外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

牛源罗伊氏乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌攻毒小鼠生长性能、免疫性能、抗氧化能力及肠道健康的影响

本试验旨在研究牛源罗伊氏乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)攻毒小鼠生长性能、脏器指数、免疫性能、抗氧化能力、肠道屏障功能及肠道组织形态结构的影响。试验选取4周龄、初始体重相近的无特定病原体(SPF)级ICR雄性小鼠40只,随机分为4组,即对照组、攻毒组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组10只。小鼠适应性饲养7 d后开始正式试验,正试期22 d。在正式试验第1~17天,对照组和攻毒组小鼠饲喂基础饲粮,每天灌胃0.2 mL的生理盐水;试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠饲喂基础饲粮,每天分别灌胃1×10^(8)和1×10^(9)CFU/mL的牛源罗伊氏乳杆菌菌悬液0.2 mL;在正式试验第18~22天,对照组小鼠每天灌胃0.2 mL的生理盐水,其他3组小鼠每天灌胃5×10^(9)CFU/mL的ETEC菌悬液0.2 mL进行攻毒。结果显示:1)ETEC攻毒后,与对照组相比,攻毒组小鼠平均日增重显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的平均日增重则无显著变化(P>0.05)。2)ETEC攻毒后,与对照组相比,攻毒组小鼠胸腺指数显著降低(P<0.05),心脏指数显著升高(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的胸腺指数和心脏指数则无显著变化(P>0.05)。3)ETEC攻毒后,试验Ⅱ组小鼠血清中免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和白细胞介素-10含量显著高于攻毒组(P<0.05),白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β含量显著低于攻毒组(P<0.05)。4)ETEC攻毒后,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于攻毒组(P<0.05),丙二醛含量显著低于攻毒组(P<0.05);此外,试验Ⅱ组小鼠血清中超氧化物歧化酶活性也显著高于攻毒组(P<0.05)。5)ETEC攻毒后,与攻毒组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠血清中二胺氧化酶活性显著降低(P<0.05),且试验Ⅱ组小鼠血清中D-乳酸和内毒素含量显著降低(P<0.05)。6)与对照组相比,攻毒组小鼠空肠绒毛高度显著降低(P<0.05),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠空肠绒毛高度则无显著变化(P>0.05)。综上所述,牛源罗伊氏乳杆菌能够缓解ETEC攻毒引起的小鼠体重下降,提高机体免疫性能和抗氧化能力,减轻ETEC感染导致的脏器及肠道损伤。

鸽屠宰加工环节金黄色葡萄球菌肠毒素、生物膜形成能力及其相关基因的检测

为了解鸽屠宰加工环节中金黄色葡萄球菌的肠毒素、生物被膜形成能力、肠毒素及生物被膜形成相关基因的情况。采用金黄色葡萄球菌肠毒素酶联免疫分析试剂盒和结晶紫染色法检测41株金黄色葡萄球菌的肠毒素含量和生物被膜形成能力,同时通过PCR方法扩增金黄色葡萄球菌12种肠毒素基因和10种生物被膜形成相关基因。41株金黄色葡萄球菌在肠毒素酶联免疫法检测中,有30株为产肠毒素的菌株。肠毒素基因的检测中,有35株菌含肠毒素基因,检出率为85.36%,且有携带一种或多种肠毒素基因的情况。经典肠毒素基因的检出率分别为:sea(29.27%)、seb(29.27%)、sec(4.88%)、sed(65.85%)和see(2.44%);新型肠毒素基因的检出率分别为:sel(36.59%)、seg(29.27%)、sem(17.07%)、seu(17.07%)、sei(14.63%)、seh(7.32%)和sek(0.00%)。结晶紫染色法测定菌株生物被膜形成能力弱、中等和强的检出率分别为39.02%、43.90%和17.07%。生物被膜形成相关基因的检测中,clfB、luxS和clfA的检出率最高均为100.00%,其次是sarA和ccp均为97.56%,sigB、cna、icaA、agrC的检出率分别为85.37%、65.85%、41.46%、2.44%,bap未检出。此外,所有菌株均有携带多种生物被膜相关基因的情况,以携带7种基因的菌株最多(15/41,36.59%)。鸽屠宰加工环节污染中金黄色葡萄球菌存在较多的肠毒素且生物被膜形成能力较高,预测该鸽屠宰加工环节中金黄色葡萄球菌具有致病性,存在引起食物中毒的潜在风险。

富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

槲皮素对产肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪肠上皮细胞凋亡和焦亡信号通路的影响

本试验旨在研究槲皮素(Que)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪肠上皮细胞损伤、炎症反应、凋亡和焦亡信号通路的影响。试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,分为4组:对照组、Que组、ETEC K88组、Que+ETEC K88组。用0或10μmol/L Que处理细胞24 h后,再用磷酸盐缓冲液(PBS)或50倍细胞数的ETEC K88刺激细胞2 h,收集样品测定细胞活力、细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞中炎性因子含量、细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因的mRNA表达水平。结果显示:1)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞活力的下降和细胞上清液中LDH活性的上升(P<0.05)。2)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的上升(P<0.05)。3)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞凋亡信号通路相关基因凋亡相关因子配体(FasL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平的上升和B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的mRNA表达水平的下降(P<0.05)。4)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞焦亡信号通路相关基因含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、IL-18、消皮素D(GSDMD)和NLR家族CARD结构域4(NLRC4)的mRNA表达水平的上升(P<0.05)。综上所述,Que可抑制ETEC K88刺激导致的IPEC-1细胞凋亡和焦亡信号通路的激活,缓解细胞损伤。

原儿茶酸对肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪小肠上皮细胞程序性坏死和Toll样受体4信号通路的影响

本试验旨在研究原儿茶酸(PCA)对肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-1细胞)程序性坏死和Toll样受体4(TLR4)信号通路的影响。试验采用2×2因子设计,分为4个组:对照组、PCA组(40μmol/L PCA作用24 h)、ETEC K88组(50倍细胞数ETEC K88作用2 h)和PCA+ETEC K88(40μmol/L PCA作用24 h+50倍细胞数ETEC K88作用2 h)组,每组3个重复。结果显示:1)与对照组相比,ETEC K88组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组细胞活力显著升高(P<0.05),细胞上清液LDH活性显著降低(P<0.05)。2)与对照组相比,ETEC K88刺激导致细胞形态损伤,超微结构破坏,表现为细胞膜破裂,细胞核皱缩,染色质外溢,线粒体出现肿胀并且空泡化;ETEC K88组细胞坏死率显著升高(P<0.05)。与ETEC K88组相比,添加PCA能够保护细胞形态,PCA+ETEC K88组细胞坏死率显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TLR4、脂多糖结合蛋白(LBP)、髓样分化蛋白2(MD2)、白细胞介素受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和髓样分化因子88(MyD 88)的mRNA相对表达显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNF-α、TLR4、LBP、MD2、IRAK1、TRAF6和MyD88的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。4)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、Fas相关死亡结构域(FADD)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)、高迁移率蛋白1(HMGB1)、动力相关蛋白1(Drp1)和磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNFR1、FADD、HMGB1、Drp1和PGAM5的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,PCA可能通过抑制细胞程序性坏死和TLR4信号通路的激活,缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞的炎症反应和损伤。

基于裁剪适配体的纳米金比色法用于金黄色葡萄球菌肠毒素A的可视化检测

目的:筛选适配体作为分子识别原件,基于纳米金的盐效应构建生物传感器,实现金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)的快速定量检测。方法:采用分子对接和分子动力学模拟对SEA适配体进行截短指导和结果预测,利用纳米金显色法验证模拟结果,对SEA适配体优化并将其作为分子识别原件,优化反应体系,探讨SEA质量浓度与吸光度比值间的关系,构建一种可视化的SEA快速检测分析方法,并对方法的准确度、精密度和特异性进行评价。结果:筛选出一条序列短、亲和力高、特异性强且稳定的SEA适配体,建立了一种基于纳米金比色的SEA可视化检测方法,检出限低,加标回收结果满意。结论:采用分子模拟能有效提高适配体筛选效率,本方法可用于SEA快速检测。

不同剂量胸腺肽-α1在肠毒素B与脂多糖复合诱导小鼠脓毒症模型中的免疫干预作用研究

目的 模拟革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌混合感染,建立金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和脂多糖(LPS)复合诱导的小鼠脓毒症模型,观察血清炎症因子及组织蛋白表达水平的变化,探讨不同剂量胸腺肽-α1(Tα1)对脓毒症的免疫干预作用.方法 选择SPF级健康雄性BALb/c小鼠 90 只,按随机数字表法将小鼠分为对照组、Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组,每组 30 只.采用向小鼠腹腔注射 300 μg/kg SEB和1000 μg/kg LPS的方法复制小鼠复合感染脓毒症模型.于腹腔注射SEB2h后,给所有小鼠腹腔注射LPS 1000 μg/kg的同时Tα1 小剂量组小鼠腹部皮下注射Tα1100 μg/kg,Tα1 大剂量组小鼠腹部皮下注射Tα12000 μg/kg,对照组给予等量磷酸盐缓冲液(PBS).观察并记录各组小鼠制模后 6h的体征表现.于制模后2、4、6 h取血分离血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清白细胞介素(IL-6,IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;处死动物后留取脾脏组织,光镜下观察脾脏组织的病理学改变,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)测定脾脏组织核转录因子-κB p65(NF-κB p65)的蛋白表达水平.结果 给药后 6 h,Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组小鼠精神活动、进食、寒战、呼吸、竖毛、大便等体征评分均较对照组明显降低[精神活动(分):1.20±0.42、1.10±0.31 比 2.70±0.48,进食(分):1.50±0.53、1.40±0.52比 2.60±0.70,寒战(分):1.20±0.42、1.30±0.48 比 2.30±0.48,呼吸(分):1.20±0.42、1.30±0.48 比 2.40±0.70,竖毛(分):1.40±0.52、1.20±0.42 比 2.60±0.52,大便(分):1.40±0.52、1.40±0.52 比 2.40±0.52,均P<0.05].随时间延长,各组IL-6、IL-10 逐渐降低,IL-10/IL-6 比值呈先降低后升高的趋势,IFN-γ呈先升高后降低的趋势;对照组TNF-α持续降低,脾脏组织NF-κB p65 的蛋白表达水平持续升高;Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组TNF-α呈先降低后升高趋势,脾脏组织NF-κB p65 的蛋白表达水平呈先升高后降低趋势.给药后 2h,Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组IL-6、IFN-γ、NF-κB p65 的蛋白表达水平均明显高于对照组[IL-6(μg/L):2439.63±3.46、2442.38±22.53 比 2281.47±27.97,IFN-γ(μg/L):47.37±4.69、50.16±7.50 比 40.24±8.64,NF-κB p65/β-actin:0.160±0.009、0.155±0.009 比 0.108±0.005,均P<0.05],IL-10、IL-10/IL-6 比值均明显低于对照组[IL-10(μg/L):82.30±17.00、70.89±8.25 比 214.71±110.43,IL-10/IL-6:0.034±0.007、0.029±0.003比 0.094±0.048,均P<0.05];给药后 2h起Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组TNF-α较对照组明显降低(μg/L:774.84±136.97、1068.88±279.99 比 2712.68±718.06),持续到给药后 6h(均P<0.05).病理学观察显示,肺组织光镜下可见对照组部分肺泡壁破坏、有肺间质出血现象,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组可见肺间质血管充血扩张,未见肺间质出血;肝组织光镜下可见对照组肝细胞水肿,颜色变淡,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组病变较轻;肾组织光镜下可见对照组肾间质血管充血,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组病变较轻;心肌组织光镜下对照组偶见血管扩张充血,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组形态学表现基本正常.结论 Tα1 有利于改善SEB与LPS复合介导的脓毒症小鼠预后,增强脓毒症小鼠的免疫应答,但持续时间有限,提示Tα1 在混合感染的研究中应关注使用时机和疗程;Tα1 在SEB与LPS复合介导的脓毒症小鼠中的有效剂量范围较大,合适的应用剂量有待进一步研究.

生物活性肽对产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用

本试验旨在研究生物活性肽(BTP)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)诱导的小鼠肠道损伤的缓解作用。选用6周龄体重为(18±2)g的C57BL/6小鼠40只,随机分为4组,分别为对照组、ETEC组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组10只。试验期共15 d,在第8~14天,空白对照组和阴性对照组小鼠每天灌胃0.1 mL的磷酸盐缓冲液(PBS),试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠每天分别灌胃150和300 mg/kg的BTP(溶于0.1 mL PBS中);在第15天,空白对照组小鼠灌胃0.2 mL的PBS,阴性对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠灌胃5×109 CFU/mL的ETEC菌悬液(重悬于0.2 mL PBS中),连续观察8 h后进行屠宰。结果表明:1)与空白对照组相比,阴性对照组小鼠的存活率显著降低(P<0.05),腹泻指数显著升高(P<0.05);空肠肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),白细胞介素-1β(IL⁃1β)、白细胞介素-6(IL⁃6)含量显著升高(P<0.05);空肠闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO⁃1)、闭锁小带蛋白-2(ZO⁃2)、转录因子核受体77(Nur77)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05)。2)与阴性对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组小鼠的存活率显著升高(P<0.05),腹泻指数显著降低(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的空肠TNF⁃α的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),IL⁃1β、IL⁃6含量显著降低(P<0.05);试验Ⅱ组的空肠Occludin和Nur77的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的血清MDA含量显著降低(P<0.05),试验Ⅱ组的血清GSH⁃Px活性显著升高(P<0.05)。综上所述,BTP能够缓解ETEC感染导致的小鼠肠道炎症及屏障功能损伤,该作用可能与BTP上调了Nur77表达,抑制小肠上皮细胞凋亡、坏死性凋亡及焦亡有关。

大肠杆菌肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

目的建立一种快速检测大肠杆菌耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,STa,STb)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT-Ⅰ,LT-Ⅱ)基因的多重PCR方法。方法参照文献合成四对可扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素基因(estA、estB)和不耐热肠毒素基因(elt-Ⅰ、elt-Ⅱ)的特异性引物,通过反应条件的优化,敏感性、特异性试验和临床样品检测,建立检测大肠杆菌肠毒素的多重PCR方法。结果用所建立的多重PCR方法可特异性扩增出estA(229bp)、estB(480bp)、elt-Ⅰ(605bp)和elt-Ⅱ(300bp)基因片段,最低检出量分别为2.55×101 CFU/μL、2×101 CFU/μL、2×101 CFU/μL和2.47×103 CFU/μL。从22株大肠杆菌分离株中检测到estA基因(2/22),elt-Ⅱ基因(3/22),未检测到estB和elt-Ⅰ基因,检测结果与常规PCR检测结果一致。结论建立了检测大肠杆菌肠毒素基因(estA、estB、elt-Ⅰ和elt-Ⅱ)的多重PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能够满足对细菌培养物的检测要求。

乌鲁木齐生牛乳中金黄色葡萄球菌的肠毒素检测及分离株同源性分析

探究乌鲁木齐生牛乳中金黄色葡萄球菌经典肠毒素携带情况及分离株同源性差异,为金黄色葡萄球菌的防控提供参考。对乌鲁木齐地区采集的131份生牛乳样品采用特异性选择培养基结合PCR方法分离鉴定金黄色葡萄球菌,并通过PCR方法检测金黄色葡萄球菌5种经典肠毒素(sea、seb、sec、sed、see)携带情况和根据测序结果对分离株进行同源性分析。结果显示,共分离鉴定到金黄色葡萄球菌13株,总分离率为9.92%(13/131);13株金黄色葡萄球菌经典肠毒素阳性菌株5株,阳性率为38.46%;13株金黄色葡萄球菌的同源性在93.7%~99.7%之间,遗传差异在0.3~6.6之间。研究表明,该地区生牛乳中存在一定金黄色葡萄球菌的污染,经典肠毒素阳性率较高,不同来源的分离株同源性高、差异性小。

一起餐馆疑似金黄色葡萄球菌肠毒素所致食源性疾病事件调查

目的:分析并查明一起由金黄色葡萄球菌肠毒素导致的餐馆食源性疾病事件,以期预防此类食品安全事件的发生,为临床治疗提供依据。方法:采用现场流行病学调查方法中的描述性研究方法,按照《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(GB 4789.10—2016)进行检验,同时检测葡萄球菌肠毒素。结果:此次事件疑似为一起由金黄色葡萄球菌肠毒素污染不明食品引起4人出现腹泻、呕吐等症状的事件。结论:应加强餐饮行业人员卫生培训,餐馆卫生监督管理,避免该类事件再次发生,以保障食品安全。

内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的调查研究

为了阐明内蒙古部分地区致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的流行情况,该研究以内蒙古自治区乌兰察布和鄂尔多斯地区部分牛场腹泻病例为研究对象,采集患病犊牛样本,采用PCR方法检测产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)的ST和LT基因进行ETEC菌株鉴定。研究结果显示,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率为11.71%,鄂尔多斯地区ETEC总阳性率为9.44%,其中0~2月龄阳性率为21.49%,2~6月龄阳性率为5%,6~18月龄阳性率为0。由此可知,乌兰察布地区ETEC检测总阳性率高于鄂尔多斯地区,两个地区ETEC的流行情况和感染情况均以0~2月龄犊牛为主,为进一步开展犊牛腹泻疾病的防控提供了依据。

仔猪产肠毒素大肠杆菌疫苗的研究进展

仔猪腹泻仍然是困扰世界养猪业的重要疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌。在饲料中添加抗生素、喂服特异性抗体、膳食调节、利用遗传育种选育等多种方法被用来预防和治疗ETEC引起的感染。相比其他预防措施,疫苗接种是防制ETEC引起仔猪腹泻的最经济和最有效的手段。就目前猪用ETEC疫苗的最新研究进展进行综述,并分析了ETEC疫苗研究中面临的挑战,提出了高效疫苗的研究策略,旨在为ETEC新型、安全、高效和广谱疫苗的研发提供依据。

产肠毒素大肠杆菌对断奶仔猪肠道形态、紧密连接蛋白及细胞外基质的影响

【目的】探究产肠毒素大肠杆菌(ETEC)对断奶仔猪肠道形态、紧密连接蛋白及细胞外基质(ECM)表达的影响。【方法】选取35日龄杜长大断奶仔猪12头,随机分成2组(每组6个重复,每个重复1头):对照组灌喂20 mL生理盐水;产肠毒素大肠杆菌组(K88组)灌喂20 mL 1×10^(9)CFU/mL ETEC K88悬浮液,连续灌喂3 d。试验期间所有仔猪自由采食和饮水,在试验第1和4天,以重复为单位称量仔猪体重,记录耗料量。计算每组的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G);在试验第4天屠宰并采集肠道组织样品,切片观察空肠和回肠的组织形态以及肠道内胶原纤维的含量;采用实时荧光定量PCR分析肠道紧密连接蛋白基因的表达;采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定ECM中胶原蛋白分子以及调控酶系的表达。【结果】与对照组相比,K88组仔猪平均日增重显著降低(P<0.05),平均日采食量极显著降低(P<0.01);空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值极显著降低(P<0.01),回肠的绒毛高度也显著降低(P<0.05);空肠闭锁蛋白(Occludin)mRNA表达量显著降低(P<0.05),闭合蛋白-1(Claudin-1)mRNA表达量极显著降低(P<0.01),回肠闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、Occludin mRNA表达量极显著降低(P<0.01),Claudin-1 mRNA表达量也显著降低(P<0.05);空肠、回肠胶原纤维含量显著减少(P<0.05);空肠Ⅳ型胶原蛋白α2链(COL4A2)、COL5A1、COL6A1的mRNA表达量极显著降低(P<0.01),空肠COL4A2以及COL6A1蛋白表达量均显著降低(P<0.05);空肠基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA相对表达量显著增加(P<0.05),纤溶酶原激活物(PAs)的mRNA相对表达量则极显著降低(P<0.01);MMP9蛋白含量极显著提高(P<0.01)。【结论】灌喂ETEC K88降低了断奶仔猪平均日增重以及平均日采食量,损伤肠道形态并降低肠道紧密连接蛋白的表达。并且可通过减少肠道中胶原纤维的含量、降低胶原蛋白分子以及ECM调控酶系的表达进而造成肠道中ECM的变化。

产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌多重荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立能同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中产肠毒素大肠杆菌ST和LT基因及沙门氏菌invA基因序列设计引物和探针,通过优化扩增体系中引物和探针剂量建立检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,分析该方法的特异性、敏感性和重复性,用建立的方法对85份临床样品进行检测,并与实验室传统血清学分离鉴定方法进行比较。结果表明:在ST基因的最佳引物和探针剂量为0.4μL、0.8μL,LT基因的最佳引物和探针剂量为0.6μL、1.0μL,invA基因的最佳引物和探针剂量为1.0μL、1.2μL时,扩增曲线良好,ST基因、LT基因、invA基因的标准曲线回归方程相关系数(R2)分别为0.975,0.968,0.915,扩增曲线具有良好线性关系;建立的多重荧光定量方法对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等细菌核酸无交叉反应;组内重复变异系数均低于2%,且产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的最低检出浓度均为1×10^(1)copies/μL;从85份临床样品中检出产肠毒素大肠杆菌20份,沙门氏菌阳性样品10份,双阳性样品2份,与实验室传统血清学分离鉴定方法的符合率为94.12%。说明试验建立的多重荧光定量PCR方法的特异性好、敏感性强,稳定性高,具有良好的使用前景。

新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分子生物学研究进展

阐述了新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)菌毛的结构、分子生物学特性、基因检测技术、菌毛抗原受体的生化特性以及菌毛载体系统的优点;另外,从分子结构与功能、作用机理、基因检测三方面叙述了新生仔猪ETEC不耐热肠毒素和耐热肠毒素的研究进展。

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.