肿瘤抗原MAGE-3HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 3的 HL A- A2限制性 CTL 表位。方法以肿瘤特异性抗原 MAGE- 3为研究目标 ,采用基序方案和二级锚点相结合的 CTL 表位预测方法。结果预测出了 MAGE- 3的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位。结论所预测出的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位经后续实验筛选、鉴定后 ,可用于基于 MAGE-

肿瘤抗原MAGE-3CTL预测表位的计算机分子模拟研究

目的 从理论上分析预测表位与HLA A2分子的结合情况及其为HLA A2限制性CTL表位的可能性。方法 应用计算机分子模拟的方法 ,建立MAGE 3 4个CTL预测表位的HLA A2结合三维结构和各多肽与HLA A2分子所形成复合物的三维结构。结果 4个预测表位的三维结构完全符合HLA A2限制性CTL表位的结构要求 ,且都能与HLA A2分子结合。结论 4个CTL预测表位为HLA

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。

肿瘤抗原MAGE-3表达研究进展

黑色素瘤抗原-1(melanoma antigen-1，MAGE-1)是由van der Bruggen等于1991年在研究恶性黑色素瘤时发现的人类第一个肿瘤特异性抗原，以后逐渐发现了更多MAGE抗原，现已形成拥有24个结构上相似的基因成员的家族。肿瘤抗原MAGE-3(又名MAGE—A3)是1994年Gaugler等从恶性黑色素瘤中分离出来并进行了鉴定，由两小一大3个外显子(exon)组成，和MAGE-1一样，氨基酸编码序列全部位于第三外显子,

人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察

目的通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达;将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后,采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HLA-A*0201转基因小鼠,LDH方法检测CTL活性。结果酶切结果证实,成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体,并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达,原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫,镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后,可成功地诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性。结论成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原,为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的 克隆肿瘤特异性共享抗原mage 3基因 ,制备基于α 病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法 用RT PCR方法从黑色素瘤细胞系LB3 73中制备mage 3基因 ,以含α 病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体 ,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage 3蛋白的表达。结果 正确构建了mage 3 pSMART2a重组质粒 ,并且在转化此质粒的 2 93细胞中检测出了mage 3蛋白的表达。结论 此重组mage 3 pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗 ,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。

肿瘤抗原MAGE-A3新的HLA-A2限制性CTL表位的发现与鉴定

目的:鉴定肿瘤抗原MAGE－A3新的HLA-A2限制性CTL表位。方法:采用CTL表位预测的基序法与二级锚点相结合预测 MAGE-A3的 HLA-A2限制性CTL表位;用计算机分子模拟进行表位的初步筛选;以标准51Cr释放试验检测特异性CTLs诱导活性。结果:在所筛选的4个候选CTL表位中,MAGE-A3201-209可在体外有效诱导特异性CTLs的产生,杀伤靶细胞。结论:MAGE-A3201-209为肿瘤抗原MAGE-A3的新的HLA-A2限制性CTL表位。为基于MAGE-A3的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计、研究奠定了基础。

肿瘤抗原MAGE-A3研究进展

肿瘤抗原MAGE A3为肿瘤共同抗原 ,广泛表达于多种组织类型的肿瘤细胞 ,而在正常组织细胞 (除睾丸和胎盘外 )却不表达。该抗原不仅能被HLAⅠ类分子呈递 ,而且能被HLAⅡ类分子呈递。MAGE A3抗原已被广泛应用于肿瘤治疗性疫苗的研究。

肿瘤相关抗原MAGE-A3的研究进展

肿瘤相关抗原MAGE-A3广泛表达于多种恶性肿瘤,而在正常组织中(除睾丸和胎盘外)不表达。该抗原经抗原递呈细胞加工后能被HLA I类或II类分子递呈,引起针对MAGE-A3表达阳性的肿瘤细胞的特异性免疫。近年来,MAGE-A3抗原已被广泛应用于肿瘤的诊断和免疫治疗,本文就MAGE-A3抗原在肿瘤中应用做一综述。

负载MAGE-A3抗原的树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响

目的:探究负载黑色素瘤相关抗原基因A3(MAGE-A3)的树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)对子宫内膜癌肿瘤干细胞及恶性进展的影响。方法:采集人外周血分离单个核细胞,利用细胞因子分别诱导生成DC和CIK;MAGE-A3孵育DC后与CIK共培养,流式细胞仪检测DC-CIK、MAGE-A3-DC-CIK的表型;流式细胞仪分选子宫内膜癌细胞系Ishikawa的CD133^(+)干细胞,以子宫内膜癌干细胞作为靶细胞,分别以CIK、DC-CIK及MAGE-A3-DC-CIK作为效应细胞,MTT法检测效靶比为10∶1、20∶1、40∶1的细胞杀伤活性,ELISA法检测联合培养细胞上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17水平,Annexin V-FITC/PI双染法检测子宫内膜癌干细胞凋亡;建立子宫内膜癌干细胞移植瘤裸鼠模型,尾静脉注射DC-CIK或MAGE-A3-DC-CIK,观察裸鼠肿瘤生长情况,每隔2 d测量瘤体大小,21 d后取肿瘤组织,电子天平称重,HE染色观察肿瘤组织病理形态学变化,免疫组织化学染色检测肿瘤组织内Ki-67表达。结果:分离获得细胞表面CD80、CD86、HLA-DR表达分别达到88%、86%和90%的DC;MAGE-A3-DC-CIK组细胞表面CD8^(+)CD3^(+)、CD56^(+)CD3^(+)比例均高于DC-CIK组(P<0.01);经磁珠分选后获得CD133^(+)细胞比例高达90.23%的子宫内膜癌干细胞;与CIK组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组在不同效靶比下对子宫内膜癌干细胞的杀伤能力升高,细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-12及IL-17的分泌水平升高,培养液上清处理的子宫内膜癌干细胞凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01);同时,与对照组和DC-CIK组比较,MAGE-A3-DC-CIK组移植瘤裸鼠的肿瘤体积小,肿瘤重量轻,肿瘤组织内细胞稀疏,Ki-67阳性细胞率减小,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:负载MAGE-A3的DC与CIK联合培养能促进CIK成熟,提高对子宫内膜癌干细胞的杀伤性,并抑制移植瘤裸鼠的恶性进展。

肿瘤-睾丸抗原MAGE-1、MAGE-3、SSX-2及NY-ESO-1在胃癌中的表达

目的 检测肿瘤 睾丸 (cancer testis ,CT)抗原MAGE 1、MAGE 3、NY ESO l及SSX 2基因mRNA在胃癌组织中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法对胃癌患者癌组织、相应癌旁组织和对照组织(慢性胃炎和正常胃组织 )中的MAGE 1、MAGE 3、NY ESO 1及SSX 2基因mRNA进行检测 ,结合临床指标进行分析 ,随机选取RT PCR阳性扩增产物进行序列测定。结果 在在检测的 5 0例胃癌组织中 ,MAGE 1、MAGE 3、NY ESO 1及SSX 2基因mRNA阳性率分别是 48% (2 4/5 0 )、42 % % (2 1/5 0 )、11% (6/5 0 )和 8% (4 /5 0 ) ;多个CT抗原基因mRNA在胃癌中同时表达 ,至少表达一种CT抗原者达76% (3 8/5 0 ) ,表达两种或两种以上者为 40 % (2 0 /5 0 ) ,表达三种或三种以上者为 10 % (5 /5 0 ) ,同时表达四种者为 6% (3 /5 0 )。而相应的癌旁组织和对照组织中均未检测到四种目的基因的表达。DNA测序结果表明RT PCR产物确为这四种基因的目的片段。MAGE 1、MAGE 3、NY ESO 1及SSX 2基因的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、浸润深度和淋巴结转移等无显著相关性 (P >0 .0 5 )。结论 CT抗原 (MAGE 1、MAGE 3、NY ESO 1及SSX 2 )基因在胃癌组织中呈高特异表达 。

针对MAGE-3抗原的DC肿瘤疫苗的研究进展

树突状细胞(dendritic cell,DC)作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞,广泛分布于各种组织器官中,在激活肿瘤特异性免疫中发挥重要作用。黑素瘤相关抗原3(melanoma-associated antigen 3,MAGE-3)是一种肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA),属于黑素瘤相关抗原家族(melanoma-associated antigen family,MAGE family),在上皮细胞来源的多种肿瘤细胞表面都有不同程度的表达。MAGE家族类肿瘤表面标志物能被用于早期发现肿瘤细胞,并针对该类抗原进行特异性的免疫治疗,是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。由于DC能将肿瘤相关性抗原提呈给T淋巴细胞,产生抗原特异性免疫反应,因此DC肿瘤疫苗为肿瘤免疫治疗提供了一种有效手段。目前,针对MAGE-3抗原的DC肿瘤疫苗研究已经广泛开展,可以通过多种不同的方式将MAGE-3负载DC,并取得了一定的临床疗效,为DC肿瘤疫苗的临床应用带来了曙光。

肿瘤抗原MAGE-12的表位及二级结构预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构、B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL表位。方法用 Garnier- Robson和 Chou- Fasman方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构 ;用 Kyte- Doolittle亲水方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位 ;用简单基序 ( simple motifs)和延展基序 ( extended m otifs)对肿瘤抗原 MAGE- 12的 HL A-A2限制性 CTL 表位进行预测。结果 MAGE- 12可能含有较多的 α-螺旋 ;B细胞识别的表位可能在 82～ 93残基 ( QSDEGSS-NEEQE)或附近和 3～ 14残基 ( L EQRSQHCKPEE)或附近 ;发现 1个 HL A- A2限制性 CTL 表位为 FL WGPRAL V( 2 71～2 79)。结论用亲水性方案和基序法预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL 表位 ,为实验方法探索 MAGE- 12的表位提供有用线索。

肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位4分支多重抗原肽的合成及鉴定

目的 设计合成肿瘤抗原MAGE 12的B细胞表位抗原肽并对其进行鉴定。方法 在预测MAGE 12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82 -93 )的基础上 ,采用 4分支多重抗原肽结构合成抗原肽 ,免疫C 5 7BL 6小鼠 ,产生多克隆抗体 ,应用ELISA实验及免疫组化实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。结果 免疫C 5 7BL 6小鼠后可产生MAGE 12的抗原特异性的多克隆抗体 ,抗体滴度可达 1∶64。结论 证明所预测的表位为MAGE 12的B细胞表位。

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的克隆MAGE-3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况；重组表达MAGE-1和MAGE-3抗原，用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究。方法RT-PCR法检测了MAGE-3在人食管癌组织中的表达情况。采 用DNA重组技术将MAGE-1和MAGE-3全长cDNA 克隆至pET30a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 和 wes-tern blot鉴定后，制备其可溶性蛋白，研究其对人T细胞增殖能力的影响。结果MAGE-3基因 在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）；在30例相应癌旁正常组织中未见表达。成功获得了MAGE-1和MAGE-3可溶性蛋白；人 T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE-1和MAGE-3蛋白产生应答。结论MAGE-1和MAGE-3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原。

肿瘤抗原MAGE-2 HLA-A2限制性新CTL表位的鉴定

目的 寻求新的HLA A2限制性肿瘤抗原MAGE 2CTL表位。方法 经超基序与量化基序相结合预测的肿瘤抗原MA GE 2的 4个表位作为研究对象 ,标准的51 Cr实验与肽结合实验相结合进行验证。结果 预测表位肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8,MAGE 2 2 71 2 79经体外刺激PBMC后可有效的诱导CTL效应产生 ,当效 靶为 10 0∶1时溶破靶细胞效率分别为 74 4% ,68 2 %。HLA A2分子亲和力分析 ,荧光系数分别为 0 61、0 2 4阳性肽荧光系数为 0 79。结论 多肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8、MAGE 2 2 71 2 79可作为新的HLA A2限制性CTL表位。

肿瘤抗原MAGE-2多抗原肽疫苗的设计合成及免疫原性研究

目的 采用多抗原肽 (multipleantigenpeptide ,MAP)设计方案 ,提高线性短肽的免疫原性。方法 对肿瘤抗原MAGE 2 2 2 0 2 2 8细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行分子修饰 ,设计、合成四分支多抗原肽 (MAP4)。标准Fmoc合成方案进行合成 ,液相色谱 质谱联用 (LC MS)进行目的肽鉴定。以体外刺激人外周血单核细胞 (PBMC)诱导CTL效应及IFN γ分泌 ,标准 51 Cr释放实验与Elispot实验进行免疫原性的研究。结果 标经准 51 Cr释放实验验证 ,低浓度的MAP4可以诱导出有效的CTL效应 ,Elispot实验显示MAP4能够有效诱导的IFN γ分泌。结论 MAP的构建能够增强CTL效应和IFN γ的分泌 。

肿瘤抗原MAGE3预测CTL表位的合成与鉴定

目的 合成并鉴定已预测出的 4个MAGE 3HLA A2限制性CTL表位多肽 ,为后续研究奠定基础。方法 采用固相合成法合成多肽 ,经RP HPLC纯化、纯度分析 ,用质谱进行定性鉴定。结果 4个合成肽的纯度都在 95 %以上 ,经质谱分析 ,各肽的分子量测定值与理论值相符。结论 所得多肽为高纯度的目标肽 。

肿瘤抗原MAGE-12新的HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测

目的 预测黑色素瘤抗原MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位。方法 采用SYFPEITHI超基序远程预测系统与量化基序多项式法、延展基序联合应用,筛选MAGE-12抗原HLA-A0201限制性CTL表位。结果 共预测出5个MAGE-12抗原HLA-A2限制性CTL表位。结论 超基序法与量化基序,延展基序联合应用可以提高预测效率,为实验方法探索MAGE-12的表位提供有用线索。

FBL-3肿瘤抗原的研究:Ⅱ.从多肽池中分析肿瘤抗原

在抗肿瘤免疫效应中细胞毒T淋巴细胞(CTL)是通过识别肿瘤细胞MHC I类分子结合的肿瘤源性多肽.为分析肿瘤细胞的抗原性及肿瘤抗原的多肽性质,本文选用FBL-3肿瘤细胞,用pH3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液间隔24～36小时多次酸洗肿瘤细胞,以获得MHC I类分子结合的多肽,并分析酸洗液中多肽混合物的肿瘤抗原性,以及RP-HPLC分离的部分收集液多肽的肿瘤抗原性,为FBL-3肿瘤细胞抗原的确定提供基本数据.结果表明:酸洗法能有效获得肿瘤细胞MHC I类分子相关的多肽抗原,肿瘤细胞多肽抗原的分离、纯化、HPLC分析以及抗原性鉴定是肿瘤抗原性确定的一个重要方法.