山羊支原体山羊肺炎亚种重组酶聚合酶扩增技术的建立

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的重组酶聚合酶扩增技术,对其灵敏度、重复性、准确性和特异性进行了试验,并初步用于临床样品的检测。结果显示,山羊传染性胸膜肺炎核酸阳性样品能够在核酸检测试纸条上显示阳性条带,阴性样品无条带。试验具有良好的重复性和敏感性(达到10 copies/μL)。用建立的重组酶聚合酶扩增技术与普通PCR方法同时检测疑似山羊传染性胸膜肺炎8份样品,结果均为3份阳性和5份阴性,符合率100%。该检测方法适用于山羊传染性胸膜肺炎的快速诊断,为Mccp的快速检测提供了新的技术。

山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶基因的克隆表达及其编码氨基酸的生物学分析

旨在获得山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)的蛋白表达产物,分析其编码氨基酸的生物学特性,为进一步研究LDH蛋白的功能奠定基础。试验完成了LDH基因的克隆和密码子改造,成功将LDH基因中473、761、779 nt处的A突变为G,使改造后的LDH基因能在大肠埃希氏菌Rosetta中正确表达。SDS-PAGE电泳结果显示,IPTG诱导目的蛋白表达后获得一条大小约34 ku的蛋白条带,Western blot结果表明获得的原核表达产物可与抗6×His tag的单克隆抗体发生特异性反应,研究采用DNAStar Protean模块分析了LDH的二级结构、蛋白骨架柔性区域和可能的B细胞抗原优势表位,为进一步研究其功能奠定了基础。

基于0507蛋白的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)抗体检测方法,对Mccp的0507基因进行克隆与载体构建,通过原核表达技术制备重组0507蛋白,建立Mccp抗体间接ELISA检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性与重复性,并对临床收集的血清样品进行检测。结果显示,重组0507蛋白大小为39 ku,Western blot证明重组0507蛋白具有良好的反应原性;建立的ELISA检测方法抗原包被量为3μg/mL,血清稀释倍数为1∶200,酶标二抗稀释倍数为1∶2500,阴阳临界值为0.221。用该方法对山羊流产衣原体、立克次氏体与牛支原体的阳性血清进行检测,结果均为阴性;Mccp阳性血清最大稀释倍数为1024倍;批内、批间变异系数均小于10%。对陕西省部分羊场收集到的282份血清进行检测,Mccp阳性率为13.1%。该研究建立了一种检测Mccp抗体间接ELISA检测方法,为Mccp的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。

肺炎克雷伯菌肺炎亚种分布情况与药物敏感性研究

目的:探究肺炎克雷伯菌肺炎亚种分布情况与药物敏感性。方法:通过回顾性分析法对三穗县人民医院2020年1月—2022年12月住院患者微生物送检标本中分离出的209株肺炎克雷伯菌药敏性资料进行分析。结果:2020年1月—2022年12月于临床各标本中共分离出209株肺炎克雷伯菌肺炎亚种,主要来源于痰及咽拭子标本,占比80.38%;科室分布以呼吸内科、儿科、重症监护室为主,分别占比23.92%、21.53%、15.31%;209株肺炎克雷伯菌肺炎亚种对不同的抗菌药物存在不同的药物敏感性,对二、三代头孢菌素的敏感性最低;对广谱青霉素,二、三代头孢药敏性波动在45.78%~79.18%,三代头孢中头孢曲松的药物敏感率(58.74%)和头孢他啶(58.00%)相当;对四代头孢、氨基糖苷类、喹诺酮类的药敏性较高,波动在71.58%~93.58%,对碳氢酶烯类的药敏性很高,敏感性>96%。209株肺炎克雷伯菌肺炎亚种中产超广谱β内酰胺酶菌株共55株,检出率为31.57%,各年度检出率分别为26.22%、28.33%、34.09%,呈现逐年增加趋势。结论:肺炎克雷伯菌肺炎亚种的临床分离率、产超广谱β内酰胺酶呈逐年增加趋势,医院应加强重视,增加对其药物敏感性监测,有助于临床合理选择抗菌药物。

一株山羊支原体山羊肺炎亚种的分离鉴定与分子特征

从送检的山羊肺炎肺脏中成功分离到一株支原体,经过3次克隆纯化后进行生化试验、电镜观察、PCR及酶切、基因特征鉴定,结果显示分离物SD3属于山羊支原体山羊肺炎亚种成员。将培养物经气管接种2只山羊可引起1只山羊典型发病,体温升高至41.5℃,IgG和IgM抗体效价明显升高,其中IgG抗体变化与临床表现基本同步。剖检发现肺脏发生严重病变,并从中再次分离到该病原体。

山羊支原体山羊肺炎亚种湖北株的鉴定及其外膜蛋白的免疫原性研究

从湖北某地山羊肺脏中分离支原体,经多次克隆纯化后进行生化试验、显微镜观察、PCR及酶切分析、基因特征鉴定以及用动物致病性试验对该菌株进行了鉴定,命名为GH2,进一步通过免疫印迹对GH2株外膜蛋白及GH2株全菌蛋白免疫原性进行分析,并用抗Y98血清和抗PG3血清进行比较,筛选GH2株特异性的外膜蛋白,结果表明GH2株为山羊支原体山羊肺炎亚种,存在于GH2外膜蛋白中的相对分子质量大约为60和49.7ku的蛋白可能是其主要的免疫原性蛋白,也是GH2株区别于丝状支原体山羊亚种标准株PG3和绵羊肺炎支原体标准株的主要特异性抗原。这一结果为山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断和疫苗研制提供了良好的理论基础。

从山羊中检测山羊支原体山羊肺炎亚种

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasmacapricolumsub—sp．capripneumonia，Mccp）最早由MacOwan和Minette于1976年分离，是引起山羊传染性胸膜肺炎（Contagiouscap—rineplemopneumonia，CCPP）的病原体。CCPP是山羊的一种急性或慢性呼吸道传染病，以纤维素性胸膜怖炎为主要特征，被感染羊群无年龄和性别差异，发病率和死亡率都很高。该病的发生最早可追溯到1873年的阿尔及利亚，现广泛流行于非洲和亚洲养羊国家，危害极大，被世界动物卫牛组织（OIE）列入重要疾病名录。

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多重抗原肽的小鼠免疫试验

旨在构建一种由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum Subsp.capripneumoniae,Mccp)六个B细胞表位和三个T细胞表位组成的多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),将其在大肠杆菌中表达后免疫小鼠,评估其体液免疫和细胞免疫。分别用MAP、单个B细胞表位及全菌超破抗原作为抗原,检测免疫小鼠抗体水平,结果显示三种抗原均能和小鼠免疫血清发生很好的反应(P<0.01)。体外代谢抑制试验显示,1∶64倍稀释的免疫小鼠血清可以有效抑制Mccp的生长。淋巴细胞增殖试验显示,当用单个T细胞表位及Mccp超破抗原分别刺激免疫小鼠的淋巴细胞时均产生明显的增殖现象(P<0.01)。细胞因子检测结果显示,免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10产量明显升高(P<0.001),而IL-12产量明显下降(P<0.001)。数据显示,构建的MAP能够引起小鼠的免疫反应,这一结果为由Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了一定的基础。

五指山猪肺炎克雷伯菌肺炎亚种的分离及鉴定

从发病猪场濒死的五指山小猪肝脏、脾脏、小肠中分离到3株革兰氏阴性杆菌,对分离菌株进行形态学、培养特性、生化特性和分子生物学鉴定,确定分离菌株为肺炎克雷伯菌肺炎亚种。利用细菌16S rRNA通用引物对3株细菌基因组DNA进行扩增,均可得到大小为1 503 bp的特异性片段,该序列与GenBank上已经登录的猪源肺炎克雷伯菌序列同源性达99%。动物毒性试验证明其对小鼠有较强的致病性。

青海省山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测

[目的]调查山羊传染性胸膜肺炎在青海省的流行状况。[方法]利用山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝试剂盒对青海各地区的208份山羊血清进行检测。[结果]山羊血清阳性率为16.3%,不同地区山羊的阳性率范围为6.7%～24.3%。[结论]青海地区的山羊支原体山羊肺炎亚种的感染率较高,应该加强对该病的防控。

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。

山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体的制备及抗体结合抗原表位的筛选

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)技术鉴定单克隆抗体的特异性及胶内酶切鉴定与抗体结合的抗原表位。最终成功筛选获得5株单克隆抗体,鉴定到3个与抗体结合的抗原表位,为下一步科学研究提供了初步且可靠的试验基础。

山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR测定及动物回归试验

江苏省泰州市肉山羊养殖业时常发生山羊支原体性肺炎,基于临床上山羊支原体性肺炎病原的多样性以及支原体分离培养的困难性,以疑似山羊支原体肺炎病例肺组织、胸腔渗出液、心包液为病料,采用PCR技术检测并进行动物回归试验,首次证实泰州地区山羊支原体性肺炎病例中存在山羊支原体山羊肺炎亚种病原,为当地临床防治该病提供了科学依据。

羊支原体山羊肺炎亚种在两种培养基上的生长特性比较

通过比较山羊支原体肺炎亚种在两种不同培养基上的繁殖情况,筛选出成本低、生长迅速、产量高的适合疫苗制备的培养基。选用山羊支原体肺炎亚种F38株,分别接种到改良的Thiaucourt’s肉汤(MTB)培养基和含5%马血清的改良培养基(HF3)上,在144h内检测菌落形成单位(colony forming units,CFU)、颜色变化单位(color change units,CCU)、菌体蛋白浓度变化情况,并绘制出生长曲线图。山羊支原体肺炎亚种F38株在HF3培养基中CCU计数和CFU计数均高于MTB培养基上的计数,但蛋白浓度略低于MTB培养基培养情况,HF3培养基较MTB具有更好的培养效果。

几种消毒剂对致病性凝结芽孢杆菌和克雷伯氏菌肺炎亚种的消毒效果试验

应用5%来苏儿、2%甲醛、2%NaOH、5%碘酊和二氯异氰脲酸钠(100μg/ml)对导致牛、羊“猝死症”的凝结芽孢杆菌和克雷伯氏菌肺炎亚种两株病原性细菌进行了消毒效果试验,结果发现,上述几种消毒剂对两种细菌均具有很强的杀灭力。

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立

为同时快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),本研究根据Mo的P80基因,Mmc的MLC_1760和Mccp的arcA基因序列,设计合成了3对特异性引物,建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。该方法可以同时扩增出Mo、Mmc和Mccp的特异性片段,而对大肠杆菌、巴氏杆菌、羊传染性脓疱病毒等常见羊病病原无交叉反应,对Mo、Mmc和Mccp的最低检出量分别为3.62×10~4拷贝/μL、4.03×10~5拷贝/μL和6.78×10~5拷贝/μL。应用该方法对75份临床样品进行检测,结果与单一PCR检测结果一致。对32份临床样品同时用该多重PCR方法与分离鉴定法进行检测,结果显示,两种方法对Mo、Mmc、Mccp的检测符合率分别为87.5%、100%、100%。本研究建立的多重PCR方法特异性强、敏感性较高,适用于Mo、Mmc和Mccp临床快速检测及流行病学调查。

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法,本研究采用2对特异性引物,对退火温度和引物浓度比进行了优化,成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重PCR方法。结果显示,该方法具有很好的特异性,仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增,而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增;该方法对两种病原的检测限分别为32pg和50pg,与单独PCR相同;26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23.1%,多杀性巴氏杆菌的检出率为26.9%。所建立的双重PCR具有特异性好、灵敏度高的特点,为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。

山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株的分离鉴定

为获得山羊传染性胸膜肺炎病原野毒株,采集陕西杨凌某羊场疑似患山羊传染性胸膜肺炎山羊的鼻分泌物,进行PCR检测,病原分离培养,菌落形态观察,生化培养试验鉴定,PCR鉴定,基因序列测定分析,动物回归试验。结果显示,PCR检测鼻液分泌物呈山羊支原体山羊肺炎亚种阳性;菌落呈现中心脐、边缘光滑、油煎蛋状样;能发酵葡萄糖、不水解精氨酸、不分解尿素、能还原四唑氮、膜斑试验阴性、可液化马血清、消化酪蛋白,对洋地黄皂苷敏感;基因测序结果显示与GenBank中已收录的山羊支原体山羊肺炎亚种基因同源性为99.8%;动物回归试验结果显示,该菌株对山羊造成了严重的胸膜肺炎,具有致病性。结果表明,成功分离出1株山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株。