DNA改性胶原支架促进口腔黏膜缺损愈合的研究

目的构建DNA修饰的胶原(DNA-Col)支架,探究改性后胶原(Col)生物相容性与促口腔黏膜软组织缺损愈合的性能。方法通过将Col材料浸泡于含DNA和磷酸基团活化剂的缓冲液中进行化学交联,以此构建出DNA-Col。通过甲基绿染色对DNA-Col上交联的DNA进行表征,并进一步利用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱对DNA与Col的交联机制进行初步探索。之后,利用扫描电镜观察DNA-Col的表面形貌。在评价DNA-Col的生物相容性方面,采用了溶血实验、CCK-8细胞增殖实验和活/死细胞染色实验。随后在体外将DNA-Col与人口腔成纤维细胞共培养,通过qRT-PCR检测转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)的mRNA表达水平,分析DNA-Col促进口腔黏膜缺损愈合的潜力。最后,在大鼠腭部黏膜缺损模型中检测DNA-Col的促愈合能力,并于术后10 d对各组黏膜愈合情况进行组织切片分析。结果DNA-Col保持了Col的特征性结构且生物相容性良好。人口腔成纤维细胞与DNA-Col共培养后,TGF-β、FGF-1等与细胞增殖迁移相关基因表达显著升高,提示DNA-Col具有促口腔黏膜愈合的潜力。大鼠腭部黏膜缺损模型显示DNA-Col组在术后10 d时创面愈合率可达(97.04±2.07)%,显著高于普通Col组[(79.38±5.76)%,P<0.01]。结论DNA-Col具有良好的生物相容性以及促口腔黏膜软组织缺损愈合的性能。

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景:骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。目的:验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况。方法:对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养,按加入诱导条件不同分为2组:实验组(转化生长因子β1+胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组。3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色。将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架,分为4组培养:复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组,1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色。结果与结论:实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组,且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示,Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架;模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组。结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖,有利于细胞之间的信号传递,为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境;作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原。

局部植入神经干细胞/胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用观察

目的：观察局部植入神经干细胞／胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法分离、培养、鉴定SD 大鼠神经干细胞，将其植入胶原支架中，制备神经干细胞／胶原支架复合体。取90只6周龄 SD 大鼠，随机分为 A、B、C 组，各30只，均常规行左侧脊髓半切术，制备 T10脊髓半横断损伤模型；A 组脊髓切除后于缺损区植入神经干细胞／胶原支架复合体，B 组脊髓切除后于缺损区植入胶原支架，C 组脊髓切除后不作特殊处理。术后1～8周，每周分别对三组大鼠进行 BBB 评分（评价其左后肢运动功能）；术后第4、8周时，三组各处死大鼠15只，进行脊髓组织结构及病理形态观察。结果①术后第4～8周时，A 组大鼠的左下肢 BBB 评分明显高于 B、C 组（P 均＜0．05）。②术后第4周时，A 组大鼠脊髓内支架与周围组织连接紧密，有少量空洞形成；B 组大鼠脊髓内支架与周围神经组织形成纤维蛋白连接，并有较多空洞形成；C 组大鼠脊髓缺损较大，缺损区周边有较多神经元及神经胶质细胞死亡。术后第8周时，A 组大鼠脊髓内有较多的神经纤维生成，支架与周围神经组织形成一体，连接紧密，无空洞形成；B 组大鼠脊髓内衣支架与周围神经组织连接较紧密，有一定量的空洞形成；C 组大鼠脊髓缺损区有岛状神经组织形成，细胞排列不整，仍有大面积缺损区存在。③术后第4周时，A 组大鼠脊髓缺损区的神经纤维排列较规律，B 组与 C 组脊髓缺损区排列杂乱。术后第8周时，A 组脊髓缺损区神经纤维排列有序，彼此间连接紧密；B 组与 C 组脊髓缺损区神经纤维，但仍杂乱，纤维之间不能形成突触连接。结论局部植入神经干细胞／胶原支架复合体可以较好修复损伤的大鼠脊髓，并促进大鼠肢体运动功能的恢复。

骨髓间充质干细胞种植Ⅰ型胶原支架材料修复关节软骨缺损的初步研究(英文)

目的研究骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)种植在型胶原支架材料(typecollagen-glycosaminoglycan,CG)上,软骨定向诱导后修复关节软骨缺损的可能性。方法将来源于10只成年实验犬骨髓的贴壁细胞培养传代至第3代,收集后以2×106密度种植于直径9mm,厚3mm(干样品尺寸)干热交联处理(dehydrothermaltreatment,DHT)的CG材料中,软骨诱导培养基诱导培养21d。观察每日细胞-材料复合体直径与初始直径的百分比,反应其收缩性。型胶原及平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin,SMA)免疫组织化学染色观测体外软骨形成情况。将体外诱导培养的细胞-材料复合体植入实验犬膝关节软骨缺损模型,12周后取材观察。结果诱导培养过程中细胞-材料复合体直径随时间延长而下降。21d后,细胞-材料复合体收缩至初始直径的64.4%±0.3%;组织学见:材料的孔隙收缩,新合成的基质使细胞-材料复合体的多数区域变为实体组织;型胶原及SMA染色阳性。植入实验犬膝关节软骨缺损12周后,犬膝关节功能恢复,关节软骨缺损处有软骨样组织填充。结论将MSCs种植于CG材料中,经软骨诱导培养后并植入软骨缺损后能形成含有II型胶原的软骨样实体组织。

胶原支架增强自固化磷酸钙骨水泥的力学及成骨性能研究

[目的]研究胶原支架(CS)对磷酸钙骨水泥(CPC)的力学及其在体内成骨的影响。[方法]试验分CPC/CS及CPC两组,三点弯曲试验测试材料的强度和弹性模量;组织学观察材料植入兔股骨22及54周的成骨状况。[结果]CPC/CS比CPC的弯曲强度、韧性强度分别提高了64.2%、3 933.3%,弹性模量降低了45.7%;组织学显示22周CPC/CS内的胶原支架已完全被新骨替代,CPC只在边缘有少量成骨及材料降解而内部无成骨;54周CPC/CS已大部分降解孔化,孔内充满大量新骨及髓样组织,而CPC边缘区的成骨及材料降解虽比22周时明显,但其内部仍未见成骨。[结论]胶原支架既可改善CPC的力学性能,又能促进新骨长入CPC/CS复合材料内部,因此,CPC/胶原支架是较好的骨缺损修复材料。

Atelocollagen胶原支架在三维培养大鼠心肌中的生物相容性

目的探讨atelocollagen胶原支架在三维培养心肌细胞中的生物相容性,寻找三维培养心肌组织的条件和理想的支架材料。方法原代培养的大鼠心肌细胞经纯化后,将细胞悬液接种到胶原纤维支架上,动态观察第8d、16d、20d在atelocollagen胶原纤维支架上生长的细胞的变化,并进行光镜、扫描电镜和透射电镜观察。结果接种后第1d形成细胞-胶原支架搏动复合体,细胞与支架一起有节律的跳动;心肌细胞填充于支架网孔周围,并与支架融合;在透射电镜下,3个时间段均发现细胞与支架紧密相贴,融合在一起;在扫描电镜下发现,细胞在胶原纤维支架上贴附并充分伸展,相互融合成片。结论atelocollagen胶原支架的生物相容性较好,可作为三维培养细胞和组织的天然材料,适于心肌组织的立体培养。

在Atelocollagen胶原支架上体外三维培养乳大鼠心肌

目的在Atelocollagen胶原支架上三维培养具有收缩功能的乳鼠心肌细胞块,为进一步开展心肌组织工程奠定基础。方法乳鼠心肌消化培养、纯化后,种植到Atelocollagen胶原支架上进行三维培养。应用倒置显微镜动态观察心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上的生长情况。对三维培养不同时间的心肌细胞块进行石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、肌球蛋白免疫组织化学染色、肌球蛋白免疫荧光染色、透射电镜观察,对三维培养的细胞进行全面鉴定。结果心肌细胞种植到Atelocollagen胶原支架上6h开始贴支架生长,培养2d心肌细胞相互融合,并与Atelocollagen胶原支架形成复合体,连同支架一起搏动。培养6d细胞与细胞间结合较前更紧密。培养10d细胞在Atelocollagen胶原支架孔中交织成网状,18～20d细胞充满大部分支架网孔,进一步形成紧密的心肌细胞块。在整个培养过程中,心肌细胞始终保持良好的自律性收缩。形态学鉴定证明,支架网孔中生长的主要是心肌细胞,极少数为纤维样细胞。结论利用Atelocollagen胶原支架能够培养出较为理想的、具有收缩功能的三维心肌细胞块。

双层胶原支架与人牙周膜细胞的体外生物相容性

【目的】研究双层胶原支架与人牙周膜细胞的体外生物相容性。【方法】组织块培养法培养原代人牙周膜细胞。MTT法测胶原支架不同浓度浸提液的细胞毒性。将人牙周膜细胞与支架材料三维培养,通过扫描电镜、组织切片观察其复合情况,并检测三维培养后细胞碱性磷酸酶(ALP)、羟脯氨酸(HYP)的分泌情况。【结果】不同浓度材料浸提液毒性评级为0~1级。细胞与支架复合培养后,细胞在支架上黏附、增殖良好,支架材料内部细胞分布均匀,且致密层可起屏障膜作用,阻挡细胞进入支架内部。细胞与胶原支架复合培养24 h后,细胞的ALP活性与对照组无明显差异(P>0.05),复合培养48、72 h后,细胞的ALP活性高于对照组(P<0.05)。复合培养24、48、72 h后,细胞的HYP活性均高于对照组(P<0.05)。【结论】双层胶原支架具有良好的生物相容性,可进一步应用于牙周组织工程的研究。

复合胰岛素样生长因子1壳聚糖胶原支架与人牙周膜细胞的增殖

背景:胰岛素样生长因子1具有促进成纤维细胞有丝分裂的作用,同时具有促进牙周细胞生长、分化及合成细胞外基质的作用。目的:观察负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架对于人牙周膜细胞增殖的作用。方法:将人牙周膜细胞分别接种于负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架与普通胶原支架上,于接种的1 h、24 h及1周检测重组人转化生长因子β1的释放,于第1,7,28天检测两组细胞的黏附和增殖情况。结果与结论:负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组第1,24小时和第1周的重组人转化生长因子β1释放率明显低于普通胶原支架组(P<0.01)。两组接种第1天的细胞黏附和增殖检测比较差异无显著性意义(P>0.05),负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架组接种第7,28天的细胞黏附和增殖情况优于普通胶原支架组(P<0.01)。表明负载胰岛素样生长因子1的壳聚糖胶原支架可显著促进人牙周膜细胞的增殖。

胶原支架负载BMP-2促进大鼠脊柱横突融合的临床观察

目的探讨胶原支架负载骨形成蛋白2(BMP2)在脊柱横突融合中的应用价值。方法将60只雄性SD大鼠随机分成3组,假手术组、材料组与复合材料组,各20只,行脊柱后外侧横突间融合手术,材料组和复合材料组大鼠L4～5横突间分别植入胶原支架和胶原支架负载BMP2,未植入任何材料组为假手术组。术后8周予手触力学评定、X线评分、mi-cro-CT扫描、H&E染色观察等分析和检测。结果手触力学评定、X线评分、micro-CT扫描、H&E染色观察显示8周后材料组和复合材料组大鼠L4～5横突间均有不同程度融合,假手术未见融合,且复合材料组融合效果优于单纯材料组。结论胶原材料负载BMP2促进大鼠脊柱横突融合,具有潜在的临床应用价值。

人成骨样细胞在糖交联胶原支架材料中的黏附和整合素表达

目的探讨人成骨样细胞在糖交联胶原支架材料中的黏附和整合素表达。方法将SAOS-2细胞接种于糖交联胶原支架表面,共培养3周后,采用扫描电子显微镜观测材料表面细胞形态,通过细胞示踪、整合素(Integrin-β1)免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观测细胞活性和在材料表面的黏附。结果人成骨样SAOS-2细胞可在糖交联胶原支架材料表面黏附,形成细胞膜片样结构,并表达细胞黏附因子Integrinβ1。结论糖交联胶原支架材料表现出良好的生物相容性,可在体外促进人成骨样SAOS-2细胞的黏附,并诱导整合素Integrinβ1表达,进一步调控细胞向成骨方向分化。

附和唾液腺细胞的胶原支架体内移植实验

目的:探讨附和大鼠唾液腺细胞(Salivary Gland Cells,SGCs)的三维胶原支架材料移植SD大鼠体内表达情况。方法:培养SD大鼠SGCs,增殖提纯、鉴定后将其接种到三维胶原支架材料上,植入SD大鼠皮下,连续观察3周检测SGCs表达情况。结果:实验组:SD大鼠生长良好,免疫组化显示SGCs连续3周均有表达,胶原支架材料3周时完全吸收。对照组:无SGCs的三维胶原支架材料植入SD大鼠皮下未见阳性细胞表达。结论:附和SGCs的三维胶原支架材料植入大鼠体内能够维持表达。

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架

背景:软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织。目的:拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性。设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成。材料:日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞。医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品。Ⅰ型胶原为Sigma公司产品。方法:取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20℃预冷冻10h,冻干机冷冻抽干24h制作成壳聚糖-胶原支架。取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体。主要观察指标:傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况。结果:壳聚糖-胶原支架孔径为160～380μm,平均为270μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%。傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰。细胞/支架共培养24,48,72h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合。结论:壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体。

载柚皮苷羟基磷灰石胶原支架对人牙髓干细胞体外增殖及成骨向分化的影响

目的:探讨载柚皮苷羟基磷灰石胶原复合支架对人牙髓干细胞体外增殖以及成骨向分化的影响。方法:体外扩增人牙髓干细胞与复合支架联合培养。采用CCK-8法检测人牙髓干细胞在支架上的增殖能力,通过检测碱性磷酸酶活性、茜素红染色和蛋白质印迹法观察支架对细胞体外成骨向分化能力的影响。结果:载柚皮苷羟基磷灰石胶原复合支架能促进牙髓干细胞增殖(P<0.05),并能增加其ALP活性(P<0.05)增强矿化能力,并对成骨相关标记蛋白RUNX-2和BMP-2的表达具有上调作用。结论:载柚皮苷羟基磷灰石胶原支架可提高人牙髓干细胞的增殖能力以及成骨分化的潜能。

胶原支架在组织工程角膜中的研究进展

胶原蛋白是人体组织中最重要的一类结构蛋白,具有优良的生物学特性,在组织工程支架中最具应用潜力。文章从胶原蛋白的基本结构入手,对胶原蛋白的相关生物学特性进行探讨,并进一步论述了胶原支架材料在组织工程角膜构建中的最新研究进展,指出目前存在的问题和未来发展方向,以期为构建满足临床需求的角膜移植材料提供指导。

胶原支架上体外三维培养成年大鼠心肌细胞

背景:前期研究中已经在Atelocollagen胶原支架培养出了具有收缩功能的乳鼠心肌细胞。目的:在Atelocollagen胶原支架上三维培养成年大鼠心肌细胞。方法:将成年SD大鼠心肌细胞经消化培养并纯化后,种植到Atelocollagen胶原支架上进行三维培养。应用倒置显微镜动态观察心肌细胞在Atelocollagen胶原支架上的生长状况;对三维培养的心肌细胞块进行冰冻切片,分别进行肌钙蛋白免疫组织化学和免疫荧光显色,对支架上生长的细胞进行鉴定。结果与结论:成年SD大鼠心肌细胞接种12h开始贴附支架生长,24h与支架汇合、紧密黏附,但心肌细胞并不产生自律性搏动,细胞之间夹杂少量崩解的细胞碎片;48h换液后支架网孔中崩解的细胞被换掉,剩下大部分细胞贴附在支架壁边缘生长。苏木精-伊红染色显示培养48h细胞与支架形成复合体。形态学鉴定证明支架网孔中生长的主要是心肌细胞。免疫组织化学和免疫荧光显色均显示在支架内生长的大部分是心肌细胞,并且紧贴支架,生长良好。

胶原支架促进人类多能干细胞向红细胞的诱导分化

目的建立人胚胎干细胞（hESCs）来源的造血干/组细胞向红细胞分化的体外3D培养方法。方法hESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾区（AGM-S3）基质细胞共培养14 d后获得CD34^＋CD45^＋造血干/祖细胞,对获得的CD34^＋CD45^＋细胞扩增5 d后,以相同初始接种数量分别接种于胶原水凝胶、透明质酸水凝胶、Ⅰ型胶原蛋白构建的三维（3D）支架材料（简称胶原支架）中,在体外模拟骨髓微环境,做红细胞定向分化,以普通液体悬浮培养（简称液体培养）为对照,通过MGG染色、流式细胞术、免疫染色、qRT-PCR等手段分别对收获的细胞做形态学、红系特异性表面标志表达情况、红系细胞成熟程度以及红系细胞发育过程中相关基因的表达情况分析。结果红系定向分化14 d后,胶原支架中收获的总细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.50、1.19、1.33倍,GPA^＋CD71^＋细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.55、1.25及1.48倍;GPA^＋CD36^＋细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.65、1.07、1.36倍。结论利用Ⅰ型胶原蛋白构建的3D支架材料可模拟骨髓微环境,促进红细胞分化。

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P<0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。

不同生物活性胶原支架对人牙髓细胞生长能力的影响及可能分子机制的探讨

目的:研究不同生物活性胶原支架对人牙髓细胞生长能力的影响及可能的分子机制。方法:分离培养人牙髓细胞,接种在胶原支架材料(COL)、胶原-生物活性玻璃支架材料(COL-BG)、胶原-生物活性玻璃-聚己内酯支架材料(COL-BG-PCL),检测细胞生长能力及相关基因的表达。结果:COL-BGPCL组hDPSCs的吸光值、迁移率以及上清液中ALP含量均高于COL组、COL-BG组;COL-BG-PCL组的Oct4A、NICD、HMGB1、SDF1、DSPP、DMP-1含量均高于COL组和COL-BG组。结论:COLBG-PCL复合材料有助于促进hDPSCs的增殖、迁移和分化过程,可能的分子机制是增加Oct4A、NICD、HMGB1、SDF1、DSPP、DMP-1的表达。

局部植入神经干细胞／胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用观察

目的：分析局部植入神经干细胞／胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法：对SD大鼠神经干细胞进行分离、培养与鉴定，并且在胶原支架中将其植入，对神经干细胞／胶原支架复合体进行制备。选取SD大鼠（6周龄）30只为研究对象，将其分为甲组、乙组与丙组，各组均有大鼠10只，采用常规左侧脊髓半切术，对T10脊髓半横断损伤模型进行制备，完成脊髓切除后，甲组将神经干细胞／胶原支架复合体植入缺损处，乙组将胶原支架植入缺损处，不对乙组进行任何处理。完成手术后的1—8周，每周均对甲、乙、丙3组大鼠进行BBB评分；完成手术后第4周与第8周，3组一共有5只死鼠，仔细观察其病理形态与脊髓组织结构。结果：术后4—8周时，相较于乙、丙2组，甲组大鼠左下肢BBB评分更高，P〈0．05。结论：局部植入神经干细肜胶原支架复合体能够促使大鼠脊髓损伤得到一定修复，并对其肢体功能恢复进行有效促进。