红豆草胚性细胞系和非胚性细胞系DNA代谢动态的研究

近年来国内外已对多种植物离体培养中体细胞胚的发生及其影响发生和发育的各种因素进行了大量的研究,显然,在植物离体培养中体细胞胚的形成是具有普遍意义的。但对体细胞胚的起动、发生的分子机理和生理生化基础等问题还有待于深入的探讨。本实验以红豆草为材料,建立了“胚性细胞系”,这种细胞系可形成大量体细胞胚,并以很高频率形成再生植株,这一过程称为“胚发生培养”。同时建立了“非胚性细胞系”。

贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和植株再生

鲜食蕉品种的高度不育性和多倍性制约了用传统育种方法培育生产实践中所需的新品种 ,建立稳定的胚性细胞悬浮系是香蕉生物技术育种的前提。以目前国内尚未建立该体系的鲜食蕉品种贡蕉 (AA)未成熟雄花序的第 1～ 15位花梳为外植体 ,对胚性细胞悬浮系的建立和植株再生体系进行了优化。结果表明 ,5～ 6个月的培养后可获得分生小球体和浅黄色、松散易碎的胚性愈伤组织。 9μmol L 2 ,4 D对外植体愈伤组织的诱导效果最好 ,诱导率为 4 0 96 % ,胚性愈伤组织诱导率可达7 4 5 % ,其中 5 79%的胚性愈伤组织来源于第 6～ 12号位置的花梳。胚性愈伤组织悬浮培养后 ,通过 3个月的筛选和继代培养 ,可得到均质的胚性细胞悬浮系。该培养体系合适继代周期为 15d ,继代时合适的起始接种量为每 30mL培养基加 2mLPCVECS。培养 6个月的胚性细胞在体细胞胚诱导培养基中培养 15d后可见到白色半透明体细胞胚的发生 ,体细胞胚诱导率为 2 80× 10 3个 mLPCV。成熟体细胞胚的萌发率为 17 2 8% ,其中发育成正常的再生植株的百分率为 14 16 %。

香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立

分别以3个香蕉品种的多芽体茎尖和5个香蕉品种的未成熟雄花为外植体,诱导产生胚性愈伤组织.结果分别从2个基因组类型为AAA的品种的多芽体茎尖和未成熟雄花获得了胚性愈伤组织,而未能从基因组类型为AAB或ABB的香蕉品种中获得胚性愈伤组织.胚性愈伤组织的诱导率受基因组类型、品种和培养条件等因素的影响.以上述4个品种的胚性愈伤组织为起始材料成功建立了胚性细胞悬浮系,不同香蕉品种,从其胚性愈伤组织建立胚性细胞悬浮系的难易程度有所不同.

小麦胚性细胞系的建立及原生质体的培养

近年来利用胚性细胞无性系游离原生质体,在禾谷类原生质体培养中已取得了重大进展。但从报道看,较多地注意原生质体游离前细胞状态的选择和对游离培养条件的优化,很少把组织培养和细胞状态的调控,与原生质体培养结合起来。

香蕉分生小球体途径胚性细胞悬浮系的建立

以 7个香蕉品种未成熟雄花为外植体均获得了分生小球体 (meristematicglobules)。分生小球体的诱导率因基因组型和品种而异 ,为 15%～ 81% ,分生小球体的特点及开始出现的时间也受基因组型和品种的影响。以分生小球体为起始材料 ,建立了‘广东 2号’、‘华农 7号’及‘河口龙牙’ 3个品种的胚性细胞悬浮系 。

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系的建立

本研究利用马尾松未成熟胚诱导的胚性愈伤组织,首次建立马尾松胚性愈伤组织悬浮增殖培养体系。实验中定期对细胞生长参数沉淀细胞体积（SCV）、细胞活力进行了测定,研究了初始接种量,继代细胞密度对悬浮增殖培养体系建立的影响。研究结果表明：不同初始接种量、继代转接细胞密度显著地影响马尾松胚性细胞悬浮培养的效果;在悬浮培育过程中,胚性细胞的生长周期曲线呈＂S＂型,细胞活力呈现先急剧上升,后缓慢下降的趋势;本研究建立的马尾松胚性细胞悬浮增殖培养体系为：在30 mL的培养基中,初始接种1.0 g胚性细胞（平均增殖系数达12.097）,继代培育以1/6作为继代细胞密度,且继代周期为8～12 d为宜。本研究为优化调控马尾松体细胞胚胎发生胚性愈伤组织稳定增殖提供了技术支撑,同时为采用遗传转化及细胞融合等技术进行马尾松新品种选育奠定了研究基础。

水稻体细胞培养中胚性细胞出现与IAA的关系

水稻体细胞培养中胚性细胞出现与ＩＡＡ的关系陈以峰１周燮２汤日圣２张金渝２梅传生１（南京农业大学农学系南京２１００９５）２（江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所南京２１００１４）关键词水稻，胚性细胞，ＩＡＡ，２，４二氯苯氧乙酸，２，３，５三碘...

甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立(英文)

对甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立进行了研究。将12个基因型的长约0.5mm的茎尖培养在含有0.2mg/L或2.0mg/L2,4-D的MS培养基上,形成了胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的形成率因基因型和2,4-D浓度不同而有很大差异,为0％～75.7％。一方面,将胚性愈伤组织继续培养在含有2,4-D的MS培养基上,它们形成了处于各发育时期的体细胞胚。将具有体细胞胚的胚性愈伤组织转移到MS基本培养基上,体细胞胚发育成植株。再生植株的胚性愈伤组织频率为5.9％～56.4％。另一方面,将培养8周后形成的高系14号和新大紫的胚性愈伤组织用于细胞悬浮培养,建立了增殖迅速、分散程度良好的胚性细胞悬浮培养系。在含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中振荡培养17周后,将直径约1.0mm的细胞团转移到含有2.0mg/L 2,4-D的MS培养基上,并进一步转移到含有1.0mg/L ABA的MS培养基和MS基本培养基上,实现了高频率的体细胞胚胎发生。在高系14号和新大紫中分别达到100.0％和53.6％,获得了大量再生植株。这些再生植株未有形态学变异。这样的胚性细胞悬浮培养系将成为细胞水平突变、体细胞杂交和遗传转化的理想供体。

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。

从香蕉胚性细胞悬浮系获得再生植株

2个主栽香蕉品种的未成熟雄花诱导产生的胚性愈伤组织接种至液体培养基中, 经3～4个月的继代培养后长成质地均匀的胚性细胞悬浮系(ECS),悬浮系中60%～80%是胚性细胞团。ECS接种至体胚再生培养基上约4～5周后开始出现再生体胚,萌发的体胚以MS培养基培养后可获得再生植株。

胡萝卜(Daucus carota L.)胚性细胞蛋白的分离研究

应用IEF/SDS-PAGE双向电泳技术,比较了胡萝卜胚性细胞、非胚性细胞和不同发育时期的胚状体中可溶性蛋白的双向电泳图谱,结果发现在胚性细胞中特异存在的胚性细胞蛋白在不同发育时期的胚状体中也存在,但在非胚性细胞中不存在。因此,推测体细胞胚胎发生所需的一些基因在胚性细胞中就早已表达了。我们还成功地分离和测定了ECP 45-2 N-末端和中央部分氨基酸序列。与已知氨基酸序列相比,ECP 45-2部分氨基酸序列与ECP 45-1 部分氨基酸序列具有较高比例的同源性。因此, ECP 45-1和45-2可能属于同一因基家族。

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。

棉花胚性细胞悬浮系的建立及其影响因素分析

对棉花悬浮细胞系建立过程中激素的配比和浓度、培养基成分、悬浮细胞的生长过程及衰老过程中PCD的发生系统研究结果表明:MS+2,4 D0.5mg·L 1+KT0.1mg·L 1和MS+2,4 D0.1mg·L 1+KT0.1mg·L 1培养基有利于细胞分裂,能产生体积较大,均匀一致,细胞活力强的单细胞和小细胞团,适合于进行细胞生长调控等研究。而MS+IBA0.5mg·L 1+KT0.1mg·L 1和MS+IBA0.1mg·L 1+KT0.1mg·L 1培养基则有利于形成大的细胞团和不同时期的胚状体,适合于进行胚状体的发育研究。钾盐、肌醇有利于细胞的分裂增殖,且能抑制胚状体的发生。可通过增加钾盐(K+)、肌醇含量来调节细胞的生长状态和细胞活性,以建成分裂增殖快、细胞活性强的悬浮细胞系。在悬浮培养过程中,管状细胞渐渐消失,被球状的单细胞和小细胞团所替代。棉花胚性愈伤悬浮细胞的生长曲线呈S形,在起始培养的0～3d是生长的延迟期;在第3～15天是指数增长期;到第15天以后,生长速度降低,是静止期。悬浮培养的棉花细胞必须在15d以前进行继代,以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。

龙眼胚性细胞悬浮培养再生植株

以龙眼胚性愈伤组织为起始材料 ,研究了胚性悬浮细胞培养的影响因素、继代保持方法及其体胚发生与植株再生 .结果表明 ,建立龙眼优良胚性悬浮细胞系的技术关键在于 :由松散型胚性愈伤组织作为起始材料 ;以去除琼脂的保持松散型胚性愈伤组织的培养基作为启动培养基 ;采用分别附加 5mgL-1AgNO3 、10 0mgL-1肌醇的培养基交替继代保持 .胚性悬浮细胞在附加 2 %蔗糖、0 .7%琼脂、4 0 0mgL-1LH、10 0mgL-1肌醇的MS固体培养基上形成的体胚数量可达 7× 10 4～ 14× 10 4g-1.经过成熟培养后 ,体胚转换植株的频率在 6 5 %以上 .图版 1图 1表 3参

与胡萝卜胚胎发生相关的胚性细胞蛋白63 cDNA分离及其基因表达研究

以胡萝卜鱼雷形胚状体为材料，以λｇｔ２１０噬菌体为载体，构建了一个含有６．０×１０＾８个重组子的ｃＤＮＡ文库。用ＰＣＲ法扩增的长度为１．１ｋｂ的胚性细胞蛋白６３ＤＮＡ片段作探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选出一个完整的ＥＣＰ６３ｃＤＮＡ克隆。

番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生

【目的】提高番木瓜体细胞胚发生的同步性及其植株再生率,为番木瓜大量快繁、细胞工程和分子育种技术研发提供技术基础。【方法】以紫晖110~120 d果实的未成熟合子胚为外植体,经胚性愈伤组织诱导、液体悬浮培养和体细胞胚发生过程,建立均质胚性细胞悬浮系和高效植株再生技术体系,重点比较了不同质量浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)对胚性愈伤组织诱导、不同质量浓度6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)+萘乙酸(1-naphthlcetic acid,NAA)组合和活性炭(activated carbon,AC)对子叶期体细胞胚萌发与生根的影响。【结果】4 mg·L^(-1)2,4-D可诱导62.86%未成熟合子胚形成胚性愈伤组织。经5个继代周期的筛选培养,可建立由单细胞和小细胞团组成的均质胚性细胞悬浮系。采用液体培养方式能诱导大量球形胚的形成,被转移至含5 g·L^(-1)AC的半固定培养基成熟培养30 d后,可获得大量子叶期体细胞胚。在含0.4 mg·L^(-1)6-BA+0.02 mg·L^(-1)NAA的萌发培养基中体细胞胚萌发率为97.58%,胚根端愈伤化比率为95.48%,补充5 g·L^(-1)AC后可获得92.62%体细胞胚同步萌发和生根,并显著降低愈伤化比率至33.10%;在不添加任何植物生长调节剂、仅含5 g·L^(-1)AC的成熟培养基中,体细胞胚同步萌发和生根率为88.33%,愈伤化比率降低至11.67%。正常萌发生根的体细胞胚在含0.1 mg·L^(-1)6-BA+2 mg·L^(-1)吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid,IBA)+10 g·L^(-1)AC的再生培养基中可获得81.36%的植株再生率。【结论】以紫晖110~120 d未成熟合子胚为外植体,最佳的胚性愈伤组织诱导培养基为1/2 MS培养基+4 mg·L^(-1)2,4-D+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+60 g·L^(-1)蔗糖。最优体细胞胚发生方案为胚性细胞悬浮系(embryogenic cell system,ECS)经液体培养方式诱导球形胚形成,在含1/2 MS盐+MS维生素+50 mg·L^(-1)肌醇+400 mg·L^(-1)谷氨酰胺+30 g·L^(-1)蔗糖+5 g·L^(-1)AC的培养基中促进体细胞胚的成熟及后续的同步萌发和生根,可有效缓解胚根端愈伤化现象。

百合鳞叶细胞形态发生中胚性细胞的电镜观察

百合鳞叶细胞培养在附加１～２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的ＭＳ培养基上进行器官型态发生，在附加２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上进行器官发生型形态发生．电镜观察发现：两种不同途径中胚性细胞的超微结构有明显差异．器官型中胚性细胞形态相似，排列整齐规则，核大，叶绿体结构完整，线粒体与淀粉粒在胞质中分布有规律，但在器官发生型中胚性细胞之间形态有差异，排列不整齐，细胞器在胞质中无明显分布规律，但在数量上除淀粉粒外要比器官型丰富．根据观察结果，在细胞学上提出了胚性细胞中细胞器的结构分布预定其形态发生途径的新观点，即结构位置预定假说．

提高玉米胚性细胞系诱导再生植株的研究

本实验以玉米G3 5× 3 1、Tf幼胚培养的胚性细胞系为材料 ,用 8114、MS和MN6、MB四种培养基诱导胚性细胞系再生绿苗 ,结果以MB培养基诱导率最高 ,为 93 3 % ;在以不同激素配比的培养基进行愈伤组织的生根培养 ,KT1 0mg/L(单位下同 )+6BA0 5 +NAA0 5 +IBA2的激素组合诱导生根效果最好 ,而其他三种激素组合未出现分化生根现象。

农杆菌介导霞多丽葡萄胚性细胞系遗传转化条件的优化

为建立葡萄(Vitis vinifera)遗传转化技术体系,以霞多丽葡萄(Chardonnay)胚性细胞系为靶组织,采用GUS检测法,对影响农杆菌介导葡萄遗传转化效率的主要因素进行了研究。结果表明,超声波处理时间长短对转化效率有较大影响,在所试的0.5、1、5、10 min 4种不同时间的超声波处理中,以5 min时转化效率较好,平均达到9.11个蓝色斑点;AS浓度对转化效率有明显差异,当浓度为50μmol/L时,平均蓝色斑点数为8.89个,100μmol/L时,达到12.44个;DTT质量浓度对转化效率也有较大影响,在所试的3种质量浓度(1,2,3 mg/L)中,以3 mg/L为最佳,有16.67个蓝色斑点。通过GUS瞬时表达检测,确立了农杆菌介导葡萄胚性细胞系遗传转化的几个最适影响因素,从而为葡萄遗传转化技术体系的建立奠定了基础。