CCK-8对大鼠肺间质巨噬细胞cAMP-PKA信号通路的激活作用

目的探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)cAMP-PKA信号通路的激活作用。方法分离纯化大鼠PIMs,采用放射免疫分析法测定细胞内cAMP含量,放射激酶法测定PKA活性,受体拮抗剂的IC50值由对数-几率单位法求得。结果正常对照组大鼠静息状态下PIMscAMP含量和PKA活性分别为(2.04±0.13)nmol·g-1和(118.3±11.2)nmol·min-1·g-1。低浓度CCK-8[(10-12～10-10)mol·L-1]对细胞内cAMP含量和PKA活性没有影响(与正常对照组比较:P>0.05);高浓度CCK-8[(10-9～10-5)mol.L-1]可明显提高细胞内cAMP含量和PKA活性(与正常对照组比较:P<0.05)。10mg·L-1脂多糖(LPS)刺激大鼠PIMs,可明提高细胞内cAMP含量和PKA活性,分别为(5.15±0.12)nmol·g-1和(188.6±13.5)nmol·min-1·g-1。不同浓度的CCK-8与LPS共同孵育PIMs,细胞内cAMP含量和PKA活性的变化趋势与CCK-8作用于静息状态下大鼠PIMs的变化趋势完全相同。CCK受体拮抗剂丙谷胺、CR-1409、CR-2945可呈剂量依赖性地抑制CCK导致的cAMP含量的升高,它们的IC50值分别为(0.5×10-6、4.1×10-6、7.2×10-4)mol·L-1。丙谷胺、CR-1409、CR-2945也可明显减弱CCK-8所导致的PKA活性的升高;其中,丙谷胺的抑制作用最强,CR-1409次之,CR-2945的抑制作用最小。结论CCK-8可剂量依赖性地激活静息状态和LPS诱导的大鼠PIMscAMP-PKA信号转导途径,这可能是CCK抗炎作用的分子机制之一。CCK激活cAMP-PKA通路是通过CCK受体来实现的,且CCK-AR的作用比CCK-BR的作用更为明显。

CC-K8抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞TLR4及IL-1β的表达

目的观察八肽胆囊收缩素(cholecystokininoctapeptide ,CCK 8)对外源性脂多糖(lipopolysaccharide ,LPS)激活大鼠肺间质巨噬细胞(pulmonaryinterstitialmacrophages,PIMs)Toll样受体4 (Tolllikereceptor4 ,TLR4 )及IL 1β表达的影响,探讨CCK- 8的抗炎作用机制。方法分离培养大鼠PIMs ,经LPS、CCK- 8及溶剂单独或共同孵育不同时间后,采用Northernblot、ELISA、RT PCR技术检测TLR4mRNA、IL- 1β及IL- 1βmRNA表达的变化。结果LPS(1mg/L)刺激可使PIMs中TLR4mRNA表达明显增强;随着LPS孵育时间的延长,细胞中的IL -1β含量逐渐增多,2 4h达高峰,IL- 1βmRNA表达水平同时明显升高;CCK 8可剂量依赖性抑制LPS诱导的大鼠PIMsTLR4mRNA、IL- 1β及IL 1βmRNA的表达。结论CCK 8对LPS激活的PIMsTLR4及IL- 1β表达有负性调节作用,是CCK- 8抗炎作用机制之一。

脂多糖对大鼠肺间质巨噬细胞CCK受体mRNA表达的影响

目的:探讨胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)受体CCK—AR及CCK—BR mRNA在大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)内的表达及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对其表达的影响。方法:用酶消化法结合肺泡灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化大鼠PIMs,用LPS(10 mg/L)孵育PIMs 0.5-12 h。采用RT-PCR及Southern印迹技术观察CCK受体在大鼠PIMs内的表达亚型及LPS对其表达的影响。结果:经RT—PCR检测显示。CCK—AR和CCK—BR mRNA在大鼠PIMs均有表达,CCK—ARmRNA RT—PCR扩增产物为1.37 kb,CCK—BR mRNA RT—PCR扩增产物为480 bp。CCK—BR mRNA的相对表达量高于CCK—AR;LPS作用2 h可明显诱导2种CCK受体mRNA表达上调,至12 h仍维持较高水平。用γ-32P—ATP标记的两种特异性探针分别对CCK—AR和CCK—BR mRNA RT—PCR扩增产物进行Southern分子杂交,结果均有特异性杂交带出现。结论:肺间质巨噬细胞有CCK—AR和CCK—BR mRNA表达,LPS可诱导2种CCK受体mRNA表达上调。

严重胸部创伤复合内毒素感染对肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的影响

目的 :观察正常大鼠肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的差异 ,比较两种细胞对严重胸部创伤、创伤复合内毒素感染的不同反应性。方法 :采用胸部撞击伤模型 ,造成动物严重胸部致伤 ;分离、纯化动物肺泡和肺间质巨噬细胞 ,检测两种细胞创伤前和创伤后 2、4、8、16和 2 4 h吞噬功能的动态变化。结果 :创伤早期 (2和 4 h)巨噬细胞吞噬功能增强 ,随后下降 ;肺泡巨噬细胞吞噬功能在创伤前后各时间点均显著强于间质巨噬细胞(P均 <0 .0 1) ;复合内毒素感染后 ,肺泡巨噬细胞吞噬功能未受影响 ,但间质巨噬细胞的吞噬能力进一步增强。结论 :肺泡和间质巨噬细胞具有功能异质性 ,而且两种细胞亚群对创伤及复合内毒素感染的反应性不同 ,提示两者在创伤后机体免疫功能紊乱中的地位不同。

大鼠肺间质巨噬细胞CCK受体的结合特性

目的:观察大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)胆囊收缩素(CCK)受体的表达亚型和结合特性。方法:用酶消化法结合肺泡耗竭灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化大鼠PIMs,超速离心法提取细胞膜,与[~3H]标记的硫酸化CCK-8([~3H]-CCK-8S)进行放射配基结合实验,用非标记的CCK-8S、CCK-A受体(CCK-AR)特异性拮抗剂CR1409及CCK-B受体(CCK-BR)特异性拮抗剂CR2945进行竞争抑制实验,观察配体受体结合的特异性及CCK受体表达亚型,观察孵育时间和温度对特异性结合的影响。结果:正常大鼠PIMs未能检出特异性结合,静脉注射脂多糖(LPS)48h出现特异性结合,且对孵育时间与温度有依赖性。经Scatchard分析,平衡解离常数(Kd)值为:(0.68±0.28)nmol·L^(-1),最大结合容量(Bmax)值为(32.50±2.70)pmol·g^(-1)蛋白。通过竞争抑制实验,[~3H]-CCK-8S与膜的结合可被CCK-8S、CR1409、CR2945所抑制,其IC_(50)值分别为:(3.20±1.13)nmol·L^(-1),(0.19±0.06)μmol·L^(-1)和(2.30±0.80)nmol·L^(-1)。结论:大鼠PIMs存在CCK-A和CCK-B两种受体亚型,为CCK对生理及病理条件下巨噬细胞发挥效应提供了直接的结构依据。

急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4的表达及意义

目的 观察严重胸部创伤致急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化,并探讨其意义。方法 建立严重胸部创伤致急性肺损伤模型。肺组织机械剪碎,然后用胶原酶、DNA酶消化肺组织,分离、培养肺间质巨噬细胞,利用免疫印迹蛋白、Northern Blot等分子生物学技术检测创伤前以及创伤后2、4、8、16和24 h肺泡巨噬细胞TLR4蛋白及基因表达。结果 利用小型多功能生物撞击机以400 kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤,能够建立稳定可靠并且符合临床特点的严重胸部创伤模型;严重胸部创伤可以上调TLR4蛋白及基因在肺间质巨噬细胞内的表达,表达高峰在伤后8和16 h,伤后24 h恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。

益气化纤汤对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞和肺间质巨噬细胞TGF-β_1 mRNA表达的干预作用

目的观察益气化纤汤对肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)TGF-β1mRNA表达的干预作用。方法将96只大鼠分成假手术组、博莱霉素组、益气化纤汤组和氢化可的松组,每组24只。假手术组灌胃0.9%氯化钠溶液(NS)10 mL.kg-1.d-1;博莱霉素组灌胃0.9%氯化钠溶液10 mL.kg-1.d-1,益气化纤汤组灌胃40%益气化纤汤10 mL.kg-1.d-1;氢化可的松组皮下注射氢化可的松20 mg.kg-1.d-1。造模组大鼠用戊巴比妥钠(30 mg.kg-1)腹腔注射麻醉后,将博莱霉素A5(6 mg.kg-1)注入气管后造肺纤维化模型。假手术组注入0.9%氯化钠溶液。造模第7,28天分别分离培养AM、IM,采用分子原位杂交法(ISH)检测TGF-β1mRNA的表达。结果博莱霉素组大鼠AM、IM的TGF-β1mRNA表达阳性细胞百分率、TGF-β1mRNA阳性面积的积分吸光度(IA)值与假手术组比较明显升高(P<0.01);氢化可的松组与博莱霉素组比较,AM TGF-β1mRNA表达阳性细胞百分率、IA值差异有显著性或极显著性(P<0.05或P<0.01);益气化纤汤组与博莱霉素组比较,AM、IM中TGF-β1mRNA表达阳性细胞百分率、IA值显著下降(P<0.01)。结论益气化纤汤可减少AM、IMTGF-β1mRNA的表达,通过减弱细胞因子网络对于肺纤维化形成的促进作用而抑制纤维化的发展。

脂多糖对大鼠肺间质巨噬细胞CCK受体mRNA表达的影响

目的:检测八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)亚型CCK—A及CCK—B受体mRNA在大鼠肺间质巨噬细胞(PIM)的表达,并观察脂多糖(LPS)对其表达的影响。方法:用酶消化法分离培养大鼠肺间质巨噬细胞,用LPS(10 mg/L)孵育细胞不同时间,采用RT—PCR及Southern杂交技术观察CCK受体在大鼠PIM上的表达亚型以及LPS对其表达的影响。结果:从正常的SD大鼠肺组织中分离培养的肺间质巨噬细胞,经RT—PCR检测显示,CCK—AR和CCK—BR

cAMP-PKA信号通路在CCK-8抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞NF-κB活化中的作用

目的:探讨cAMP-PKA信号通路对八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapetide,CCK-8)抑制LPS诱导的大鼠肺间质巨噬细胞(pulmonary interstitial macrophages,PIMs)核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活性的影响.

CCK-8抑制LPS作用下大鼠肺间质巨噬细胞NF-κB活性的cAMP-PKA通路研究

目的:用cAMP激动剂forskolin和PKA抑制剂H-89,探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)抑制LPS作用下大鼠肺间质巨噬细胞(PIM s)核因子-κB(NF-κB)活性的cAMP-PKA信号通路机制。方法:分离纯化大鼠PIM s。用电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测大鼠PIM s中NF-κB活性,用W estern b lotting分析IκB-α蛋白水平。结果:正常对照组大鼠PIM s核内未检测到与特异性寡核苷酸探针相结合的NF-κB,LPS组细胞内NF-κB活性明显高于正常对照组(P<0.01),胞浆中IκB-α水平显著低于正常对照组(P<0.01)。CCK组和Fsk组细胞内NF-κB活性和胞浆中IκB-α含量均无明显差异(P>0.05)。CCK+LPS组和Fsk+LPS组,细胞内NF-κB活性均低于LPS组(P<0.05),IκB-α含量均高于LPS组(P<0.01)。LPS+CCK+H-89组NF-κB活性高于CCK+LPS组(P<0.01),而IκB-α蛋白水平低于CCK+LPS组(P<0.01)。结论:cAMP-PKA信号通路的活化可抑制LPS诱导的大鼠PIM s细胞内NF-κB活性升高和IκB-α蛋白水平的降低,CCK-8的抗炎作用是通过激活cAMP-PKA信号通路进而抑制NF-κB活性来实现的。

哮喘小鼠肺间质巨噬细胞的表型特征分析

目的:观察哮喘小鼠肺间质巨噬细胞的表型特征。方法:12只BALB/c小鼠随机分为哮喘组和正常组,每组6只。哮喘组和正常组分别采用卵清白蛋白和PBS致敏和激发。流式细胞仪检测肺间质巨噬细胞和M2型肺间质巨噬细胞的数量;RT-PCR检测肺间质巨噬细胞精氨酸酶1(Arg1)、转谷氨酰胺酶2(TG2)、白细胞介素(IL)-10和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达水平;ELISA法检测肺间质巨噬细胞体外培养上清液IL-10和IL-12水平。结果:哮喘组小鼠肺间质巨噬细胞占肺单个核细胞的百分数和M2型肺间质巨噬细胞占肺间质巨噬细胞的百分数明显高于正常组(均P<0.01)。哮喘组小鼠肺间质巨噬细胞Arg1和TG2mRNA表达水平明显高于正常组(均P<0.01),IL-10mRNA表达水平明显低于正常组(P<0.01),iNOS mRNA表达水平与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。哮喘组小鼠肺间质巨噬细胞体外培养上清液IL-10水平明显低于正常组(P<0.01),IL-12水平与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:哮喘肺间质巨噬细胞表现为替代活化巨噬细胞的表型特征,并高表达TG2。

沙眼衣原体小鼠肺炎菌株呼吸道感染诱导肺泡巨噬细胞和肺间质巨噬细胞浸润并极化

目的探讨沙眼衣原体呼吸道感染对肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)和肺间质巨噬细胞(interstitial macrophages,IMs)浸润并向M1型或M2型极化的影响。方法C57BL/6小鼠以鼻腔吸入沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)建立小鼠沙眼衣原体呼吸道感染模型。采用流式细胞术检测Cm呼吸道感染后0 d、3 d、7 d、14 d肺组织中AMs(CD45^(+)F4/80^(+)CD11c^(+))和IMs(CD45^(+)F4/80^(+)CD11c-)比例并分析细胞数目,同时检测AMs和IMs中M1型巨噬细胞(CD80^(+)、CD86^(+)、MHCⅡ^(+)、iNOS^(+)细胞)比例和M2型巨噬细胞(CD206^(+)、Arg1^(+)细胞)比例。结果(1)Cm呼吸道感染诱导AMs和IMs浸润,与未感染组(0 d)比较,感染后3 d AMs和IMs比例和数目显著增加(P<0.05和P<0.01),感染后7 d AMs和IMs数目均达峰值(P<0.001)。(2)与未感染组比较,感染后3 d AMs中CD80^(+)和CD86^(+)细胞比例明显升高(P<0.05和P<0.01);AMs中MHCⅡ^(+)细胞比例在感染后持续升高,于14 d达峰值(P<0.05),CD206^(+)细胞比例在感染后持续降低(P<0.05)。(3)与未感染组比较,感染后3 d IMs中CD80^(+)和CD86^(+)细胞比例显著升高(P<0.05和P<0.001),感染后14 d MHCⅡ^(+)细胞比例明显升高(P<0.01),CD206^(+)细胞比例变化差异无统计学意义。(4)AMs中iNOS^(+)细胞比例在感染后持续升高(P<0.01);AMs中Arg1^(+)细胞比例在感染后持续降低,与未感染组比较,感染后7 d和14 d显著降低(P<0.05)。IMs中iNOS^(+)细胞比例于感染后7 d达峰值(P<0.001),IMs中Arg1^(+)细胞比例变化差异无统计学意义。结论Cm呼吸道感染诱导AMs和IMs浸润并刺激AMs和IMs向M1型巨噬细胞极化,减弱AMs中M2型巨噬细胞极化水平,而对IMs中M2型巨噬细胞极化无显著影响。

纤维化大鼠肺巨噬细胞TGF-β_1 mRNA表达的变化及肺炎合剂的干预作用

目的观察纤维化大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)TGF-β1mRNA表达的变化及肺炎合剂的干预作用。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、肺炎合剂组和氢化可地松4组,给药第1天采用博莱霉素A5造模,第7天和第28天分批处死大鼠后,分别分离培养AM和IM,采用分子原位杂交(ISH)法检测TGF-β1mRNA的表达。结果肺炎合剂能下调博莱霉素造成的TGF-β1mRNA表达增高(均P<0.01)。结论肺炎合剂可降低AM、IM TGF-β1mRNA的表达,通过减弱细胞因子网络对于肺纤维化形成的促进作用而抑制纤维化的发展。

猪肺脏巨噬细胞的分离培养

提取分离猪肺泡巨噬细胞(PAM)、猪肺血管巨噬细胞(PIM)、猪肺间质巨噬细胞(IM)三种细胞并进行体外培养,采用免疫组化和流式细胞术进行细胞的异质性研究。无菌条件下通过支气管肺泡灌洗获取PAM,右心室插管经心脏行肺血管原位灌注的方法分离得到PIM,肺组织机械处理结合酶消化法(胶原酶IA)分离IM。显微镜下观察三种细胞的形态上的不同;免疫组化和流式细胞术检测细胞表型。三种巨噬细胞形态有明显的不同,PAM较大,表面粗糙,PIM和IM较小,并且细胞光滑;PAM细胞大多为CD163阳性,IM和PIM则CD86阳性较多。PAM、PIM、IM在形态和表型上存在异质性。

免疫细胞对新冠病毒的强烈反应可导致肺炎

肺部监护者对感染的强烈反应有助于解释为什么COVID-19会变得严重。这些被称为肺间质巨噬细胞的监护者会在肺组织间巡逻。这些细胞可被SARS-Cov-2大规模感染,研究人员于4月10日出版的《实验医学杂志》(Journal of Experimental Medicine)上在线作了报道。在病毒攻击的大潮下,这些细胞极端的炎症反应可促进肺炎的发展,这是一种对肺部造成伤害并且产生呼吸困难的疾病。

中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究

【目的】观察益气化纤汤对肺纤维化模型大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)中转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA表达的影响。【方法】选用Wistar大鼠96只,随机分为假手术组、模型组、益气化纤汤组(剂量为4g·kg-·1d-1)、氢化可的松组(剂量为20mg·kg-·1d-1);采用博莱霉素A5(剂量为6mg/kg)气管注入法复制肺纤维化模型;分别于造模第7、28天分离培养AM、IM,采用分子原位杂交法(ISH)检测TGF-β1 mRNA的表达。【结果】模型组AM、IM中TGF-β1 mRNA表达阳性细胞百分率及积分光密度(D)值显著升高(均P<0.01);益气化纤汤可显著降低AM、IM中TGF-β1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值(均P<0.01),其作用与氢化可的松相仿。【结论】益气化纤汤治疗肺纤维化的作用可能与其能降低TGF-β1的表达,抑制纤维化的发展进程有关。

肺巨噬细胞研究的现状及进展

肺是人体的一个重要器官，负责气体交换功能。肺的另一个特点，在于其与外界相通，每天都有大量的空气中的无机和有机颗粒进入肺内。因此肺部具有一个完善而且特殊的免疫环境。在这个环境中，肺的巨噬细胞扮演着重要的角色。本综述将对肺巨噬细胞的分类、发育、功能、获取的一些进展进行论述。

胸部钝器伤可引发介质依赖型单核细胞向肺部迁移

近日德国学者对肺部钝器伤能否诱发单核细胞向肺部聚集以及此过程所涉及的介质进行了研究。研究人员利用冲击波致伤大鼠制作胸外伤动物模型，并将其分为胸外伤组及对照组，评估分布于支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺泡巨噬细胞表面的趋化因子数量，趋化因子及趋化因子受体2（CCR2）mRNA在单核细胞、肺间质巨噬细胞及肺泡巨噬细胞中的表达情况。

CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响。方法分离纯化大鼠PIMs,分别用LPS、CCK、LPS+CCK、PMA、SC-3088、LPS+PMA、LPS+SC-3088、CCK+PMA、CCK+SC-3088、LPS+CCK+PMA、LPS+CCK+SC-3088孵育一定时间,采用125I-cAMP放射免疫分析法测定细胞内cAMP含量,用放射激酶法测定PKA活性。结果单独应用PMA和SC-3088孵育大鼠PIMs,细胞内cAMP含量和PKA活性与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)。PMA可升高LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性(P<0.01),SC-3088则可使LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。分别应用PMA、SC-3088与CCK共同孵育,则CCK+PMA组细胞内cAMP含量和PKA活性高于单独应用CCK组(P<0.01),CCK+SC-3088组则降低(P<0.01)。与LPS+CCK组相比,PMA+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性升高(P<0.01),而SC-3088+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。结论在LPS诱导的大鼠PIMs,CCK-8可通过激活cAMP-PKA信号通路发挥抗炎作用;DAG-PKC信号通路的活化对cAMP-PKA信号通路有正性调节作用。