液质联用技术(LC-MS)在rh-PTH(1-34)肽图确定中的应用

目的:建立可用于质量控制的 rh-PTH(1-34)的标准胰酶肽图分析方法,并确定其理论肽图。方法:用胰酶动态酶切rh-PTH(1-34)探索最佳肽图分析条件,利用氨基酸特征吸收波长色谱分析结合 LC-MS 相对分子质量分析确证理论肽图。结果:多批 rh-PTH(1-34)原液经胰酶解、RP-HPLC 分析后,可产生4个主要肽段,其图谱与人工合成的 hPTH(1-34)对照品一致;确定其理论肽图为:T_1—HLNSMER、T_2—LQDVHNF、L_3—VEWLR、T_4—SVSEIQLMHNLGK。结论:建立的胰肽图分析方法可用于 rh—FFH(1—34)产品的质量控制,用氨基酸特征吸收波长分析辅助 LC-MS 相对分子质量分析可有效用于 rh-PTH(1-34)的标准肽图确定。

重组人碱性成纤维细胞生长因子肽图分析方法的优化

随着重组人碱性成纤维细胞生长因子在临床应用越来越广泛,肽图分析是其质量控制的主要方法,探索并确定重组人碱性成纤维细胞生长因子的最佳酶解条件,建立酶解更完全、特异性更强的适用于重组人碱性成纤维细胞生长因子的HPLC肽图的分析方法尤为迫切。方法 采用蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法,以2M UA溶液作为酶解缓冲液,加入酶解比例蛋白质:酶w/w =20:1的Trypsin,于37 ℃酶解16 h终止反应。通过梯度洗脱,采用超高效液相色谱质谱对各色谱峰进行目标肽段的分离和鉴定。结论 重组人碱性成纤维细胞生长因子基本完全酶解,酶解时间为16 h,缩短了8 h,酶解比例为蛋白质:酶w/w =20:1,酶量大大减少,节约实验成本,酶解的完全性与有效性大幅提高,产生的10个特征峰重复率高,特征肽段理论塔板数大于2000,特征肽段与相邻峰之间的分离度大于1.2,且色谱图基线平稳。

重组人白细胞介素-11的胰蛋白酶切肽图分析

目的 建立标准肽图分析法 ,用于rhIL 11的质量控制。方法 应用AllianceHPLC系统及其温控自动进样器探索最佳胰蛋白酶切和色谱条件。结果 连续 3批rhIL 11样品的RP HPLC图谱完全一致 ,与rhIL 11对照品比较 ,有 2 0个峰与对照品吻合 ,但第 6峰的峰高和峰面积均明显较小 ,且在第 9和第 10峰之间多一个峰 ,说明rhIL 11样品蛋白质结构与对照品比较存在细小差别。这种差别经多肽片段分离和氨基酸序列测定证明是由于样品N端多 2个氨基酸引起的。结论 本法精确度高、重复性好、自动化程度高 ,可用于rhIL 11的质量控制。

重组人干扰素α1b质量肽图分析及二硫键定位

目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果:重组人干扰素α1b 的质谱测定相对分子质量为19382.50,与理论相对分子质量19382.18一致,其质量肽图中共发现16个匹配肽段,有3个理论酶切片段(单一氨基酸:Lys 135、Lys 165、Glu 166)未发现,氨基酸覆盖率为98.2%。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图,发现主要存在2种二硫键连接方式:Cys 29-Cys 139、Cys 86-Cys 99,同时还存在少量其他二硫键连接方式,如:C1-C99。结论:质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段,并可定位蛋白中的二硫键。

重组人GM-CSF的理化特性及其肽图的研究

rhGM-CSF在经过盐酸胍处理,DTT还原,碘乙酰胺封闭二硫键等各种状态下,分别分析其理化特性,发现经过DTT处理后其在紫外特征光谱和RP-HPLC行为上表现出不均一性,而在SDS-PAGE电泳行为和免疫学特性方面却没有明显差异,盐酸胍对其上述指标的影响是可逆的;经过打开二硫键,封闭巯基后的肽图分析比未经处理的样品溴化氰裂解更完全,蛋白酶消化更彻底。

应用胰蛋白酶裂解反相HPLC法分析rHuEPO肽图

胰蛋白酶降解rHuEPO后，用反相HPLC方法分析EPO降解后的产物（EPO肽图），HPLC色谱图显示了23个肽峰。发现同一单位研制的不同批制品肽图非常一致，并与美国Amgen公司的rHuEPO的肽图无论在峰数、峰型及保留时间上基本一致。该法具有重复性和重现性好，灵敏度高等特点，适用于rHuEPO肽图分析。

快速液相色谱在重组人胰岛素肽图分析中的应用

目的:探讨快速 HPLC 分析方法在重组人胰岛素肽图测定中的应用。方法:采用 Shimadzu Pack XR—ODS(3.0 mm×75mm,2.2 μm)色谱柱;流动相 A 为0.2 mol·L^(-1)硫酸盐缓冲液(pH 2.3)-乙腈(90:10),流动相 B 为乙腈-水(50:50),进行梯度洗脱。检测波长为214 nm;柱温50℃;流速0.8 mL·min^(-1)。结果:人胰岛素酶解样品的各个片段能够很好地分离,分析时间显著缩短。结论:本法简便、快速,经济,灵敏度高。可应用于重组人胰岛素肽图的测定。

液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图

目的用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11(rhIL-11)的肽图。方法用胰蛋白酶酶解rhIL-11,采用HPLC测定肽图,用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF/MS)技术分析肽段的精确相对分子质量,通过串联质谱(MS/MS)测定肽段的氨基酸序列。结果根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量及对其碰撞诱导解离质谱的解析结果,归属出肽图中各肽段所在的色谱峰,已检出肽段的总覆盖率为97%。结论液质联用研究肽图是验证和分析蛋白质结构的高效准确的方法。

高效液相色谱法测定脑活素注射液中的氨基酸含量及肽图分析

本文采用高效液相色谱法分析研究了进口药品脑活素注射液中的氨基酸含量及其低分子肽的肽图。试验结果反映了该药品的内在质量,同时提出控制质量的可靠方法.

重组人睫状神经营养因子肽图分析

建立重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rhCNTF)的肽图分析方法,用于rh-CNTF的质量控制。胰蛋白酶对rhCNTF进行酶切后,利用RP-HPLC方法对酶切液进行分析,以获得胰蛋白酶切最佳条件及色谱条件,并对连续3批样品进行分析。rhCNTF的胰蛋白酶最佳酶切条件为37℃酶切24h,以A(0.1%TFA-H2O)、B(0.1%TFA-CH3CN)为流动相,采用梯度洗脱的方法对酶切液进行分析,结果连续3批rhCNTF制备产品的肽图完全一致,且其检出峰数目与理论推测值相符。3批产品肽图的一致性为rhCNTF产品的结构同一性提供了有利证据,同时,建立了rhCNTF产品质量控制的一项指标。

重组人促卵泡激素(rhFSH)肽图分析方法研究

目的建立重组人促卵泡激素(rh-FSH)的标准肽图分析方法。方法通过超滤、透析、冷冻干燥法富集制备rh-FSH对照品。通过尿素变性、二硫苏糖醇(DTT)还原、碘乙酸酰基化制备供试品溶液。采用N型-糖苷酶F(PNGaseF)酶解去除rh-FSH糖侧链,经SDS-PAGE验证切糖结果后,用胰蛋白酶水解,酶解所得肽段通过RP-HPLC分析,得到rh-FSH肽图。结果利用国外原研厂rh-FSH制剂富集制备的rh-FSH结构完整,可用作rh-FSH肽图分析的对照品。国产样品的肽图谱与对照品一致。结论建立的肽图分析方法可作rh-FSH产品的结构确证。

降纤酶肽图分析

目的采用反相高效液相色谱法测定尖吻蝮蛇降纤酶和白眉蝮蛇降纤酶肽图。方法将降纤酶样品用胰蛋白酶水解,酶解所得的肽段通过反相高效液相色谱法进行分析,采用C18色谱柱,以0.1%三氟乙酸为A相,乙腈-水-三氟乙酸(90∶10∶0.1)为B相进行梯度洗脱得到降纤酶肽图。结果降纤酶各个肽段都能得到很好的分离,白眉蝮蛇降纤酶和尖吻蝮蛇降纤酶肽图存在显著差异。结论本法简便、快速,可应用于不同蛇种来源降纤酶的鉴别,以减少临床不良反应的发生。

血清多肽图技术建立子宫内膜异位症诊断模型

目的利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)技术分析血清多肽图,建立子宫内膜异位症(EMs)的血清诊断模型。方法采用MALDI-TOF技术和Clinprotools软件分析21例EMs血清和29例健康对照血清多肽图谱,建立诊断模型。用10例EMs血清和15例健康对照血清进行盲样验证。结果在m/z1000～10000的范围内共得到18个有统计学意义的差异多肽峰(P<0.01),表达上调的多肽有6个,下调的有12个,该模型盲样验证得到90.9%的敏感性和100%的特异性,准确率96.2%。结论可以利用MALDI-TOF-MS技术和Clinprotools软件来筛选子宫内膜异位症标记物。

乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化肽图的LC-MS验证

目的 验证乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化反相高效液相色谱 (RP HPLC)特征肽图的可信度。方法 采用液质联用的方法对胰蛋白消化后的多肽片断进行质量解析。结果 乙肝治疗性疏水肽的胰蛋白酶切片段与理论上计算值相符。结论 通过直接采用疏水肽悬液制作乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶RP HPLC肽图的方法切实可行。

用^(125)I标记肽图估计近年来流行的甲型流感病毒血凝素的变异率

将一种灵敏而简便的^(125)Ⅰ标记肽图分析方法用于估计近年来流行的5株甲1型和S株甲3型流感病毒血凝素(HA)的变异率。经计算这两种亚型病毒HA的年平均氨基酸变异率分别为0.47％和0.44％。但在1986年分离株与1985年分离株之间则有较大的变化,对HA的变异率与流行病学资料的关系进行了讨论。

阿胶肽图前处理胶原蛋白酶解条件研究

目的:建立标准化的阿胶蛋白酶解条件。方法:分别通过加热法、超声法及液氮碾磨法提取阿胶蛋白;通过二氯甲烷-环己烷萃取和超滤法纯化阿胶蛋白;采用序列分析级胰酶进行酶解,分别考察4个酶解参数(温度、时间、酶的剂量和pH值)对酶解结果的影响,通过Tricine-SDS-PAGE法检测酶解效果。结果:超声法溶解阿胶样品效果相对较好,酶解参数最佳条件为:酶解温度38℃,pH 8. 0,酶解时间12 h以上,底物与酶体积比在4:1~1:1范围内,计算酶活为0. 1~0. 4 mU (mg/μmol)。结论:建立了标准化的阿胶肽图前处理胶原蛋白胰酶酶解条件,为基于肽图谱法阿胶鉴别及质量控制方法的建立打下基础。

rUreB亚单位疫苗中试产品的纯度检测和肽图分析

分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗 (rUreB)中试产品的纯度 ,制备肽指纹图 ,证明rUreB三批中试产品在一级结构上的一致性和生产工艺稳定性。利用面积归一法检测产品的纯度 ,在非还原条件下用TPCK处理过的胰蛋白酶水解 3批中试产品 ,用反相HPLC制备分析肽图。结果显示 ,rUreB的 3批中试产品的纯度达到中试质量要求和肽图分析要求 ,3批中试产品的肽指纹图基本一致 ,重现性好。

血清多肽图技术在急性白血病微小残留病监测中的应用

微小残留病（Minimal residual disease,MRD）是急性白血病（acute leukemia,AL）复发的根源。目前尚缺乏一种无创、省时、灵敏度和特异性较高的血清学评价方法。我们利用磁珠分离和MALDI-TOF-MS检测的血清多肽图分析技术,对AL及健康者进行血清多肽的分析,

重组人纽表位肽12的胃蛋白酶切肽图分析方法的研究

采用反相高效液相色谱法建立重组人纽表位肽12的标准肽图分析法,固定相为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相A液0.1%TFA的水溶液,流动相B液0.1%TFA的乙腈溶液;梯度洗脱程序0～70min内B%由0%增至70%。结果3批重组人纽表位肽12样品的反相高效液相色谱图完全一致,与重组人纽表位肽12理化对照品的肽图比较,完全吻合,同时胃蛋白酶并不干扰肽图的测定,该法准确度高、重现性好,可用于重组人纽表位肽12的质量控制。

水合氧化钛固定化蛋白水解酶在蛋白质肽图分析上的应用

自1977年Cleveland等用数种蛋白水解酶水解两种蛋白,再用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行肽段比较以来。