玉米根边缘细胞exDNA和胞外蛋白对土荆芥化感胁迫的缓解效应

【目的】根边缘细胞(root border cells,RBCs)是从根冠上脱落下来的单个细胞或小细胞团。由于根边缘细胞的黏胶层与哺乳动物中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)具有类似的防御功能,而被称为根边缘细胞胞外诱捕网(BETs)。ex DNA和胞外蛋白是根边缘细胞黏胶层的组成成分,在根边缘细胞抵御生物和非生物胁迫中起着重要作用。化感作用是外来植物成功入侵的机制之一,探讨ex DNA和胞外蛋白在根边缘细胞黏胶层抵御入侵植物土荆芥化感胁迫中的作用,有助于深入研究植物根边缘细胞抵御化感胁迫的机制。【方法】以在土荆芥入侵地广泛种植的农作物玉米(雅玉26#)为材料,采用纯琼脂培养基悬空气培养法,研究供试玉米品种(雅玉26#)根边缘细胞的发育特性,以及在土荆芥挥发油及其两种主要成分对伞花素和α-萜品烯作用下,玉米根边缘细胞活性和黏胶层相对面积的变化规律,并分析在根边缘细胞黏胶层ex DNA或胞外蛋白被DNA酶或蛋白酶降解的情况下,土荆芥挥发油及其主要成分对伞花素以及α-萜品烯对根边缘细胞活性和黏胶层相对面积的影响。【结果】供试玉米根边缘细胞几乎与根尖同时出现,并随着根的伸长而逐渐增加,当根长达到30 mm时,根边缘细胞数量达到最大值,约6 130个。之后,随着根进一步伸长,根边缘细胞数量略微减少并趋于平衡,而根冠PME活性与根长呈现极显著的负相关(P<0.01)。根冠果胶甲基酯酶(PME)活性在根刚露白时就处于相对高的水平,之后则随着根伸长PME活性呈现持续下降最终趋于稳定;土荆芥挥发油、对伞花素、α-萜品烯具有细胞毒性,均能导致根边缘细胞活性显著下降(P<0.05),其中,挥发油的毒性最大,对伞花素、α-萜品烯的毒性次之,对伞花素和α-萜品烯混合物的毒性最小;土荆芥挥发油具有诱导根边缘细胞黏胶层面积增大的效应,并表现出剂量效应,当挥发油剂量达到5μL时,黏胶层相对面积与对照差异显著(P<0.05)。与对照相比,在对伞花素和α-萜品烯的作用下玉米根边缘细胞黏胶层面积变化不显著;当ex DNA或胞外蛋白被DNA酶或蛋白酶降解后,根边缘细胞黏胶层相对面积缩小,细胞活性降低,其中,挥发油处理组根边缘细胞活性均在10%以下,对伞花素处理组、α-萜品烯处理组、对伞花素和α-萜品烯混合物处理组根边缘细胞活性虽然有所降低,但仍保持在80%左右。【结论】土荆芥挥发油及其主要成分对伞花素、α-萜品烯具有细胞毒性,可导致玉米根边缘细胞活性降低,根边缘细胞黏胶层中的ex DNA和胞外蛋白对土荆芥挥发油、对伞花素、α-萜品烯的细胞毒性具有缓解效应,可在一定程度上缓解土荆芥的化感胁迫。

新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测

目的:测定不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性。方法:30℃和37℃下用含有偶氮白蛋白的琼脂培养板培养不同来源及血清型的36株新生隐球菌菌株,测量其产生的廓清晕环的大小,计算CH值[菌落半径/(菌落半径+廓清晕环半径)]来比较其胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性强弱;用丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂观察两种酶活性改变;酶谱法观察菌株浓缩上清液中胞外蛋白水解酶活性和相对分子质量。结果:36株菌株在30℃和37℃培养条件下它们的平均CH值分别为0.558±0.170和0.575±0.169,两者间无显著差异;血清A(n=13)、B(n=13)、D/AD(n=6)型菌株各自的平均CH值分别为0.564±0.144、0.515±0.078和0.482±0.072,各组间无显著差异;临床分离株(n=23)、环境分离株(n=9)和荚膜缺陷株(n=4)各自的平均CH值分别为0.570±0.177、0.513±0.069和0.942±0.075(P<0.05)。对照组(不含抑肽酶)和抑肽酶不同浓度组(1.2、1.6 mU)的平均CH值分别为0.459±0.188,0.975±0.287、0.733±0.252(P<0.01)。菌株浓缩液中含有复杂的胞外蛋白酶类成分。结论:新生隐球菌胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性在30℃、37℃下无显著差异;在临床分离株中比环境分离株和荚膜缺陷株强;在不同血清型菌株间无显著差别;可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制。

植物青枯病原细菌胞外蛋白相关基因的克隆

用含有转座子Ｔｎ５ 的铜绿假单胞杆菌ＰＡＯ１８２６（ｐＭＯ７５ ∷Ｔｎ５ ，Ｋｍｒ） 诱变我国马铃薯青枯菌小种３ 号菌株ＰＯ４１ ，获得６０００ 多个胞外多糖正常产生的接合子。经ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳，筛选出２ 个胞外蛋白减少９ 种的突变株ＰＭ２６４４ 和ＰＭ２３９ ，其可以引起烟草叶片典型的过敏性反应，致病力比野生型菌株显著降低，皆为原养型菌株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交的结果表明，突变株染色体上只有１ 个转座子插入位点。标记交换证明，９ 种胞外蛋白缺失与转座子插入相偶联的频率为１００ ％ 。以聚半乳糖醛酸酶和内葡聚糖酶２ 种胞外酶为指示蛋白进行定量测定的结果表明，在突变株上清液中和菌体细胞内都没有这２种胞外酶的存在。以突变株ＰＭ２６４４ 为受体菌，通过基因功能互补的方法，从野生型青枯菌基因文库筛选到２ 个阳性克隆ｐＰＳＰ１ 和ｐＰＳＰ２ ，它们既能恢复２ 个突变株产生胞外蛋白的能力，也能将２ 个突变株的致病力恢复到接近野生型菌株的水平。

自然水体生物膜胞外蛋白质吸附铅和镉的研究

The adsorption of Pb2+ and Cd2+ on the extracellular protein of natural biofilm was investigated.The extracellular protein was obtained from the extracellular polymers of superiority bacteria of natural biofilm cultivated in C South Lake of Changchun.The results showed that both Langmuir and Freundlich isotherm equations could be used to describe the thermodynamics adsorption processes of Pb2+ and Cd2+ on the extracellular protein.One order kinetic model of Langmuir-Hinshelwood equation could be used to describe the kinetic adsorption characteristics of heavy metals.The existence of Cd2+ affected the adsorption of Pb2+,and Pb2+ also affected the adsorption of Cd2+.Temperature and pH value could also affect the adsorption processes.The mechanism of Pb2+ and Cd2+ adsorption by the extracellular protein were studied by infrared spectra and the functional groups participated in the adsorption were identified.

不同基质传代白僵菌菌株胞外蛋白酶和几丁质酶产生水平与菌株对桑天牛幼虫毒力的关系

研究了对桑天牛幼虫具有不同致病力的各种传代白僵菌菌株胞外蛋白酶和几丁质酶的产生水平,并分析其与菌株致病力变化的关系。结果表明:不同基质传代菌株随着培养时间的延长,胞外蛋白酶和几丁质酶活性逐渐升高,达到最高值后基本趋于稳定,几丁质酶产生时间要滞后于胞外蛋白酶;通过寄主桑天牛幼虫传代的白僵菌菌株比通过普通查氏培养基传代的菌株具有更强的产酶能力;不同菌株胞外蛋白酶和几丁质酶产生水平与菌株毒力有一定相关性,尤其是产酶高峰值与菌株的LC50呈显著相关性,可将其作为菌株初步筛选的参考性毒力指标。

枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶突变株的筛选及其拮抗作用

从小麦根际土壤中分离到一株对多种植物病原真菌有拮抗作用且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis T2.经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,获得具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株.与出发菌株相比,培养48h的正突变株胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株蛋白酶活力降低81·1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化.正突变株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用.表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力.

一种新的90kD胞外蛋白激发子诱导烟草系统获得抗性研究

就棉疫病菌 (Phytophthora boehmeriae Saw.)培养滤液中提纯获得的 90 k D胞外蛋白激发子诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以 10 nmol/L激发子溶液注射处理 Samsun NN烟草叶片 2 4 h后 ,在处理叶片及其上、下各 2片叶片接种 TMV,结果是处理叶及其上、下各 2片叶片上的枯斑数显著少于对照 ,诱抗防效达 4 0 .9%～ 5 3.1% ;接种 TMV7d后处理叶片的枯斑平均直径为 1.2 3mm,显著小于对照叶片上的枯斑直径 2 .97mm,但是处理叶片的上、下叶片上的枯斑平均直径与对照没有显著差别。以 10 nmol/L激发子溶液注射处理 Samsun NN烟草叶片分别立即接种或于 1、2、4、7、15 d接种 TMV,结果证明该激发子诱导烟草对 TMV的抗性以处理后第 1d至第 4 d接种为较好 ,防效达30 .2 %～ 5 0 .4 % ;处理后立即接种和第 7d接种 TMV诱抗防效仅 4 %左右 ,处理叶片上的枯斑数与对照没有显著差别 ,表明较强的诱导抗性可持续时间 <7d。用不同浓度激发子处理烟叶 ,所测定的0 .5～ 10 0 nmol/L各浓度均可显著地诱发烟草对 TMV产生获得抗性 ,诱导抗性效果为 34.9%～5 8.2 % ,诱导抗性效果随浓度的降低呈下降趋势。以 10 nmol/L激发子溶液注射处理 W38烟草叶片 ,2 d后分别注射接种烟草野火病菌 (Pseudomonas syringae pv.tabaci)

球孢白僵菌胞外蛋白酶和几丁质酶活性与对亚洲玉米螟毒力的相关性分析

以振荡摇瓶培养法培养17株球孢白僵菌(Beauveria bassiana),分析其总胞外蛋白酶和几丁质酶的产生水平,同时用这些菌株的分生孢子粉作为样品,用人工饲养的亚洲玉米螟5 d龄幼虫作为试虫,作毒力生物测定.并分析各个因素之间的相关性,验证各个酶活性指标作为毒力的生物测定的替代或者补充指标的可能性.结果表明,菌株间同代毒力、酶活之间的差异比较大,LT50的变化范围为4.82～10.06 d,胞外蛋白酶活性的变化范围是0.86×10-2～3.66×10-2 IU/mL,胞外几丁质酶活性的变化范围是0.012～1.47 IU/mL.将后二者分别与各个菌株对玉米螟的LT50进行回归分析,结果发现胞外蛋白酶活性和胞外几丁质酶活性以及测定胞外蛋白酶活性时的干物质增重3个指标,与感染的亚洲玉米螟幼虫的死亡率及LT50的相关性都不显著,不能作为对亚洲玉米螟毒力的生物测定的替代或补充指标.

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建连接乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的非抗性重组质粒。方法:以瑞士乳杆菌基因组DNA为模板,克隆胞外蛋白水解酶基因,连接到以thyA为选择压力的非抗性穿梭表达载体pW425et上,构建重组质粒pW425et-R,转化入thyA基因缺陷型E.coliX13感受态细胞,SDS-PAGE电泳检测显示该水解酶得到了表达。结果:成功构建了重组质粒pW425et-R,胞外蛋白水解酶基因在E.coliX13中得到正确表达。结论:成功地表达了乳酸菌胞外蛋白水解酶基因,可为进一步制备具降血压功能基因工程乳酸菌提供参考。

嗜水气单胞菌胞外蛋白酶对鲫鱼的致病性

以提纯的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 (ECPase)注射异育银鲫 ,鲫鱼出现典型的由嗜水气单胞菌引起的败血症症状 :病鱼体表充血、出血 ,鳃苍白 ,腹部膨大 ,肛门红肿突出 ,腹腔内有红色的腹水 ,肠壁充血发炎 ;背部肌肉注射部位发生液化、糜烂 ,鳞片竖起。病鱼各组织器官都有病变 ,其中尤以肝、肾最为严重 :肝脏肿大 ,质地脆弱 ,肝细胞水肿 ,胞浆结构疏松 ;肾小体坏死以至解体 ,肾小管上皮细胞也发生病变。体外试验表明 。

白僵菌胞外蛋白酶的测定及其与酯酶型的关系

用明胶琼脂培养法和营养液振荡培养法测定了白僵菌不同酯酶型菌株的胞外蛋白酶，并用前一种方法测定了同一酯酶型菌株的胞外蛋白酶。发现不同类型菌株间和同一类型菌株内个体间胞外蛋白酶产生水平都有差异，少数几株差异显著。测定蛋白酶方法不能单独用来鉴别菌株。明胶琼脂培养法比营养液振荡培养法较为准确可靠。

球孢白僵菌不同世代菌株胞外蛋白酶与毒力的关系

以蝉蜕、蝇蛆壳两种培养基培养球孢白僵菌不同世代菌株 ,分析其类枯草杆菌蛋白酶(Pr1)和总胞外蛋白酶的产生水平及其与菌株毒力的相关性。结果表明 ,菌株的 Pr1产生水平达到最高的时间较总胞外蛋白酶早 1～ 2天。在蝉蜕培养基中 ,菌株 Pr1产生水平较高 ,而总胞外蛋白酶产生水平大大低于蝇蛆壳培养基中的产生水平。随着世代数的增加 ,Pr1和总胞外蛋白酶产生水平及对家蚕的毒力都明显下降。不同世代菌株在蝉蜕和蝇蛆壳培养基上的 Pr1产生水平与其毒力的相关系数分别为 0 .92和 0 .89,高于总胞外蛋白酶与其毒力的相关系数(0 .84和 0 .6 7)。因此认为在总胞外蛋白酶中 ,Pr1是影响菌株主要毒力因子之一 。

酱油酿造米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲胞外蛋白谱鉴定与分析

分析米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲培养过程中不同培养时间的胞外蛋白谱,确定培养时间为48h时种曲达到蛋白鉴定要求;采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)技术检测鉴定出SDS-PAGE胶图上11个蛋白条带,通过比对数据库鉴定得到8个蛋白,其中包括α-淀粉酶、淀粉糖化酶B、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等,与已在2009年Biosci Biotechnol Biochem期刊发表的《Analysis of extra cell ular proteins of Asper gillus oryzae grown on soy sauce koji》米曲霉AS3.951大曲的分泌蛋白谱共同提供了米曲霉沪酿AS3.951在酱油制曲过程中较完整的胞外分泌蛋白谱。

木霉胞外蛋白酶的研究进展

木霉菌Trichoderma spp.是重要的农业微生物资源,在植物病原菌和根结线虫的生物防治中发挥重要的作用。木霉菌具有复杂的胞外蛋白水解系统,可以分泌大量多种胞外蛋白酶,是细胞壁降解酶的重要组分。胞外蛋白酶通过参与营养竞争,协同降解植物病原菌细胞壁和根结线虫体壁等多种途径参与木霉的生物防治。本文就国内外木霉胞外蛋白酶的研究现状及其在木霉菌防治植物病原菌和根结线虫中所起的作用进行了论述。

微生物浸出过程中胞外蛋白的作用及其机理研究进展

矿物-微生物-溶液多相界面是硫化矿生物浸出的关键场所,界面微生物胞外多聚物(EPS)关键组分胞外蛋白在生物膜形成、结构稳定和硫化矿溶解等方面起到关键作用。综述了生物浸出过程中EPS关键组分胞外蛋白的研究进展和胞外蛋白现有的研究方法及其对冶金微生物胞外蛋白研究的适用性,展望了浸矿微生物胞外蛋白研究的前景,旨为生物冶金领域研究EPS关键组分胞外蛋白结构及其作用机理提供重要的理论和方法支撑。

嗜水气单胞菌不同分离株生化特性及胞外蛋白酶的检测

嗜水气单胞菌可引起多种宿主患病,该菌致病性与其产生的多种毒力因子特别是胞外蛋白酶有关。本研究检测了26株嗜水气单胞菌不同分离株的生化指标,采用脱脂乳平板法检测了胞外蛋白酶的产生情况,并利用PCR技术检测了2种胞外蛋白酶基因ahp-A(编码丝氨酸胞外蛋白酶)和eprCAI(编码温敏胞外蛋白酶)。结果表明,大部分菌株生化指标表现为蔗糖(+)、阿拉伯糖(+)、葡萄糖(+)、甘露醇(+)、鸟氨酸脱羧酶(-)、肌醇(-)、七叶苷(+);脱脂乳平板法检测发现,91.7%(22/24)的致病菌株均能产生胞外蛋白酶,而2株无毒株则不能产生,对2个胞外蛋白酶基因的检测也得到相似的结果。本研究将为嗜水气单胞菌的流行病学调查和致病机制的深入研究奠定基础。

萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性

【目的】研究萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性,探索植物病害生物防治的新途径。【方法】采用滤纸片法和叶盘法,检测XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和叶盘抑菌活性,以及对该病菌菌丝和孢子萌发的影响;研究其对另外5种植物病原真菌(尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌)的抑菌活性,并分析其抑菌活性在不同的pH(2,3,4,5,6,7,8,9,10和11)、温度(30,40,50,60,70,80,90,100,110和121℃)、蛋白酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)、紫外线作用时间(1,2,3和4h)、金属离子(Li^+、Na^+、K^+、Ca^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、Mn^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)和Ag^+)、表面活性剂(Tween 20和SDS)、抑制剂(EDTA)、氧化剂(H2O2)和常温保存时间(0.5,1,2,3,4,5和6个月)下的稳定性,最后分析XW2产细胞壁裂解酶的特性。【结果】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度为0.01mg/disc(5号滤纸片),能明显抑制杨树炭疽病菌在平板和杨树叶片上的生长,有效抑制孢子的萌发和附着孢的形成,并导致菌丝和萌发芽管产生膨大畸形;对尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌均有明显的拮抗活性。XW2胞外蛋白在110℃下处理30min及pH 6.0~9.0下均能保持较高的抑菌活性;对蛋白酶、紫外光照、金属离子(Li^+、Na^+、K^+、Ag^+、Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)和Cu^(2+))、SDS和EDTA均不敏感,但Mn^(2+)和Fe^(3+)会抑制蛋白的抑菌活性,而Tween 20和H_2O_2则能提高其抑菌活性;在常温条件下保存6个月后,其抑菌活性并未发生明显丧失。细胞壁裂解酶检测发现,XW2能产生蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶。【结论】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性强、稳定性好且抑菌谱广,具有潜在的工业开发和田间应用前景。

球孢白僵菌对马尾松毛虫的毒力与有关生化指标的关系——Ⅲ.不同世代白僵菌胞外蛋白酶的毒力

用液体培养的方法研究了白僵菌(Beauveria bassiana)不同世代的胞外蛋白酶产酶水平与其毒力关系。结果发现,B.bassiana各世代在明胶和虫尸粉两种液体培养基中均表现出随着继代移殖次数的增加胞外蛋白酶产酶水平依次降低的趋势,但同一世代在虫尸粉培养基中的产酶量显著高于明胶培养基中的产酶量。各世代在两种培养基中的产酶方式也不完全相同。各世代对马尾松毛虫的毒力也表现出了随继代数增加而减弱的趋势。

哈维氏弧菌GYC1108-1胞外蛋白酶的制备及免疫原性研究

胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种不同佐剂与适量抗原混匀,分别免疫3只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。3次免疫后制备小鼠血清,间接ELISA测定抗体效价,除空白对照外,其他8组小鼠的免疫血清效价达1∶1.6×104～1∶2.56×105,免疫组的效价从高到低依次为弗氏>白油>蜂胶>不加佐剂,不同佐剂的免疫效果依次为:弗氏>白油>蜂胶。免疫印迹实验结果表明,小鼠血清在55kD处有明显的反应条带。