过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

背景:课题组前期研究发现相较于野生型小鼠,线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm,PP2Cm)基因缺失小鼠明显发生肾功能衰竭的症状,因此推测PP2Cm可能在肾脏纤维化发展过程中发挥重要保护作用,然而其分子机制尚不明确。目的:探究PP2Cm基因对于人肾小管上皮细胞转录组的影响。方法:培养人肾小管上皮细胞,用质粒将PP2Cm基因转染进入人肾小管上皮细胞,荧光定量PCR实验和Western blot实验检测细胞中PP2Cm的表达,随后分别提取细胞RNA进行转录组测序,寻找转染组和对照组之间的差异性表达基因,利用生物信息学方法进一步对所得的差异基因进行GO分析和KEGG分析。结果与结论:通过测序分析,与未转染空白细胞相比,在转染PP2Cm基因的人肾小管上皮细胞中存在796个差异性表达基因,其中553个下调基因,243个上调基因,GO分析结果显示,上调表达的基因显著富集在细胞生物合成过程、蛋白质翻译、内在凋亡信号通路等;下调表达的基因显著富集在内皮细胞增殖、细胞黏附等信号通路;KEGG分析结果显示,显著上调表达的基因富集在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路;下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成等信号通路。结果表明,PP2Cm过表达可以影响肾小管上皮细胞的一系列生物学过程相关的多条信号通路,可能在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路中起重要作用。

TGF-β_(1)通过miR-21d-5p调控BMP7表达诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移

目的:探讨转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))可能通过微小RNA-21d-5p(miR-21d-5p)对骨形态发生蛋白7(BMP7)的调控,从而对肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的影响及可能机制。方法:观察TGF-β_(1)处理的肾小管上皮细胞HK-2并检测miR-21d-5p的表达,在HK-2细胞中分组转染miR-21d-5p或anti-miR-21d-5p,再使用TGF-β_(1)处理,观察过度表达或抑制表达miR-21d-5p对TGF-β_(1)诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。分析TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的靶向关系。共转染miR-21d-5p和pcDNA3.1-BMP7,或anti-miR-21d-5p和si-BMP7,使用TGF-β_(1)处理,评估TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的在肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的相互关系。结果:TGF-β_(1)处理HK-2细胞后,miR-21d-5p表达和迁移细胞数量升高(P<0.05),P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)水平降低(P<0.05)。过度表达miR-21d-5p增加TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移上调(P<0.05),降低P21和E-cadherin蛋白表达(P<0.05),过度表达BMP7可以逆转此过程。抑制miR-21d-5p降低TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移细胞水平(P<0.05),显著升高P21和E-cadherin蛋白水平(P<0.05),被抑制表达的BMP7可以逆转此过程。结论:TGF-β_(1)可能通过miR-21d-5p靶向调控BMP7表达,从而诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移,进一步影响肾脏纤维化进展。

滋肾丸对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞焦亡的影响

目的:探讨滋肾丸对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)焦亡的作用及机制。方法:MTT法筛选诱导及干预条件,高糖诱导HK-2细胞焦亡,分为高糖组、滋肾丸低、中、高剂量组和阳性对照组,另设空白组和高渗组。TUNEL染色评估细胞核损伤,LDH试验评估细胞膜损伤,Annexin V/PI双染检测细胞焦亡;ELISA检测细胞上清液中焦亡炎症因子;蛋白免疫印迹检测NLRP3炎症小体及焦亡炎症因子蛋白表达,RT-qPCR检测mRNA表达。结果:与高糖组比较,滋肾丸明显减轻高糖培养的HK-2细胞核及细胞膜损伤,显著降低焦亡水平,显著减少炎症因子释放以及蛋白及mRNA表达,不同程度降低NLRP3炎症小体蛋白及mRNA表达。结论:滋肾丸对高糖诱导的肾小管上皮细胞焦亡具有抑制作用,可能是其治疗早期糖尿病肾脏病的作用机制。

高尿酸血症激活肾小管上皮细胞NLRP3炎症小体的研究进展

高尿酸血症是CKD发生和发展的独立危险因素。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体在高尿酸血症诱导的肾小管上皮细胞损害中起到重要作用。兹对近年来高尿酸血症诱导的肾小管上皮细胞NLRP3炎症小体激活途径相关研究进行归纳总结,以期为高尿酸血症伴肾损伤的诊治及防治药物开发提供参考。

山柰酚通过改善肾小管上皮细胞的氧化应激与炎症反应减轻1型糖尿病小鼠肾损伤

背景糖尿病肾病是糖尿病最严重的并发症之一,长期高血糖会导致全身性的氧化应激和低度炎症状态。山柰酚是一种天然的黄酮类化合物,具有出众的抗炎和抗氧化的能力,可能会对糖尿病肾病的治疗有一定作用。目的研究山柰酚对糖尿病肾病小鼠肾损伤的治疗作用及其机制。方法18只6~8周龄FVB小鼠随机分为对照组、糖尿病模型组和山柰酚灌胃组,每组6只,并通过对模型组和山柰酚组腹腔注射链脲佐菌素构建1型糖尿病小鼠模型。模型建立后,治疗组灌胃山柰酚[70 mg/(kg·d)],对照组与模型组灌胃等量对照溶剂CMC-Na,16周后处死小鼠。病理染色观察小鼠肾病理损伤;qPCR和Western blot检测小鼠肾组织内炎症因子mRNA和氧化应激相关蛋白的表达;通过流式细胞术检测小鼠肾内巨噬细胞的数量和种类。体外建立高糖诱导肾小管上皮细胞(HK2)损伤模型,使用CCK-8试剂盒检测不同浓度山柰酚对HK2的活性影响,检测肾小管上皮细胞活性氧生成;qPCR和Western blot检测HK2内炎症因子mRNA和氧化应激相关蛋白以及炎症激活通路蛋白p38的表达。结果动物实验结果显示,与糖尿病模型组相比,经过灌胃山柰酚治疗后,肾病理损伤得到改善,肾小球系膜增生减少,足突融合减少;肾组织内白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α等炎症因子转录水平降低(P<0.01);NADPH氧化酶4表达降低(P<0.01);肾内炎性巨噬细胞数量减少,肾炎症微环境得到改善。细胞实验结果显示,山柰酚能够抑制高糖诱导下HK2的活性氧产生,改善氧化应激相关蛋白酶的表达(P<0.05);降低相关炎症因子mRNA的表达(P<0.01),且降低了p38的磷酸化(P<0.05)。结论山柰酚可能通过HO-1/p38通路减轻糖尿病肾小管上皮细胞炎症因子的分泌,增加相关氧化还原酶的表达,进而减轻糖尿病导致的肾损伤,保护肾功能。

近端肾小管上皮细胞代谢重编程在急性肾损伤中的研究进展

肾脏是一个高代谢器官,尤其是近端肾小管上皮细胞,在生理情况下主要依赖脂肪酸氧化供能,但是在急性肾损伤(AKI)期间,线粒体和过氧化物酶体功能障碍,近端肾小管上皮细胞发生代谢重编程,能量供应转向糖酵解,生成乳酸,并伴脂肪酸氧化紊乱及糖异生受损,短期内代谢重编程可能是对肾脏有益的能量代偿,但是该过程中也会加重肾损伤。本文就近端肾小管上皮细胞代谢重编程在AKI中的作用进行综述。

BCG感染巨噬细胞对肾小管上皮细胞损伤和修复的影响

目的:探讨肾结核发生过程中结核分枝杆菌BCG感染巨噬细胞对肾小管上皮细胞损伤和修复的影响。方法:Transwell建立BCG感染的M0型巨噬细胞(上室)与HK-2细胞(下室)共培养模型,100 ng/ml佛波酯(PMA)诱导THP-1人单核巨噬细胞24 h成为M0型巨噬细胞,建立BCG感染细胞模型,分别于感染12 h和24 h收集细胞总蛋白,Western blot检测M1型巨噬细胞标志物CD86及M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达,ELISA检测细胞培养上清中M1型巨噬细胞极化标志因子IL-6和TNF-α表达、M2型巨噬细胞极化标志因子TGF-β表达;实验分为HK-2组、BCG+HK-2组、BCG+M0+HK-2组及M0+HK-2组,CCK-8检测各组HK-2细胞活力,Hoechst实验检测各组HK-2细胞凋亡,蛋白免疫印迹检测各组HK-2细胞上皮细胞标志物E-cadhren及成纤维细胞标志物α-SMA等转分化指标表达。结果:BCG感染M0型巨噬细胞后,M1型巨噬细胞活力12 h高于24 h(P<0.05),M2型巨噬细胞活力24 h高于12 h(P<0.05);BCG感染的巨噬细胞与HK-2细胞共培养后,HK-2细胞活力24 h高于12 h(P<0.001),凋亡水平12 h高于24 h,上皮细胞标志蛋白E-cadherin蛋白水平24 h高于12 h(P<0.001),成纤维细胞标志蛋白α-SMA蛋白水平12 h高于24 h(P<0.01)。结论:肾结核发生发展过程中,早期BCG感染巨噬细胞可能通过M1型极化促进肾小管上皮细胞炎症损伤;随着感染时间延长,可能通过M2型极化修复肾小管上皮细胞损伤,发挥保护作用。

扶正化瘀方对马兜铃酸Ⅰ诱导肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨扶正化瘀方对马兜铃酸Ⅰ诱导的肾小管上皮细胞HK-2损伤的保护作用。方法以不同浓度马兜铃酸Ⅰ孵育HK-2细胞24 h,确定最佳造模浓度。HK-2细胞分为正常组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组及扶正化瘀方低、高剂量组,模型组以400μmol/L马兜铃酸Ⅰ分别孵育6、12、24 h,扶正化瘀方低、高剂量组及N-乙酰半胱氨酸组分别以100、200μg/mL扶正化瘀方浸膏粉及5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸孵育24 h。CCK8法检测细胞活力,试剂盒测定细胞上清LDH活性,RT-qPCR法检测fos mRNA表达,免疫荧光法检测细胞FOS蛋白表达,Western blot法检测细胞FOS、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、IL-1β蛋白表达。结果HK-2细胞活力随着马兜铃酸Ⅰ处理时间延长而降低,细胞损伤逐渐加重(P<0.01)。与溶剂对照组比较,马兜铃酸Ⅰ作用后HK-2细胞fos mRNA表达及FOS、p-JNK、p-ERK、IL-1β蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,扶正化瘀方各剂量组和N-乙酰半胱氨酸组细胞活力升高(P<0.05,P<0.01),fos mRNA表达及FOS、p-JNK、p-ERK蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),JNK、ERK蛋白表达无明显变化(P>0.05);扶正化瘀方高剂量组和N-乙酰半胱氨酸组细胞IL-1β表达降低(P<0.01)。结论扶正化瘀方可通过抑制FOS及p-JNK、p-ERK蛋白表达,抑制炎症因子释放,从而改善马兜铃酸Ⅰ诱导的HK-2细胞损伤。

山松醇同源物1在缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制研究

目的探究山松醇同源物1(pumilio homolog 1,PUM1)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxy-genatio,H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)损伤中的作用及机制。方法体外建立HK-2细胞的H/R模型;通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低HK-2细胞的PUM1表达;细胞等量随机法分为对照(Control)组、H/R组、H/R+siRNA组。蛋白质印迹法用以检测PUM1蛋白表达水平;细胞计数试剂盒8用以检测细胞活力;过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)评估氧化应激水平;流式细胞术用以检测细胞凋亡水平。结果与Control组相比,H/R 3 h组(1.76±0.11比0.98±0.05)、H/R 6 h组(2.89±0.14比0.98±0.05)、H/R 12 h组(3.78±0.08比0.98±0.05)PUM1的蛋白表达水平随着缺氧时间的延长逐渐增高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+si-PUM1组敲低PUM1的表达能够显著改善H/R后HK-2细胞的细胞活力(73.67±3.42比29.60±2.94)、氧化应激[H_(2)O_(2):(13.53±0.85)μmol/L比(22.43±1.12)μmol/L、MDA:(16.03±0.70)μmol/L比(31.20±1.50)μmol/L、SOD:(34670±1800)U/L比(5730±1220)U/L]及凋亡水平[(14.89±1.65)%比(39.71±1.94)%](均P<0.05)。结论PUM1在H/R诱导的HK-2细胞中上调,抑制PUM1的表达可以减少氧化应激及细胞凋亡水平,从而减轻H/R损伤。

tRF-1:30对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性因子表达的影响

目的探讨tRF-1:30(tRF-1:30-Gln-CTG-4)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)中炎性因子表达的影响及分子机制。方法将小鼠RTECs分为Control组、HG组、HG+tRF-1:30 mimic组、HG+tRF-1:30 NC组、HG+si-IKZF2组(IKAROS家族锌指2,tRF-1:30抑制剂)、HG+si-NC组。实时荧光定量PCR检测tRF-1:30、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IKZF2 mRNA的水平。酶联免疫吸附试验检测炎性因子水平,Western blot检测IKZF2蛋白表达水平,双萤光素酶报告实验验证tRF-1:30和IKZF2的关系。结果在HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平显著升高,而tRF-1:30表达水平显著降低。过表达tRF-1:30显著降低HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平。IKZF2在HG诱导的RTECs中显著高表达,进一步敲低IKZF2可抑制炎性因子的释放,而过表达tRF-1:30后IKZF2的表达水平下调。双萤光素酶报告实验进一步验证tRF-1:30与IKZF2可能存在靶向关系。结论过表达tRF-1:30可能通过负向调控IKZF2的表达进而抑制HG诱导的RTECs炎性因子的释放。

糖尿病肾病大鼠原代肾小管上皮细胞的提取及体外培养

目的探讨糖尿病肾病(DN)大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)的提取及体外培养方法。方法取SD雄性大鼠25只,随机分为正常组(n=5)和模型组(n=20)。对模型组大鼠构建DN大鼠模型,不给予正常组任何处理。获取两组大鼠双肾组织,一部分组织用于HE染色及Masson染色以观察肾组织结构,另一部分用于RTECs的提取及培养。RTECs的提取、培养方法:将肾皮质组织在80目筛网上研磨,经100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min后,使用含10%胎牛血清、1%胰岛素⁃转铁蛋白⁃硒⁃乙醇胺添加剂和1%青链霉素双抗溶液的DMEM/F-12完全培养基培养细胞。用免疫荧光染色法检测细胞角蛋白18的表达情况以鉴定所获得的细胞。结果(1)建模后模型组大鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降、血糖升高等特征,尿蛋白定性呈阳性,肾组织病理检测提示肾小球结构不完整且出现明显缺损,RTECs明显肿胀、变性,肾小管管腔萎缩,肾小管间质纤维化严重。(2)培养72 h后,两组RTECs均已经贴壁并呈岛屿状聚集生长,培养5~8 d后细胞呈多边鹅卵石样。模型组RTECs高表达细胞角蛋白18,阳性率>95%。结论采用在80目筛网上研磨、100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min的方法可以得到数量较多、活性良好、纯度较高的DN大鼠模型RTECs,且在形态与贴壁情况方面与正常大鼠RTECs无明显差异。

富硒黄芪多糖对STZ诱导的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:观察富硒黄芪多糖对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法:将50只STZ诱导的SPF级雄性糖尿病大鼠随机分为模型组、吡格列酮组和富硒黄芪多糖低、中、高剂量组,每组10只,正常组10只大鼠不进行造模。富硒黄芪多糖低、中、高剂量组按100、200、400 mg/kg灌胃,正常组及模型组灌胃等体积生理盐水,吡格列酮组按10 mg/kg灌胃吡格列酮。每天灌胃1次,连续干预4周。造模前及造模后第0、2、4周记录各组大鼠一般状况、检测尿微量白蛋白(urinary albumin,UAlb)和血糖。干预结束后,采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)观察各组大鼠肾脏组织形态学变化情况;测定各组大鼠血清肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血尿酸(uric acid,UA)表达水平;荧光定量PCR检测各组大鼠肾组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白(Fibronectin,FN)mRNA表达水平;免疫组化法(immunocytochemistry,IHC)检测各组大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达。结果:与模型组比较,富硒黄芪多糖中、高剂量组及吡格列酮组大鼠血糖、24 h UAlb于造模后第2周明显下降(P<0.05),血清SCr、BUN及UA表达降低(P<0.05),富硒黄芪多糖高剂量组及吡格列酮组大鼠肾组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、FN表达均降低(P<0.05),E-cadherin表达升高(P<0.05),富硒黄芪多糖低、中、高剂量组及吡格列酮组大鼠肾组织中α-SMA表达下降(P<0.01),肾小球数量增多,细胞外基质减少;与吡格列酮组比较,黄芪多糖高剂量组大鼠24 h Ualb、血清SCr、BUN、UA水平及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、FN表达水平、E-cadherin和α-SMA蛋白表达变化均不明显(P>0.05),肾小球数量减少,细胞外基质减少。结论:富硒黄芪多糖可降低STZ诱导的糖尿病大鼠血糖,具有抑制糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用。

穿心莲内酯减轻脂多糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡机制

目的探讨穿心莲内酯(AG)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症肾小管上皮细胞(HK-2细胞)铁死亡的影响及其作用机制。方法采用LPS处理HK-2细胞,模拟脓毒症HK-2损伤体外模型,进一步用5、10、20、40μmol/L的AG进行干预,将细胞随机分为对照组(Control)、LPS组、LPS+二甲亚砜(DMSO)组、AG组。采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出最适LPS和AG浓度;比较各组中细胞形态变化,肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子-1(KIM-1)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,以及铁死亡调控蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁蛋白(Ferritin)的表达水平,评估AG处理对细胞的保护作用。结果与Control组相比,10μg/mL LPS诱导的HK-2细胞中细胞活力及GSH含量下降,细胞皱缩、贴壁能力差,氧化产物MDA和ROS含量以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平明显升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,Ferritin蛋白表达水平增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而在使用AG干预后,与LPS组相比,细胞活力升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高,而Ferritin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);MDA含量和ROS荧光强度以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AG对LPS诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用,其机制可能是激活SLC7A11/GPX4通路,减少氧化应激,上调抗氧化酶活性,减轻细胞铁死亡。

线粒体未折叠蛋白反应在棕榈酸诱导肾小管上皮细胞脂质聚集中的作用

目的探讨线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,UPR^(mt))对肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2)脂代谢的影响。方法采用棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导HK-2细胞内脂质聚集,分别予siRNA抑制UPR^(mt)或巴多索隆(the 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid,CDDO)增强UPR^(mt)。油红染色观察细胞内脂质聚集情况,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),Mito-SOX测定线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,Western blotting检测HSP60、LONP1、CLPP、ACOX1、PPARα、PGC1α、CPT1α蛋白表达。结果PA诱导HK-2细胞脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多及UPR^(mt)关键蛋白HSP60、LONP1表达降低;抑制UPR^(mt)可加剧PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多,HSP60、LONP1表达进一步降低;增强UPR^(mt)可缓解PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多以及HSP60、LONP1表达降低。结论PA诱导的HK-2细胞脂质聚集可能与线粒体功能障碍有关,UPR^(mt)在该过程中对HK-2细胞具有保护作用。

微小RNA-26a通过抑制铁死亡减少高糖诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质合成

目的 探究微小RNA-26a(miR-26a)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)细胞外基质(ECM)合成的作用及可能机制。方法 通过HG诱导RTECs以构建糖尿病肾病(DKD)模型,在HG诱导的RTECs中过表达miR-26a,使用RT-qPCR和Western blot检测ECM合成及铁死亡相关指标以评估miR-26a对HG诱导的RTECs中ECM合成及铁死亡的作用。使用ferrostatin(Fer-1)抑制DKD模型中铁死亡的发生并进一步评估其对ECM合成的影响。RT-qPCR和Western blot检测铁死亡的相关指标,荧光显微镜观察活性氧(ROS)荧光强度。结果 与Control相比,HG组细胞中miR-26a表达量降低,ECM合成相关指标fibronectin和collagenⅠ表达量升高,过表达miR-26a后,与HG组相比,HG+miR-26a组细胞miR-26a表达量升高,fibronectin和collagenⅠ表达量降低。在铁死亡方面,与Control组相比,HG组SLC7A11和GPX4的蛋白和mRNA表达量降低,TFR-1和ACSL4表达量升高,ROS荧光强度增强。抑制铁死亡后,HG+Fer-1组铁死亡及ECM合成相关指标表达水平较HG组均改变。再次过表达miR-26a后,HG+miR-26a组铁死亡相关指标表达水平较HG组均变化,ROS荧光强度降低。结论 在HG诱导的RTECs中,miR-26a抑制铁死亡的发生进而减少ECM合成。

四肽重复结构域36(TTC36)通过增强IκBα的表达抑制NF-κB信号通路的激活抑制HK2人肾小管上皮细胞的炎症反应

目的研究四肽重复结构域(TTC36)对HK2人肾小管上皮细胞损伤的影响及潜在的机制。方法采用慢病毒感染法建立过表达TTC36的HK2稳转细胞系,转入空载质粒CMV-Flag作为对照。实时荧光定量PCR检测HK2细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)、CC趋化因子配体2(CCL2)、IL-1β以及核因子κB抑制物α(IκBα)、核因子κB p65(NF-κB p65)的mRNA水平。流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖。Western blot法检测iNOS、TNF-α、胱天蛋白酶3(caspase-3)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、增殖细胞核抗原(PCNA)、闭锁小带1(ZO-1)、核因子κB(NF-κB)信号通路中IκBα、NF-κB p65、磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白表达。放线菌酮(CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,Western blot法检测IκBα的蛋白表达量。结果与对照组相比,HK2细胞过表达TTC36后,炎症介质表达减少;细胞凋亡率降低以及c-caspase-3、BAX表达减弱;细胞增殖加快,PCNA和ZO-1的表达增强;IκBα表达上调,NF-κB p65、p-NF-κB p65表达下调,胞质和胞核中的NF-κB p65表达量均减少。CHX处理后过表达TTC36延长IκBα的半衰期,而MG132可恢复过表达TTC36带来的IκBα的变化。结论过表达TTC36抑制HK2细胞的炎症反应,减少细胞凋亡,促进增殖,加强紧密连接,其机制可能是通过增强IκBα的表达抑制NF-κB信号通路的激活从而减轻炎症反应带来的细胞损伤。

银杏内酯B调控miR-155-5p对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨银杏内酯B(GB)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞凋亡及炎症因子的影响及其可能作用机制。方法:采用HG诱导人肾小管上皮细胞HK-2建立细胞损伤模型,不同剂量的GB处理HK-2细胞,并将anti-miR-NC、anti-miR-155-5p分别转染至HK-2细胞后加入25 mmol/L葡萄糖处理24 h,将miR-NC、miR-155-5p mimics分别转染至HK-2细胞后加入100μmol/L GB与25 mmol/L葡萄糖共同处理24 h;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测炎症因子IL-6、TNF-α的水平;RT-qPCR法检测miR-155-5p的表达量;Western blot检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)蛋白表达水平。结果:GB处理后,高糖诱导的HK-2细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、miR-155-5p表达量和Bax蛋白表达水平均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;转染anti-miR-155-5p后,高糖诱导的HK-2细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、miR-155-5p表达量和Bax蛋白表达水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05);转染miR-155-5p mimics可减弱GB对HG诱导的HK-2细胞凋亡及炎症因子表达的影响。结论:GB可通过抑制细胞凋亡及炎症因子表达来减轻HG诱导的肾小管上皮细胞损伤,其作用机制可能与抑制miR-155-5p表达有关。

川芎嗪对脂多糖处理大鼠肾小管上皮细胞S1PR3的抑制作用

目的探讨川芎嗪对脂多糖(LPS)处理大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR)3的影响以及S1PR3在脓毒症相关急性肾损伤(S-AKI)中的作用及机制。方法将培养好的大鼠NRK-52E细胞分为对照组、LPS组、川芎嗪+LPS组。对照组不予处理;LPS组予川芎嗪等量0.9%氯化钠溶液预处理30 min后,予LPS 20μg/mL刺激12 h后离心收集细胞待检;川芎嗪+LPS组先用川芎嗪200 ng/mL预处理30 min后再予LPS 20μg/mL刺激12 h后离心收集细胞待检。采用流式细胞术检测3组细胞凋亡率及钙离子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的差异,ELISA法检测钙蛋白酶(Calpain)1、Calpain 2表达的差异,Western blot法检测各组细胞中S1PR3表达的差异。结果经LPS处理后脓毒症NRK-52E细胞模型成功建立。与对照组比较,LPS组的细胞凋亡率、钙离子表达、Caspase-3表达、S1PR3表达、Calpain 1、Calpain 2表达均明显增加(均P<0.01);与LPS组比较,川芎嗪+LPS组的细胞凋亡率、钙离子表达、Caspase-3表达、S1PR3表达、Calpain 1、Calpain 2表达均明显下降(均P<0.05)。结论川芎嗪可以抑制S1PR3的表达,能够降低肾小管上皮细胞内的钙离子浓度,从而抑制Caspase-3细胞凋亡信号通路,减少肾小管细胞凋亡。S1PR3可能在S-AKI的发生、发展中起到重要作用。

Smad4慢病毒转染对万古霉素诱导的肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:探究慢病毒介导过表达Smad4或沉默Smad4对万古霉素诱导的肾小管上皮细胞HK-2上皮间质转化(EMT)的影响。方法:设计并包装Smad4沉默或过表达的慢病毒,之后利用所获得的慢病毒瞬时转染HK-2,将HK-2细胞分为万古霉素组、空载体组(转染HBLV-GFP-PURO)、过表达Smad4组(转染HBLV-h-Smad4-GFP-PURO)、沉默Smad4组(转染HBLV-h-Smad4-shRNA-GFP-PURO),另取正常HK-2细胞作为对照组。比较五组细胞迁移能力、上清液中氧化应激指标(TGF-β_(1)、SOD、GSH、MDA)及Smad4、E-cadherin、FN、Vimentin蛋白表达水平。结果:与对照组相比,万古霉素组和空载体组HK-2细胞迁移能力、上清液TGF-β_(1)和MDA含量、Smad4、FN、Vimentin蛋白表达水平升高(P<0.05),SOD、GSH含量、E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达Smad4可提高HK-2细胞迁移能力和氧化应激反应,促进EMT(P<0.05);沉默Smad4可降低HK-2细胞迁移能力和氧化应激反应,抑制EMT(P<0.05)。结论:Smad4调控万古霉素诱导的HK-2细胞氧化应激反应和EMT。

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,LC3及Beclin1的mRNA表达量同时也明显降低。结论:RIPC分离液对HK-2细胞H/R后损伤具有保护作用,作用机制可能与线粒体自噬相关。