橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

白桦胚珠发育及胚、胚乳发育关系的研究

以30年生白桦(Betulaplatyphylla)的雌花序为材料,研究了白桦有性生殖期间胚珠和胚乳的发育过程,以及胚和胚乳发育之间的关系。观察结果表明:白桦为合生心皮雌蕊,花柱2,子房室2,每室1～2个胚珠或无,中轴胎座,倒生胚珠,单层珠被,厚珠心发育;胚柄短小,由三个细胞构成;在历时4个月之久的雌配子体形成、胚胎发育直至成熟期间,胚珠经历了形态结构的变化和适应;在胚的发育过程中,胚乳起主要营养作用,胚乳发育类型为核型胚乳。最后对胚、胚乳发育的解剖结构及其相互关系以及影响种子质量的各环节进行了研究和讨论。

小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究

为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响,分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚.结果表明:子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P<0.01),而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P0.05),说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著,且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法.小鼠早期胚胎发育观察结果表明:超排处理后,在公母鼠合笼后76～79.5 h采胚,胚胎大多处于桑椹胚期,而在公母鼠合笼后88～91.5 h采胚,胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期;采用TCM199+15%胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的.

无角道塞特羊胚胎移植技术研究

(1)超排处理无角道塞特绵羊163只,育成羊(76只)只均回收胚胎5.53枚,可用胚3.91枚,经产母羊(87只)只均回收胚胎7.55枚,可用胚6.34枚。经产羊平均回收胚胎总数高于育成羊(P<0.05)。春季和秋季之间超排效果差异不明显。重复超排羊和非重复超排羊之间平均回收胚胎总数和可用胚胎数差异均不显著(P>0.05)。(2)共处理受体876只,春季和秋季受体的同期发情率分别为56.37%和89.02%,发情受体利用率分别为84.67%和88.77%。(3)移植受体545只,妊娠318只,产羔396只,受体移植妊娠率为58.35%,移植胚胎成羔率为57.47%,在移植受体中,小尾寒羊的妊娠率最高为61.2%,同羊和内蒙细毛羊分别为54.62%和56.58%,受体品种之间移植妊娠率差异不显著(P>0.05)。受体黄体数对移植妊娠率及胚胎成羔率有一定的影响。胚胎的发育阶段对移植妊娠率也有影响,移植囊胚受体妊娠率最高为64.76%,明显高于早期桑椹胚移植妊娠率42.86%(P<0.05)。胚胎成羔率从桑椹胚到囊胚差异不显著(P>0.05)。

二元关系胚的性质及二元关系的胚分解

对于非空集合上的二元关系引入了关系的自反胚,反自反胚,对称胚,反对称胚,等价胚和偏序胚。并讨论了它们的基本性质,而且得到了关系的三个唯一的基本胚分解式。

拮抗剂方案新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植临床结局比较

目的 比较拮抗剂方案中行新鲜胚胎移植和冻融胚胎移植的临床结局。方法 回顾性分析2575例患者行拮抗剂方案助孕的临床资料,其中鲜胚移植周期1328例,冻胚移植周期1247例。结果冻胚移植组的血清AMH值、AFC显著高于鲜胚移植组,差异有统计学意义(P<0.05),其余基础资料无统计学差异(P>0.05)。冻胚移植组hCG日FSH低于鲜胚移植组,E2、P高于鲜胚移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。冻胚移植组的获卵数、成熟卵子数、优质胚胎数均显著高于鲜胚组,差异有统计学意义(P<0.05)。冻胚移植组的移植胚胎数显著低于鲜胚移植组,临床妊娠率、着床率、活产率显著高于鲜胚移植组,异位妊娠率、多胎妊娠率显著低于鲜胚移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组的中重度OHSS发生率、流产率、妊娠期糖尿病发生率、妊娠期高血压发生率差异无统计学意义(P>0.05)。冻胚移植组的单胎出生体重显著高于鲜胚移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 拮抗剂方案中冻胚移植亦可获得较好的临床结局,可作为一种有效的补充方案。

兰州鲶的胚胎发育研究

为阐明兰州鲶胚胎发育规律,连续观察从受精卵到孵化的22个发育形态特征。结果显示:兰州鲶受精卵为圆球形、半透明、呈黄色,卵径为(2.08mm~2.41mm);在孵化水温19℃~22℃,1h20min胚盘形成,1h42min进入卵裂期,4h5min进入囊胚期,9h56min进入原肠胚期,17h14min进入神经胚期,19h31min器官形成,受精后42h孵化出膜;兰州鲶受精卵完成胚胎发育所需的积温为870.10(℃·h)。本研究为兰州鲶早期生命历程研究和人工繁殖提供科学参考。

把握植物胚状体发生的重要特性

文章指出了开展胚状体研究工作应抓住的几个重要方面,对控制胚状体发生的重要条件进行探讨,试图从形态与物质上的变化方面去说明与胚状体发生机制的关系,尤其关于胚状体发生的鉴别将增强研究工作中的可操作性。

扁桃杧(Mangifera persiciformis)体胚发生及再生体系建立

以扁桃杧(Mangifera persiciformis Wu&Ming)未成熟珠心组织为外植体,建立体胚发生及再生体系,同时对幼苗进行茎尖染色体计数和胚根组织形态学观察。结果表明,在改良的B5基本培养基+2,4-D1.0mg·L-1+Gln400mg·L-1+6%蔗糖上培养4～5周后可诱导胚性愈伤组织分化。继代培养基与成熟培养基交替培养能有效降低胚性愈伤组织的褐化并保持旺盛的分化能力。培养3～4个月后,大部分体胚均能发育成熟,26.03%的体胚畸形。体胚在改良B5培养基+Gln400mg·L-1+4%蔗糖上的萌发率较低,仅为8.39%。次级体胚以直接体胚发生方式于萌发体胚的下胚轴产生。幼苗的生根不理想,生长极为缓慢;其茎尖染色体数目为2n=2x=40;胚根形态学上端内部维管组织解体,愈伤化,结构松散。

山羊(Bore)-兔异种克隆胚胎连续核移植的研究

以山羊-兔异种克隆桑椹胚卵裂球为核供体,兔卵母细胞为受体进行连续核移植研究,最终连续 2 次,共获得继Ⅰ代重构胚 58 枚,继Ⅱ代重构胚 14 枚。融合率分别为 79.5%和 70%,差异不显著(P>0.05)卵裂率分别为 75.9%和 28.6%,差异显著(P<0.05)。但继Ⅱ代重构胚最终未能发育至囊胚,继Ⅰ代重构胚囊胚率达到 10.2%。

囊胚培养与移植在不孕症患者中的应用

目的 探讨囊胚培养与移植在辅助生殖技术治疗过程中的应用价值,为改善不孕症患者妊娠结局提供一定的理论基础。方法 对2021年11月至2023年4月在本院生殖中心接受体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection embryo transfer, IVF/ICSI-ET)治疗的631例新鲜周期患者的一般资料、促排卵效果、获卵数、受精卵数、胚胎发育情况及移植胚胎类型与临床妊娠结局比较进行分析,同时,收集本时间段内接受冻融周期即第3天(day 3,D3)卵裂期或第5/6天(day 5/day 6,D5/D6)囊胚期移植患者的妊娠结局进行分析比较。结果 IVF/ICSI-ET治疗患者中,D3卵裂期胚胎未养囊组、养囊成功组和养囊失败组的女方年龄[(34.85±0.37)vs (30.53±0.33)vs (32.43±0.47)]、促性腺激素(Gonadotropin, Gn)天数[(9.45±0.14)vs (9.82±0.10)vs (10.11±0.17)]、Gn总量[(2323.79±51.03)vs (2073.48±47.02)vs (2288.42±69.94)]、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)日促黄体素(luteinizing hormone, LH)[(4.34±0.23)vs (3.32±0.17) vs (3.95±0.31)]和雌二醇(estradiol, E2)[(1586.21±86.84) vs (4642.65±226.48) vs (2756.45±147.13)]水平及获卵(获卵数:[(5.52±0.26)vs (16.51±0.56)vs (10.80±0.54)]和早期胚胎发育情况(优质胚胎数:[(2.34±0.10) vs (7.51±0.31)vs (3.73±0.27)]均存在统计学差异,养囊成功组囊胚形成率41.68%。囊胚移植与D3卵裂期移植患者相比,HCG日激素水平、获卵数[(13.86±1.14)vs (8.37±0.28)]、成熟卵数[(12.29±1.06) vs (7.16±0.24)]及优质胚胎数[6.33±1.10)vs (3.68±0.14)]明显升高,但妊娠结局无统计学差异。冻融周期中囊胚移植、卵裂期移植及混合移植三组间胚胎种植率(45.59%vs 25.25%vs 34.85%)和临床妊娠率(55.93vs 39.01%vs 57.58%)均存在统计学差异,但流产率、多胎妊娠率和异位妊娠率无显著差异。结论 囊胚培养显著提高胚胎利用率,增加不孕症患者移植机率;囊胚移植有助于提高ART助孕患者的胚胎种植率和临床妊娠率。

离体葡萄未成熟胚成苗途径研究

以巨峰葡萄剥离幼胚及红井川品种切喙胚珠为外值体接种至含不同浓度２，４Ｄ、ＮＡＡ与６－ＢＡ配比的ＮＮ－１９６９培养基中，诱导葡萄未成熟胚产生胚状体及实现胚萌发。两品种均是在含２，４－Ｄ０．５ｍｇ·１－１、６－ＢＡ１．０ｍｇ·１－１的培养基中诱导胚进入胚状体发生途径的；而在含ＮＡＡ（１．０、２．０ ｍｇ·１－１）与 ６－ＢＡ（０．２、１．０）或２．０ ｍｇ·１－１ＺＴ 配比的培养基上幼胚进入胚萌发途径成苗。由此讨论了培养基激素、胚发育时期对胚培养两种途径的诱导和控制。

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

对兔胚胎细胞核移植(NT)的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100V·mm-1,脉冲时间15μs,电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组(P<0.05);融合前激活卵母细胞,分裂率和囊胚率显著高于融合后激活(P<0.05);当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时,卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组;当重组胚在含3%发情牛血清(OCS)的TCM199中培养48h后,转入含10%FCS的TCM199中继续培养,卵裂率和囊胚率显著高于一直在3%OCS或10%胎犊血清(FCS)中培养的重组胚(P<0.05)。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内,34d后产下NT仔兔1只。结果表明,电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响,在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。

HCG动态监测诊断冻胚移植胚胎延迟着床1例

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)由胚胎滋养层合胞细胞分泌,是胚胎或胎儿释放到母亲体内的第一个有效信号,并贯穿整个妊娠过程^([1])。研究表明当β-HCG水平“翻倍”时,80.7%的周期发生活产;当β-HCG水平在卵母细胞回收15天也就是胚胎移植后12天。

‘西林3号’核桃体细胞胚胎诱导与增殖的影响因素

【目的】筛选最佳的‘西林3号’核桃体细胞胚胎诱导和增殖培养条件。【方法】通过进行不同消毒方法、不同外植体、不同采样时期、不同激素浓度配比、不同蔗糖与谷氨酰胺浓度处理,对核桃胚性愈伤组织的诱导情况进行研究,筛选最佳诱导条件;同时对比不同激素浓度对核桃体细胞胚胎增殖率的影响,筛选最佳增殖培养基。【结果】雄花(花药)、种子、幼胚的最佳消毒方法分别为70%乙醇15 s+10%NaClO浸泡4 min、70%乙醇30 s、70%乙醇5 min,培养4 d后的存活率高,污染率低。幼胚是诱导胚性愈伤组织的最佳材料,5月31日是最佳的采样时间,诱导率分别为(65.00±7.07)%和(85.83±1.17)%。以愈伤组织为材料时,诱导胚性愈伤组织的最佳激素浓度配比为改良DKW培养基添加1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.01 mg/L IBA,诱导率为(37.94±1.33)%。以愈伤组织为材料时,诱导胚性愈伤组织的最佳蔗糖质量浓度为30 g/L,诱导率为(82.67±0.94)%,谷氨酰胺不是诱导胚性愈伤组织的影响因素。体胚增殖的最佳激素浓度配比为改良DKW培养基添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L KT、0.005 mg/L IBA,增殖率为98%。【结论】外植体和采样时间的选择直接影响体胚诱导的结果,对于幼胚这类果实内部材料来说,仅进行简便快捷消毒即可。激素和碳源是胚性愈伤组织诱导与发生的关键因素,谷氨酰胺不是胚性愈伤组织诱导的影响因素。在进行体胚继代增殖培养时,适当添加激素可以抑制体胚成熟,提高增殖率。

两种超排卵剂量鼠胚实验对辅助生殖实验室质控的探讨

目的探讨采用两种超排卵剂量下的鼠胚实验对辅助生殖实验室进行质控的可行性。方法对SPF级昆明雌性小白鼠行腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素(HCG)超排卵,在采用8 IU PMSG+8 IU HCG和16 IU PMSG+16 IU HCG两种不同注射剂量下进行体外受精和体内受精,观察不同剂量、不同受精方式下鼠胚发育的优胚率和囊胚形成率。结果分别实施8 IU PMSG+8 IU HCG超排卵剂量与16 IU PMSG+16 IU HCG超排卵剂量后,雌性小鼠体外受精,鼠胚优胚率分别为90.965%和81.877%,囊胚形成率分别为82.341%和75.081%,差异有统计学意义(P<0.05);雌性小鼠体内受精,鼠胚优胚率分别为93.096%和85.889%,囊胚形成率分别为83.432%和76.994%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用两种超排卵剂量下的鼠胚实验对辅助生殖实验室进行质控具有可行性,恰当的超排卵剂量,能获得较高的优胚率和囊胚形成率。

胚胎分割技术在奶牛生产中的应用研究

本研究在于通过大群牛体试验探索出一种更适用于大规模奶牛生产的高效简便切割程序和方法。因此,试验采用了简易的单臂显微操作仪配上一根微玻璃针,在立体显微镜下连同胚胎透明带,从上而下进行切割,减去了分割胚胎再装透明带这一工序。对酶化处理。

三倍体食用蕉大孢子败育的胚胎学研究

通过对三倍体食用蕉（ＡＢＢ、ＡＡＡ类）大孢子及胚囊发育过程的观察，了解其胚囊发生和发育过程。观察结果发现其胚囊发育类型属蓼型，于各个不同的发育阶段出现下列异常现象：（１）大孢子母细胞经过减数分裂后，仅具三个大孢子；（２）功能大孢子的细胞核解体；（３）在雌配子体发生时，各次细胞核分裂均有细胞核解体；（４）胚囊解体后，产生多核合胞体。这些都是导致胚囊败育的原因。此外，还讨论了出现不定胚的现象。

抗性湿地松体细胞胚的发育、成熟及萌发

为加快抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生技术的产业化应用进程,本文研究了肌醇浓度、脱落酸(ABA)及其添加方式、基本培养基、聚乙二醇(PEG-6000)浓度、琼脂糖种类及浓度、活性炭浓度、液体悬浮培养等因素对抗性湿地松体细胞胚的发育、成熟及萌发的影响。结果表明:添加8 g/L肌醇较适宜,过高浓度的肌醇则不利于湿地松体细胞胚发育;ABA可以采用高压灭菌;基本培养基、ABA、PEG-6000互作对湿地松体细胞胚的成熟影响很大,基本培养基以LP为最佳,ABA的最适浓度为10m g/L,PEG-6000以添加25、50 g/L为宜;在湿地松体细胞胚的成熟培养过程中,PEG-6000的浓度不能高于100 g/L;在湿地松体细胞胚的成熟培养基中,添加60 g/L蔗糖最合适;湿地松体细胞胚的成熟培养基中添加0.5 g/L或1 g/L的活性炭较适宜;培养基状态对体细胞胚的高频率诱导具有一定的影响,悬浮培养以100 mL三角瓶装培养液30 mL、摇床转速130 r/min为宜,液体转固体时吸取培养液1 mL为宜;未建立成熟的体细胞胚发生体系前,以采用固体培养为佳。最佳成熟培养基、激素及部分添加物组合为LP+10 mg/L ABA+50 g/L PEG-6000+60 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭。