化锦鲤疱疹病毒检测方法,针对目前国内集约化养殖鲤鱼大面积流行的病死现象进行有针对性的检测,对在疫区采集到的病鱼肾脏、肝胰脏、肠等组织,提取基因组DNA,应用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行PCR反应,同时设立阴性对照(TE buffer)。通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定,与阴性对照比较,在484bp处出现特异性目的条带。经序列测定,所得PCR产物的基因序列与NCBI上锦鲤疱疹病毒的同源率达到99%以上。对同一批次的样品进行重复检测,结果表明该方法具有较好的可重复性,可据此判定结果。通过对锦鲤疱疹病毒的检测,确定了疫区引起框镜鲤(Cyprinus carpio)和建鲤(Cyprinus carpio var Jian)大批死亡的病原为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV),从而对疫区控制、防治方案的制定提供了理论依据。建议尽快在鲤鱼主要养殖区开展KHV流行病学、诊断与检测及免疫预防等方面的研究。

聚合酶链式反应（PCR）在植物病害诊断检测上的应用

聚合酶链式反应（ＰＣＲ）用于体外扩增ＤＮＡ具灵敏、特异、快速、简便等诸多优点，已经在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等领域得到广泛应用，且在这些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。在植物病理学领域，ＰＣＲ主要应用于植物病害的诊断检测，特别是对植物病毒及类似病毒病害的检测，其灵敏度可达ｐｇ／ｆｇ水平。此外，还用于植物病原真菌、细菌、线虫的分类鉴定以及植物病毒、类病毒核酸的克隆、测序等研究。同时讨论了ＰＣＲ技术目前的限制和将来的应用潜力。

肺炎支原体快速聚合酶链式反应（PCR）法检测

本文根据Ｂｅｒｎｅｉ设计的肺炎支原体ＰＣＲ引物，采用国产的耐热ＤＮＡ聚合酶，建立了双温循环肺炎支原体ＰＣＲ快速检测法。４０例儿童肺炎咽拭子标本中，８例呈阳性结果。

实时荧光聚合酶链式反应检验用于乙型肝炎病毒DNA检测的价值分析

目的:探讨实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检验用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测中的价值。方法:选取2020年1月—2023年1月清镇市第一人民医院收治的乙型肝炎患者112例为研究对象,均经标准abbot药盒检测确诊,包括HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAg(+)(临床习惯称为“大三阳”)62例、HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAb(+)(临床习惯称为“小三阳”)50例。患者均接受酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验HBV-DNA。将标准abbot药盒检测结果作为金标准,评价酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验的诊断效能。结果:临床最终诊断结果显示“大三阳”62例(阳性)、“小三阳”50例(阴性),酶联免疫吸附法检出阳性50例、阴性62例,实时荧光PCR检验检出阳性58例、阴性54例;实时荧光PCR检验诊断准确度、特异度、灵敏度高于酶联免疫吸附法检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与酶联免疫吸附法检验比较,HBV-DNA检测中采取实时荧光PCR检验,可提高对“大三阳”与“小三阳”的诊断效能。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型临床症状的病犬肠溶物经 SDS-酚裂解法提取总 DNA,并以此 DNA为模板 ,通过人工合成的两条 2 0 mer引物进行 PCR扩增 ,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白 VP2 基因中间 1 /3区段 ,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 .试验结果表明 :用 PCR扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性 ,应用该方法检测的 2 7份病犬肠溶物样品均获得了预计长度的 DNA片段 ( 53 1 bp) ,而健康犬的肠溶物样品 PCR结果为阴性 .该方法的检测灵敏度很高 ,最高可将提取的总 DNA样品稀释 1 0 6倍 ,即可以检测到 1 .3 7pg总 DNA样品中所含的病毒 DNA.由于该方法直接利用病犬肠溶物提取总 DNA,检测方法快速、简便 ,结果可靠 ,可在 2 4 h内获得满意结果 。

聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法:以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ(COⅢ)基因序列为靶位点设计引物,进行聚合酶链式反应扩增,建立鸭源性成分检测方法;以常见畜禽肉,包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测;以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液,对鸭肉DNA进行梯度稀释,检测灵敏度。结果:该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高(0.1μg/kg),且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响,可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。

聚合酶链式反应技术检测化妆品中的铜绿假单胞菌

利用聚合酶链式反应(PCR)技术建立了一种快速检测化妆品中铜绿假单胞菌的方法。根据已报道的铜绿假单胞菌特异性基因ETA设计引物,确定引物的特异性和灵敏度;对染菌化妆品样品进行增菌检测。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果显示,仅在含有铜绿假单胞菌基因组的样品中得到条带;对染菌样品的扩增结果显示,可以在原样品的活菌浓度为6 cfu.mL-1时通过增菌12 h后检出。

实时荧光聚合酶链式反应检测食品中香蕉成分

根据香蕉叶绿体rbcL基因序列,选择高度保守区域设计特异性引物和探针,建立食品中香蕉成分检测的实时荧光聚合酶链式反应检测方法。结果显示,该组引物探针对香蕉有很强的特异性,除香蕉外,其余55种对照样品均未检测到荧光信号;该检测方法对食品中香蕉成分的检测灵敏度为0.0001ng/μL香蕉DNA和0.001%(m/m)香蕉粉。该方法能对食品中香蕉成分进行准确、快速的检测,具有特异性好,灵敏度高的优点。