MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

重编程诱导犬脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化

本研究旨在利用转基因技术诱导脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs)分化为胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs),通过干细胞疗法达到临床治疗糖尿病的目的。本试验首先验证了Hnf1b基因在体外诱导犬AMSCs向IPCs分化中的作用,在此基础上联合胰岛细胞发育过程中起关键作用的级联调控因子Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1,组成三种不同的多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs,重编程其向IPCs分化,通过检测筛选出最佳诱导组合。结果表明,Hnf1b基因对体外诱导犬AMSCs向IPCs分化具有促进作用。pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3(A)、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4(B)、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1(C)三种组合的多基因共表达腺病毒载体,在感染犬AMSCs 25 d后,A、B、C三组均形成胰岛样细胞团,且B组数量最多,双硫腙染色着色最深;高糖刺激下B组的胰岛素分泌量极显著高于A组和C组。A、B、C三组的胰岛细胞发育相关基因表达量显著升高;B组Pdx1基因的表达量显著高于A组和C组,Pcsk1基因表达量极显著高于C组;Ins基因的表达量显著高于A组。综上所述,Hnf1b基因对体外诱导犬AMSCs向IPCs分化具有促进作用,Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4基因联合诱导效率最佳。该研究结果为探究干细胞向IPCs分化的更高效方法提供新参考,也为糖尿病的临床治疗提供新思路。

Pdx-1、Ngn3联合MafA诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞移植治疗1型糖尿病大鼠的效果

目的通过胰十二指肠同源盒1(Pdx-1)、神经元素3(Ngn3)联合V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)共转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs),移植治疗1型糖尿病大鼠并观察其疗效。方法Pdx-1、Ngn3和MafA共转染BMSCs诱导为IPCs,链脲佐菌素(STZ)制备45只1型糖尿病SD大鼠模型,BMSCs组(15只)肾被膜下移植2×10^(6) BMSCs,IPCs组(15只)大鼠肾被膜下移植2×10^(6) IPCs,sham-operation组(15只)大鼠肾被膜下注入等量生理盐水,另取15只健康SD大鼠肾被膜下注入等量生理盐水作为normal组。监测各组大鼠移植第0、7、14、21、28 d空腹血糖及体重;第21天对各组大鼠均行葡萄糖耐量试验;第28天取各组大鼠肾脏组织进行免疫组化。结果BMSCs和IPCs组大鼠血糖随时间下降,移植第21天两组大鼠空腹血糖低于移植第0天,且均低于同期sham-operation组(P<0.05),移植第28天IPCs组大鼠空腹血糖低于BMSCs组(P<0.05)。糖尿病大鼠中IPCs组和BMSCs组腹腔葡萄糖耐量实验曲线下面积小于sham-operation组,且IPCs组曲线下面积最小(P<0.05)。BMSCs组和IPCs组大鼠肾脏组织可见棕色荧光的胰岛素表达,且IPCs组胰岛素荧光光密度高于BMSCs组(P<0.05)。结论Pdx-1-Ngn3联合MafA诱导BMSCs形成的IPCs移植后在糖尿病大鼠体内可降低糖尿病大鼠的空腹血糖。

体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为胰岛素分泌细胞(英文)

目的探索大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法。为解决胰岛移植物来源匮乏这一问题提供新的思路。方法 采用横向分化技术,将成年大鼠骨髓间质干细胞诱导成为胰岛素分泌细胞。间接免疫荧光法鉴定诱导前后细胞nestin、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素及Pdx-1的表达,RT-PCR法检测诱导前后细胞nestin,胰岛素-1,葡萄糖转运子-2,葡萄糖激酶及其转录因子Isl-1,Pdx-1,Pax-4和Pax-6 mRNA的表达;测定24 h胰岛素分泌量和胰岛素刺激实验评价诱导前后细胞的功能。结果 诱导5 h,nestin阳性细胞为(44.6±7.3)％;诱导24 h,nestin阳性细胞增至(61.8±8.4)％;此后,nestin阳性细胞数目开始下降,诱导第14天后,nestin表达基本消失。诱导后的胰岛素分泌细胞可以表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和Pdx-1等蛋白;表达胰岛素-1、葡萄糖转运子-2、葡萄糖激酶及其多种转录因子mRNA;胰岛素分泌量增加;胰岛素刺激实验反应敏感等。而诱导前MSCc不县备上述特点。结论 大鼠骨髓间质干细胞体外可以诱导成为胰岛素分泌细胞,为胰岛移植开辟新的研究思路。

小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的:探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。方法:采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞,观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mR-NA水平,检测其oct-4基因表达,并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞,基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。结果:小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形,细胞核大,胞质少;细胞增殖能力尚可;细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-;有oct-4基因表达;诱导分化后,可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。结论:成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞,具有与文献报道类似的生物学特征;有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。

GLP-1、Betacellulin、Activin A、bFGF和Nicotinamide联合诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

【目的】探讨体外联合应用GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicotinamide5种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化为胰岛素分泌细胞。【方法】以GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicoti-namide5种生长因子诱导E14.1小鼠ES细胞30d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素分泌细胞的分化率,用RIA法测定培养液中胰岛素水平。【结果】分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性,胰岛素分泌细胞的分化率平均为13.6%±3.7%,在5.6mmol/L和25mmol/L葡萄糖浓度作用下培养液中胰岛素水平分别为(0.04±0.01)ng/mL和(0.09±0.02)ng/mL。【结论】体外联合应用GLP-1、betacellulin、activinA、bFGF和nicotinamide5种生长因子能将小鼠ES细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,但胰岛素分泌功能较差。

三种不同细胞培养方式对体外小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞诱导效果的比较

目的:比较胚胎体、胚胎体-细胞单层和细胞单层3种细胞培养方式对小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为胰岛素分泌细胞的诱导效果。方法:应用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、β细胞素(betacellu lin)、激活素A(activin A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和尼克酰胺(n icotinam ide),分别以胚胎体、胚胎体-细胞单层和细胞单层3种细胞培养方式诱导小鼠ES细胞30 d后,应用RT-PCR、双硫腙(DTZ)染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素阳性细胞百分比。结果:3种细胞培养方式诱导的分化细胞均可见DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性细胞,RT-PCR检测到胰岛素和其它一些胰岛相关基因mRNA表达,胚胎体-细胞单层方式胰岛素mRNA表达最强,胚胎体方式次之,细胞单层方式最弱。胚胎体-细胞单层方式的胰岛素阳性细胞百分比高于胚胎体方式(P<0.01),后者又高于细胞单层方式(P<0.01)。结论:采用胚胎体-细胞单层方式诱导可更好促进小鼠ES细胞分化为胰岛素分泌细胞。

小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性

【目的】探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。【方法】培养小鼠骨髓干细胞,采用含GLP-1和nicotinamide的无血清培养液诱导分化,在培养过程中,检测有关基因的表达。【结果】培养的小鼠骨髓干细胞具有与文献报道相似的生物学特性;在诱导分化第7天,有ngn3和pdx-1基因表达;在诱导分化第14天,有nkx2.2、pdx-1和ins2基因表达。【结论】小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性,值得进一步研究。

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化诱导的途径和方法,为阐明胰岛β-细胞的发育机制和糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法将传统的多步诱导法改良为两步诱导法,将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多步法进行比较。结果经过两步诱导,胚胎干细胞被诱导成了胰岛素分泌细胞,越过了先将胚胎干细胞诱导为神经前体细胞,再进一步诱导为胰岛素分泌细胞的传统模式,使诱导时间缩短,诱导方法简化,所得胰岛素分泌细胞数量与传统方法所得相当。结论多阶段和两阶段诱导均可将胚胎干细胞诱导为胰岛素分泌细胞。

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化

目的通过体外培养将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。方法将体外培养的人脐带间充质干细胞分为诱导组和对照组。诱导组先后予以1 mmol·L-12-巯基乙醇培养2 d,10μg·L-1表皮生长因子、10μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子及2%B27培养7 d,之后添加20 mmol·L-1尼克酰胺及艾塞那肽培养7 d。对照组不添加诱导剂,继续换液培养。通过观察细胞形态变化、RT-PCR体外扩增两组细胞的胰腺—十二指肠同源框-1(PDX-1)基因、放射免疫法测定两组细胞胰岛素分泌量三种方法来鉴定胰岛素分泌细胞。结果 (1)通过形态学观察,诱导组细胞类似胰岛样细胞,对照组细胞则无明显改变;(2)应用RT-PCR方法,诱导组细胞可扩增出PDX-1基因,而对照组则没有。(3)诱导组细胞培养上清液可检测出胰岛素分泌,7 d时胰岛素浓度为(6.32±0.18)mIU·L-1,21 d时增至(34.57±4.54)mIU·L-1,而对照组则未测出。结论成功在体外微环境下将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。

重构腺相关病毒转导PDX-1对C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】重构含有PDX-1的腺相关病毒载体,将PDX-1转导入C2C12细胞,观察胰岛素分泌量的改变。【方法】应用PCR方法将PDX-1从pZL1质粒中克隆出来,安装到Stratagene公司的腺相关病毒(AAVHelper-FreeSystem)表达系统中,转染HEK293细胞,培养72h,提取病毒悬液,转导PDX-1进入C2C12细胞中,检测细胞培养液中的胰岛素含量。【结果】①用X-gal染色系统检测,可见有蓝色的阳性细胞。②病毒的粗略的浓度经计算后大约为1012/mL,转导的病毒数约为1011。③PCR结果:用重构的腺相关病毒转导后C2C12有胰岛素及PDX-1的mRNA的表达。④用重构的腺相关病毒转导PDX-1进入C2C12后的培养液的胰岛素浓度为(5.5±1.1)μIU/mL,较其他方法也有较明显的增加(P<0.05)。【结论】通过应用含有PDX-1基因的重构腺相关病毒载体可以转导PDX-1在C2C12细胞中表达,且可以提高C2C12分化为胰岛素分泌细胞的分泌量。

胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞移植对糖尿病鼠的治疗作用

目的:探讨小鼠胚胎干细胞ES-D3诱导生成的胰岛素分泌细胞(IPCs)皮下移植对糖尿病(DM)模型小鼠的血糖及一般状况的影响. 方法:首先,将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导培养液使其进行分化;其次,采用STZ(剂量:200 mg/kg)一次性腹腔注射.Balb/c小鼠制备DM模型;最后,将诱导21 d的IPCs行肩胛部皮下移植给DM小鼠,观察小鼠血糖及一般状况的变化. 结果:ES-D3诱导生成的IPCs在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇,可被DTZ染成洋红色.诱导生成的IPCs经两次移植给DM小鼠后5 d,受鼠的血糖水平显著降低,一般状况有所改善,但小鼠的血糖未能降至正常水平;第2 次移植后15 d,血糖水平反弹到与移植前没有差别。结论:ES-D3诱导生成的IPCs皮下移植给DM小鼠,能在一段时间内显著降低受鼠的血糖水平,改善一般状况,对DM小鼠起到一定的治疗作用.

人羊膜上皮细胞干细胞特性及向胰岛素分泌细胞分化的研究

目的建立人羊膜上皮细胞(hAECs)的分离及培养方法,探讨其向胰岛素分泌细胞分化的能力。方法观察不同培养方法对hAECs生长倍增时间的影响以优化其培养体系;通过细胞免疫荧光法检测不同培养代数细胞多能干细胞的表面标记;通过体外添加诱导因子的方法,探讨诱导hAECs向胰岛素分泌细胞分化的潜能。结果在10 ng表皮生长因子培养下,hAECs可长期传代。hAECs表达胚胎干细胞表面标记如阶段特异性胚胎抗原4等;采用悬浮培养法诱导分化,可检测到胰岛发育、胰岛功能基因如胰腺十二指肠同源盒、神经源素3、同源异形盒转录因子6、胰岛素、胰高糖素的表达,免疫组化检测细胞可以表达胰岛素,并且随着外界葡萄糖浓度升高,胰岛素分泌显著增加。结论建立了人羊膜上皮细胞的分离和培养方法(不添加动物血清);在体外可诱导分化为胰岛素分泌细胞。

胰高血糖素样肽1类似物调节胰岛素分泌细胞增殖和功能的细胞信号通路研究进展

胰岛素分泌细胞的功能紊乱是糖尿病早期的病理学特征。胰高血糖素样肽1(GLP1)是由肠黏膜L细胞分泌和葡萄糖浓度依赖的多肽类激素,它能够刺激胰岛素的基因表达、蛋白质合成和分泌;最重要的是,GLP1作为一种生长因子,可促进胰岛素分泌细胞增殖,并抑制其凋亡,增加其数量,增强其功能。其机制包括多条胞内信号通路,如通过激活GLP1受体激活蛋白激酶A和直接被cAMP活化的交换蛋白,或通过GLP1受体由表皮生长因子β细胞素(β-cellulin)或基质金属蛋白酶反式激活表皮生长因子受体并增加Wnt信号通路因子等。本文综述了近年来GLP1及其类似物调节胰岛素分泌细胞增殖和功能信号通路的研究进展。

PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

【目的】探讨PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用。【方法】将C2C12细胞分别经过不同浓度的类胰高血糖素(GLP-1)诱导120h后,瞬间转染胰腺十二指肠同源框(PDX-1)基因,用RT-PCR检测PDX-1的表达,流式细胞仪、放射免疫法检测细胞内和培养基中是否存在胰岛素。【结果】GLP-1可以直接诱导C2C12细胞表达PDX-1;PDX-1瞬时转染C2C12细胞后,胰岛素分泌细胞阳性率比值(1.19±0.10)、培养基中的胰岛素含量(2.45±1.48)×10-6U/mL均明显升高(P<0.05);单独的40nmol/LGLP-1诱导与瞬间转染PDX-1相比,阳性率比值及胰岛素浓度的差别均无统计学意义。【结论】GLP-1可以诱导C2C12表达PDX-1,而且PDX-1可以促进C2C12分泌胰岛素。提示GLP-1诱导C2C12分化为胰岛素分泌细胞可能与PDX-1有关。

新生大鼠肌源性干细胞跨胚层分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的探讨新生大鼠肌源性干细胞(MDSCs)在体外跨胚层转分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的可能性。方法提取新生大鼠MDSCs原代细胞,差速贴壁培养后行Desmin免疫细胞化学鉴定。然后将细胞分为3组:胰腺提取液诱导组、化学方法诱导组、空白对照组,分别诱导并同期观察细胞的生长形态,采用双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞,RT-PCR方法检测诱导后细胞的基因表达情况。结果获得高纯度的MDSCs,且Desmin免疫细胞化学鉴定呈阳性。胰腺提取液诱导组诱导后4d,相差显微镜下可见细胞团结构,诱导后6d呈半贴壁状态,诱导后12d形成典型的胰岛样细胞团,较化学方法诱导组诱导时间缩短3d。RT-PCR检测显示:胰腺提取液诱导组诱导6d后可检测到胰岛前体细胞相关基因Ngn3、nestin、PDX-1的表达;诱导12d后可检测到胰岛素基因的表达,但未检测到Ngn3、nestin、PDX-1的表达。结论胰腺提取液可模仿胰岛细胞发育的微环境,并诱导大鼠MDSCs跨胚层分化为胰岛素分泌细胞。

干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究与进展

学术背景:干细胞是一群较原始的细胞,它们具有自我更新和多向分化潜能,可以被诱导分化为胰岛素分泌细胞,理论上可提供丰富的胰岛细胞来源。目的:本文就近年来干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究进展做一综述。检索策略:应用计算机检索Pubmed和CNKI数据库1990-2007年期间相关文献,检索词为"干细胞,诱导分化,胰岛素分泌细胞,stem cell,differentiation,islet-producing cell"。对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究进展。排除标准:重复研究。文献评价:共收集到相关文献162篇,选择其中49篇文献进行重点阅读和分析。49篇文献中,1篇涉及糖尿病及其并发症的治疗,1篇涉及胰岛细胞移植,1篇涉及干细胞在糖尿病治疗中的应用,13篇涉及胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究,4篇涉及脐血来源的干细胞体内分化为胰岛素分泌细胞的研究,10篇涉及骨髓来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,13篇涉及胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究,6篇涉及其它器官来源的干细胞分化为胰岛素分泌细胞的研究。资料综合:胰岛细胞移植可以用来治疗1型和部分2型糖尿病,但由于供体细胞来源匮乏,因而寻找新的细胞来源成了当务之急。近年来,干细胞研究为新型胰岛细胞的来源带来了希望。目前用于胰岛细胞来源研究的干细胞主要有胚胎干细胞和成体干细胞,后者根据细胞来源不同分为脐血来源干细胞、骨髓来源干细胞、胰腺干细胞及其他器官来源的干细胞。目前的研究显示,骨髓来源的干细胞可以在体内促进胰腺的再生,并且可以在体外被诱导分化为胰岛样细胞。结论:深入了解干细胞向胰岛β细胞诱导分化的分子调控机制,将会加快糖尿病细胞治疗的研究进展。

胚胎干细胞诱生的胰岛素分泌细胞分泌胰岛素的研究

目的:研究小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌胰岛素的能力及其所分泌的胰岛素的活性. 方法:将ES-D3细胞培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF 的DMEM液进行诱导,隔天换液,21 d后,采用DTZ 染色、免疫细胞化学染色和ELISA等方法检测胰岛素的生成与分泌情况;用RT-PCR法检测PDX-1、Insulin1、Insulin2和Glut2等胰岛素分泌细胞相关基因mRNA的表达,并通过动物实验研究生成的IPCs所分泌的胰岛素的降糖活性. 结果:在诱导21 d,DTZ染色法观察到被DTZ染成洋红色的IPCs;免疫细胞化学染色法显示诱导体系中有胰岛素特异性免疫反应阳性的细胞群;ELISA法测定结果表明IPCs受高糖刺激后分泌胰岛素,动物实验证明所分泌的胰岛素具有降糖活性;RT-PCR法检测到有Insulin2和PDX-1 mRNA 的表达,Insulin 1呈弱表达,Glut2不表达. 结论:小鼠胚胎干细胞ES-D3诱生的IPCs能够合成并分泌胰岛素,而且分泌的胰岛素具有降糖活性.

小鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化过程中调控PDX-1基因表达miRNAs的鉴定

目的实现小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向胰岛素分泌细胞(IPCs)的诱导分化并对分化过程中可能调控胰十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)基因表达miRNAs进行鉴定。方法首先分离培养BMSCs,应用conophylline和尼克酰胺将其诱导分化为IPCs,采用双硫腙(DTZ)染色和免疫荧光检测胰岛素的表达。然后采用靶基因预测软件miRanda和Target Scan对调控PDX-1基因表达miRNAs进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测诱导分化过程中miRNAs及PDX-1的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测得到4个可能调控PDX-1表达的miRNAs,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现其中的miR-149和miR-346能结合到PDX-1 mRNA的3’UTR并有效抑制其表达。Real-time PCR检测结果表明,miR-149和miR-346的表达水平与PDX-1表达呈负相关。结论 miR-149和miR-346能负性调控IPCs诱导分化过程中PDX-1的表达。

miR-375对人类诱导多能干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

目的:探讨微小RNA-375(miR-375)在调控人类诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)过程中的作用及可能机制。方法:构建miR-375过表达的慢病毒载体,转染hiPSCs获得miR-375稳定表达的miR-375-hiPSCs,体外诱导其定向分化为IPCs,采用real-time PCR、流式细胞术及ELISA等方法对其标志性基因、分化效率、胰岛素和C肽释放量等进行检测;生物信息学结合萤光素酶报告基因实验预测并验证miR-375的靶基因,real-time PCR及Western blot检测靶基因的表达。结果:过表达miR-375可上调胰岛β细胞标志性转录因子HNF4α、MafA、Pdx1、Pax6、Nkx6.1、glucokinase和insulin的表达,分化效率由对照组的22.3%提高至38.6%;高糖刺激后胰岛素释放量由成年胰岛细胞分泌量的1/8提高到1/5;过表达miR-375可影响靶基因REST和WNT5A的蛋白翻译水平。结论:miR-375可通过干扰靶基因REST和WNT5A的翻译水平,开启胰岛素分泌相关特异性基因的表达,从而促进hiPSCs向IPCs定向分化。