人胎儿真皮间充质干细胞对人恶性黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用观察

目的 观察人胎儿真皮间充质干细胞(FDMSCs)对人恶性黑色素瘤细胞(A375细胞)增殖、迁移、侵袭的抑制作用。方法 通过酶消化法从16~20孕周的人意外流产健康胎儿的背部皮肤中提取FDMSCs,并进行鉴定。选取A375细胞并分为3组,F-CM组加入FDMSCs条件培养基,A-CM组加入成人真皮成纤维细胞条件培养基,Control组加入DMEM低糖空白培养基,利用CCK-8细胞增殖实验、划痕细胞迁移实验、细胞侵袭实验测算各组细胞相对活力、细胞迁移率、侵袭细胞数。结果 FDMSCs可以从人胎儿皮肤中成功提取并体外培养,阳性表达间充质干细胞(MSCs)特异性标记CD44、CD90、CD105及胚胎组织特异性标记SSEA-4、OCT-4,且具备成脂、成骨、成软骨的多向分化能力。与Control组比较,F-CM组细胞相对活力下降,细胞迁移率低,侵袭细胞数少(P均<0.05)。结论 FDMSCs可抑制A375细胞的增殖、迁移和侵袭。

免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的实验研究

目的探讨免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的可行性。方法采用免疫磁珠细胞分选法去除羊水细胞中CD44和SSEA4阳性细胞，使OCT-4阳性胎儿干细胞间接得到分离，体外培养扩增后，观察细胞生长特性，免疫荧光染色计算OCT-4阳性胎儿干细胞得率，Real—TimePCR比较分离前后OCT-4表达量的差异，免疫组化检测NANOG、AKP、MAP-2、NGFR和Myosin等细胞因子的表达。结果经免疫磁珠分离的细胞接种12h内贴壁生长，形态呈梭形，部分呈多角形．融合后形成辐射状排列。免疫荧光染色OCT-4阳性细胞得率为（90．15±8．25）％，Real—TimePCR检测结果显示分离后细胞OCT-4的表达量较未分离细胞和M义有显著性差异（P〈0．01）。原代培养可获得（1～2）×10^7个细胞，3代可获得（2～4）×10^8个细胞．传至10代以后细胞的增殖能力下降。免疫组化结果显示OCT-4阳性胎儿干细胞表达NANOG、AKP、MAP-2和NGFR等细胞因子。结论免疫磁珠细胞分选法可以从羊水中分离出OCT-4阳性的胎儿干细胞，分离后的细胞保持干细胞原有特性及生物学特征，可作为组织工程种子细胞。

大鼠胎儿神经干细胞的分离、培养及诱导分化

为了探讨神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）在体外培养中的生物学特性，研究不同细胞因子对NSCs分化的影响，试验对大鼠胎儿神经干细胞进行了分离培养，并研究了10，50和100ng／mL的神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain derived neruotrophic factor，BDNF）和胶质源性神经生长因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）对NSCs的定向诱导分化作用。结果表明，大鼠胎儿NSCs可在体外增殖并形成典型的神经球，指数增长期在传代后的第4～5天；10和50ng／mL的NGF、BDNF和GDNF对NSCs的诱导分化作用不明显，100ng／mL的NGF、BDNF和GDNF可诱导NSCs分化为神经元或胶质细胞。说明NGF和BDNF可诱导NSCs向神经元方向分化，GDNF诱导其向胶质细胞分化。

干扰素-γ对人胎盘胎儿来源间充质干细胞免疫调节功能的影响

目的:从人胎盘组织中分离胎儿来源间充质干细胞(MSCs),并探讨干扰素-γ(IFN-γ)对人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)免疫调节功能的影响。方法:采用酶消化法分离人胎盘胎儿侧MSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面分子CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45和HLA-DR,并利用D2S1399、D10S2325、D18S535和GATA198B05四个STR基因座对细胞属性进行鉴定分析;10 ng/mL IFN-γ诱导处理后,利用定量PCR(q-PCR)和ELISA分别测定对照组hfPM-SCs和IFN-γ处理后hfPMSCs IL-6、IL-8、IL-10和HGF基因及蛋白表达水平。结果:所分离细胞表达CD73、CD90和CD105,不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR,并分别具有来自亲本双方上述四个STR位点的等位基因。IFN-γ处理后,hfPMSCs IL-6 mRNA的表达水平显著提高(P<0.05),而IL-10和HGF的表达水平被下调(P<0.05)。ELISA结果表明IL-6蛋白表达水平显著升高,IL-8、IL-10和肝细胞生长因子的表达量降低(P<0.05)。结论:本研究成功的从人胎盘组织中分离和培养出hfPMSCs,且IFN-γ对其免疫抑制功能具有负调控效应。

人胎儿肝干细胞在聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体内的生长活性

目的:观察聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体材料对胎儿肝干细胞黏附及增殖的影响。方法:采用改进的两步胶原酶灌注消化法加percoll液不连续密度梯度离心的方法,分离胎儿肝干细胞。选取胎儿肝干细胞的第3代细胞,种植于聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体材料上。倒置显微镜下观察细胞的黏附和生长状况;计算细胞贴壁率、细胞增殖活力、计数细胞数。取细胞-载体进行组织学切片,苏木精-伊红染色光镜下观察细胞在载体中生长情况。在细胞培养第7天进行免疫荧光化学染色和流式细胞仪检测标志物表达。结果:聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体能促进肝干细胞在材料内黏附并保持其在机体内的形态。载体材料内的肝干细胞功能活跃,在材料表面和三维空间内部培养的肝干细胞均能持续增殖。经过连续10d共同培养,聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体对干细胞无毒性,人胎儿肝干细胞可以很好的贴附于聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体支架上,细胞增殖活力良好,标志物持续表达,培养7d得到的细胞数量增多19.7%。结论:聚酸酐-氨基葡聚糖三维载体能促进肝干细胞的增殖,有可能作为肝干细胞的载体应用于肝脏组织工程。

Neurobasal^(TM)-A和DMEM/F12培养液对大鼠胎儿神经干细胞生长的影响

用带有 3 [H]的胸苷对分裂细胞进行标记 ,通过细胞计数仪测定细胞数量的方法 ,对比了大鼠胎儿神经干细胞在添加相同成分的 Neurobasal TM-A和 DMEM/F1 2培养液中的生长情况 .结果表明 Neurobasal TM-A在有 EGF和 b

人胎儿肝干细胞的分离及鉴定

目的:探索人胎儿肝干细胞的分离及鉴定方法。方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化4～6个月水囊引产男性胎儿的肝干细胞,CO2培养箱培养,光镜、电镜下观察细胞特点,进行肝干细胞细胞标志SABC免疫组化染色。结果:平均细胞产量(2.10±0.50)×107,细胞活性率为(92.30±1.23)%。光镜下呈游离状态、大小不等的单个细胞,约为正常肝细胞1/5～1/3大小;电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,卵圆形细胞核,核/浆比例较大等特点;甲胎蛋白、细胞角蛋白8、19及α-1-抗胰蛋白酶免疫组化染色呈阳性,白蛋白及白细胞共同抗原染色呈阴性表现,培养3周可形成克隆样结构。结论:改进的Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心法可成功分离、纯化人胎儿肝干细胞。

人胎盘胎儿来源间充质干细胞通过旁分泌肝细胞生长因子减轻脂多糖诱导的人肺微血管内皮细胞损伤

目的探讨无血清培养人胎儿来源胎盘间充质干细胞(hfPMSC)旁分泌肝细胞生长因子(HGF)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞损伤的保护作用。方法用无血清培养基培养hfPMSC,流式细胞术检测CD73、 CD90、 CD105、 CD14、 CD34、 CD45、 HLA-DR的表达以确定其干细胞属性;利用Transwell^(TM)共培养体系[人肺微血管内皮细胞(HPMEC)接种于Transwell^(TM)上室, hfPMSC接种于下室],检测hfPMSC旁分泌HGF对LPS处理的HPMEC通透性的影响。实验分为LPS处理组、 hfPMSC共培养组、 HGF中和抗体组、正常HPMEC对照组。在Transwell^(TM)培养上室加入100μg异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran),荧光酶标仪检测染料渗透情况; Western blot法检测渗透相关蛋白血管内皮钙黏素(VE-cadherin)和陷窝蛋白1(caveolin-1)及凋亡相关裂解型蛋白胱天蛋白酶3(c-caspase-3)和裂解型多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(c-PARP1)的蛋白水平。结果所培养细胞具备间充质干细胞形态,为CD73、 CD90、 CD105阳性及CD14、 CD34、 CD45、 HLA-DR阴性细胞;与LPS处理组相比, hfPMSC共培养可显著抑制LPS环境中HPMEC的通透性,显著上调VE-cadherin的表达水平,降低caveolin-1、 c-caspase-3和c-PARP1的蛋白水平。相反,中和共培养体系中的HGF,可逆转hfPMSC对HPMEC的上述作用。结论 hfPMSC通过分泌HGF抑制LPS诱导的HPMEC通透性增加。

胎儿肝干细胞的分离培养与鉴定

从人胎儿肝脏中分离、纯化肝干细胞并进行鉴定。采用改进Seglen胶原酶原位灌注消化,结合Percoll密度梯度离心分离纯化胎儿肝干细胞,计数并测定细胞活性,光镜、电镜对其形态进行观察,用免疫细胞化学法(ICC)检测细胞表面标志表达情况。结果表明,所分离细胞活性率为90.80%±2.04%,细胞平均为(2.74±0.77)×107个/肝(n=10),光镜、电镜下观察其具有肝干细胞形态及超微结构特点,ICC染色,AFP、CK19、CK8及CD34等呈阳性,原代培养可形成肝干细胞集落。研究结果为人胎儿肝干细胞的存在提供了直接依据。

人孕中期胎儿结膜上皮干细胞定位特征的免疫组化研究

目的研究孕中期不同胎龄胎儿结膜上皮细胞中,角蛋白7、14、19p63和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及分布情况,探讨人胎儿结膜上皮干细胞的定位特征。方法取正常引产6h内的孕中期不同胎龄胎儿眼球前部组织,采用HE、免疫组化染色法,观察角蛋白p63和PCNA的表达及分布情况。结果PCNA及p63表达情况一致,主要表达在睑缘皮肤黏膜交界处及角膜缘上皮深层细胞。角蛋白19主要表达在穹窿部及球结膜上皮细胞。角蛋白14表达在睑缘皮肤黏膜交界处及睑结膜上皮细胞。角蛋白7表达在穹隆部至角膜缘上皮细胞。结论细胞角蛋白7、14、19和p63及PCNA在人孕中期不同胎龄的胎儿结膜上皮细胞的特征性表达表明,人孕中期胎儿结膜上皮细胞普遍具有增殖的活性,干细胞位于睑缘皮肤黏膜交界处和角膜缘上皮细胞的深层。

人胎儿肺间质干细胞染色体制备方法研究

研究了人胎儿肺间质干细胞染色体的制备方法,并对其染色体进行分析。结果表明,第5代细胞培养44 h,第15代细胞培养42 h,经终浓度0．025μg/mL秋水仙素作用2 h,0．075 mol/L KCl低渗25 min,正常核型比率最高,分别达到85．1%(171/201)和80．0％(172／215)。

不同发育阶段胎儿表皮干细胞差异表达基因的研究

目的采用基因芯片技术筛选早期胎儿与晚期胎儿表皮干细胞差异表达基因,分析不同发育阶段胎儿表皮干细胞基因表达变化特征及其可能的生物学意义,为进一步寻找表皮干细胞特异性发育调控基因提供新线索。方法收集胎龄8～12周人胎儿正常皮肤(早期胎儿组)及28～32周人胎儿正常皮肤(晚期胎儿组),采用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,分别提取各组细胞总RNA,用基因芯片技术检测2组胎儿表皮干细胞基因表达并筛选差异表达基因。结果基因芯片高通量地揭示了早期胎儿组与晚期胎儿组表皮干细胞的遗传信息。晚期胎儿组与早期胎儿组相比,DNA复制均与表皮干细胞的发育进程密切相关。差异表达基因有805个,其中表达下调的基因有389个,主要是GTP结合蛋白基因、序列特异性DNA结合蛋白基因、MAKP活性蛋白基因等与细胞增殖分化相关基因;表达上调的基因有416个,主要是与细胞成熟相关的细胞骨架结构蛋白基因等。结论体外培养的早期胎儿与晚期胎儿表皮干细胞基因表达谱有明显的不同,其差异可能与不同发育阶段人表皮干细胞的增殖分化能力及皮肤创伤修复能力不同密切相关。

羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化

背景:已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管。但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题。目的:探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。材料:羊水标本来自孕16～22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60mL羊水。方法:采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增。取第3代羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞。主要观察指标:倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬DiI-acLDL法检测诱导效果。结果:诱导30d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力。诱导后的贴壁细胞eNOS和vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的DiI阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现。结论:羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞。

慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子基因的胎儿骨髓间充质干细胞的研究

目的探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fBMMSCs)经慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因后GDNF的表达情况。方法利用贴壁培养法,从流产胎儿的股骨骨髓中分离培养fBMMSCs,并进行扩增。取第5代fBMMSCs,用慢病毒载体转染GDNF基因。应用免疫组化法及ELISA法检测被转染的fBMMSCs GDNF的表达情况。结果被转染GDNF基因的fBMMSCs GDNF表达阳性,且培养液中GDNF含量随培养时间延长而增高。结论被慢病毒转染GDNF基因的fBMMSCs能表达GDNF。

妊娠晚期羊水间充质干细胞生物学特性研究

目的:研究妊娠晚期羊水来源的胎儿间充质干细胞(MSCs)的体外分离、培养及其生物学特性。方法:贴壁培养法培养妊娠晚期羊水中的胎儿MSCs,形成细胞集落后用细胞刮刀刮下细胞重新培养、扩增,用倒置相差显微镜观察细胞形态,通过细胞表面抗原、细胞核型分析、细胞因子检测等证实该细胞是否为胎儿MSCs,以及不同代细胞之间是否有生物学特性上的差异,并通过绘制生长曲线,比较各代细胞的生长趋势。结果:用贴壁培养法分离、培养出的细胞呈梭形,不同代胎儿MSCs表面抗原、细胞核型相同,不同羊水标本来源的胎儿MSCs均表达胚胎干细胞相关蛋白(Oct-4),第8代(P8代)细胞比P2、P5代细胞生长缓慢。结论:通过上述方法可以成功分离、培养妊娠晚期羊水来源的胎儿MSCs,不同代细胞间生物学特性基本相同。

人骨髓胎儿间充质干细胞在小鼠体内的分化

目的:探讨人骨髓胎儿间充质干细胞(hfMSC)的特性及其在X染色体-连锁肌萎缩(mdx)小鼠体内分化的可能性。方法:从胎儿骨髓中分离扩增hfMSC,检测hfMSC Oct-4和Nanog-3的表达。经DIR标记后注射hfMSC到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察小鼠离体后肢肌肉植入细胞的存活状态,观察是否出现畸胎瘤,并采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果:从胎儿骨髓中分离到表达Oct-4和Nanog-3的hfMSC。在注射hfMSC的mdx小鼠离体后肢肌肉中检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达,而没有发现畸胎瘤的出现。结论:hfMSC表达多潜能抗原标志Oct-4和Nanog-3,hfMSC在mdx小鼠体内可以产生dystrophin,且不会形成畸胎瘤。

大鼠胎脑神经干细胞的分离和培养

从胚龄14.5～16.5d(E14.5～16.5)的大鼠胎脑组织获得大鼠胎脑神经干细胞(ratfe-talneuralstemcells,rFNSCs),培养于含有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)的无血清培养液DMEM/F12中,用3[H]胸苷掺入试验检测EGF和bFGF对大鼠胚胎神经干细胞分裂和增殖的影响.BrdU结合反应和nestin免疫组化检测显示培养细胞在早期时代约90%以上具有分裂增殖能力并显示nestin阳性,而且这些细胞在培养过程中可以分化神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,证明分离培养的是神经干细胞,可用于移植、定向分化和基因转移的研究.

人滋养层干细胞的分离培养与鉴定

目的建立可在体外培养的人滋养层干细胞系(hTSCs),为研究胎盘的发育机制提供新的模型。方法取临沂市妇幼保健院生殖医学科患者捐赠的发育正常的5~6 d囊胚,利用延时培养技术分离获取hTSCs,进行细胞核型分析,利用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测hTSCs标记物的表达,并对hTSCs的侵袭能力、分化能力以及内分泌功能进行检测。结果本实验成功建立4株hTSCs,其均具有正常细胞核型。免疫荧光技术检测显示,第8代hTSCs中转录因子活化蛋白2C(TFAP2C)、细胞角蛋白7(CK7)、转录因子GATA结合蛋白3(GATA-3)稳定表达;RT-qPCR检测结果显示,第8、16代hTSCs中CK7、GATA3、TFAP2C、TEAD4基因的相对表达量无显著性差异(P>0.05);分化组第2、4、6天穿过trasnswell微孔的细胞数量均多于未分化组(F=53.31~234.55,P<0.05);第4、6天分化组穿过trasnswell微孔的细胞表达GCM1的比例均高于未分化组(F=50.25,131.13,P<0.05);分化组中CK7、SDC-1、β-hCG和ITGA5基因的相对表达量均显著高于未分化组(t=-6.78~-2.51,P<0.05);分化组第2、4、6天培养基中雌二醇、孕酮浓度均高于未分化组(F=25.06~225.62,P<0.05)。结论本研究成功分离获取的hTSCs具有正常核型,均表达hTSCs特异标记物,其侵袭能力、分化能力及分泌功能等与人类早期胎盘滋养层细胞相似。这将为进一步研究人类滋养层细胞的发育和功能提供有力的工具。

不同来源间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全的研究进展

早发性卵巢功能不全(POI)是指在女性40岁之前卵巢功能衰退或丧失,严重影响女性身心健康和生育功能。随着国家三孩政策的实施,POI对女性生育的不良影响显得越发严重。早发现,早治疗,尽早采用医源性手段干预减缓卵巢衰退格外重要。间充质干细胞(MSCs)具有分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞的特性,愈来愈多的研究证实不同组织来源的MSCs优先植入受损组织,其可表现出极强的再生、分化及修复能力。目前MSCs已被用于修复化疗引起的卵巢衰竭,但关于MSCs尚有许多未知的谜题。综合以前的科研成果,本文对不同来源的MSCs通过多样化的生化通路及基因表达途径改善POI女性卵巢功能的国内外最新研究进展进行综述,旨为MSCs治疗POI的手段早日应用于临床,造福广大POI女性提供转化医学的依据。同时为生殖医师治疗POI提供更新颖的思路。