脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤U251细胞自噬中的调节作用

目的:探讨脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)在胶质母细胞瘤U251细胞自噬中的调节作用。方法:应用CRISPR/Cas9技术敲除U251细胞中BLBP的表达,检测BLBP敲除后U251细胞的活力变化;Ad-GFP-LC3b腺病毒感染U251细胞后,检测细胞中GFP-LC3b绿色荧光颗粒的数目;Western Blot检测自噬相关分子微管相关蛋白1轻链3βⅠ/Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3 betaⅠ/Ⅱ,LC3bⅠ/Ⅱ)、自噬相关基因5(autophagy-related genes 5,ATG5)、选择性自噬接头蛋白(sequestosome1,SQSTM1)的蛋白表达水平;Real-time PCR检测ATG5、SQSTM1的基因表达变化。结果:BLBP基因敲除后,U251细胞的活力明显下调,GFP-LC3b绿色荧光颗粒数目较对照组明显增多;此外,LC3bⅡ的蛋白表达水平较对照组明显增高,SQSTM1蛋白水平明显下降,而ATG5的基因和蛋白表达水平均明显上调。结论:BLBP基因敲除能提高U251细胞的自噬水平,BLBP具有调节胶质母细胞瘤细胞自噬的能力。

大鼠创伤性脑损伤后海马齿状回中脑脂结合蛋白的表达变化

目的观察大鼠创伤性脑损伤(TBI)后不同时间点海马结构齿状回中脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化。方法将72只SD大鼠随机分为脑损伤组、假手术组和空白对照组,制备大鼠颅脑液压损伤模型,伤后1、3、7、14d分别行海马组织Western blotting和BLBP、波形蛋白(Vimentin)免疫荧光双标检测。结果 Western blotting结果显示,伤后1d BLBP蛋白含量相对于空白对照组下降(P<0.01),后逐渐上升,至伤后7d BLBP蛋白含量与其他各组比较达到高峰(P<0.01),伤后14d又下降低于空白对照组水平(P<0.01)。BLBP和Vimentin双标阳性细胞数量变化趋势基本与Western blotting结果相一致。损伤侧海马BLBP和Vimentin双标阳性细胞主要分布于海马齿状回颗粒下层,多数呈放射状胶质细胞(RGCs)形态;伤后7d,齿状回门区也出现BLBP和Vimentin双标阳性细胞,大多为反应性星形胶质细胞形态。结论大鼠创伤性脑损伤后,损伤侧海马齿状回中BLBP的表达呈现先下降后上升,至伤后7d达到高峰,后又急剧下降的规律,BLBP的表达变化可能与海马神经再生和神经功能恢复有关。

脑脂结合蛋白促进大鼠星形胶质细胞增殖的研究

目的:明确脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)在体外培养的大鼠星形胶质细胞增殖过程中的作用。方法:构建BLBP过表达重组质粒、进行腺病毒包装,并感染体外培养的大鼠星形胶质细胞。培养3 d后检测BLBP基因和蛋白的表达情况,Ki67阳性细胞和EdU阳性细胞所占的比例,并用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:感染BLBP过表达腺病毒后,星形胶质细胞中BLBP基因的表达水平明显增高,外源性BLBP蛋白也能够在星形胶质细胞中正常表达;Ki67阳性细胞和EdU阳性细胞所占的比例明显增高,S期和G_2/M期细胞比例明显上调。结论:腺病毒能够感染体外培养的大鼠星形胶质细胞,过表达BLBP能够促进星形胶质细胞的增殖。

脑脂结合蛋白基因沉默抑制体外大鼠星形胶质细胞增殖

目的探讨脑脂结合蛋白(BLBP)对体外培养的星形胶质细胞增殖能力的影响。方法在体外培养大鼠星形胶质细胞的基础上,应用小干扰RNA(siRNA)沉默细胞内源性BLBP的表达后,Real-time PCR和Western blotting分别检测BLBP及c-Myc基因和蛋白的表达变化;随后采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)试剂检测细胞活力,Ki67免疫荧光标记增殖状态的细胞,并用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果应用siRNA沉默星形胶质细胞内源性BLBP的表达后,BLBP基因和蛋白的表达量明显下降,原癌基因c-Myc的表达水平也显著下调;BLBP基因沉默能够抑制细胞的活力并减少Ki67阳性细胞的数量;流式细胞术检测后发现,BLBP表达不足能够减少S期细胞的比例。结论 BLBP基因沉默能够抑制体外培养的星形胶质细胞的增殖能力,BLBP在星形胶质细胞的增殖过程中发挥调控作用。

大鼠创伤性脑损伤后损伤区周围脑组织脑脂结合蛋白的表达变化

目的观察大鼠创伤性脑损伤(TBI)后不同时间点脑损伤区周围脑组织脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化。方法采用大鼠颅脑液压损伤模型,在伤后1、3、7、14 d用Western blot检测损伤区周围脑组织BLBP的表达,用免疫荧光双标法检测BLBP和波形蛋白。结果 TBI后1 d,BLBP含量显著下降,后逐渐上升,至伤后7 d达到高峰,伤后14 d又急剧下降(均P<0.01)。BLBP和波形蛋白双标阳性细胞主要分布在损伤区周围皮质及损伤侧胼胝体,损伤侧皮质阳性细胞大多为反应性星形胶质细胞形态;损伤侧胼胝体阳性细胞基本呈放射状胶质细胞(RGCs)形态。结论 TBI后损伤区周围脑组织RGCs样细胞可能与皮质神经再生和神经功能恢复有关。

干预脑脂质结合蛋白表达对神经干细胞分化作用的影响

目的探讨脑脂结合蛋白(BLBP)在大鼠海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化中的作用。方法构建BLBP过表达腺病毒和干扰慢病毒载体,并从大鼠胚胎海马组织中分离培养神经干细胞,采用Nestin免疫荧光鉴定NSCs;将体外培养的NSCs分为4组:腺病毒阴性对照组(Ad-NC组),BLBP过表达腺病毒组(Ad-BLBP组),慢病毒阴性对照组(LV-NC-RNAi组)和BLBP干扰慢病毒感染组(LV-BLBP-RNAi组)。Real-time PCR和Western blotting检测各组细胞中BLBP表达;病毒感染4 d后免疫荧光检测分化细胞中βⅢ微管蛋白(Tuj1)阳性神经元数量。结果 Ad-BLBP组较Ad-NC组NSCs分化为神经元的数量少,突起短而少;LV-BLBP-RNAi组较LV-NC-RNAi组NSCs分化为神经元的数量明显增多,突起多而长。结论下调BLBP的表达能够促进体外培养的NSCs向神经元分化。

海马放射状胶质细胞的体外诱导激活及其意义

为探讨海马放射状胶质细胞在切割穹窿海马伞侧海马提取液的诱导下形态发生的变化,将培养的海马胶质细胞接种于24孔培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液,分别于培养后1、3、7和14d时行BLBP免疫荧光检测和Hoechst标记。计算两组各天时BLBP阳性细胞占Ho-echst阳性细胞的百分比,并用LeicaQiwn图像处理软件检测BLBP阳性细胞的周长和面积(含突起)。Stata8.0统计软件行组间比较。结果显示,1d时诱导组BLBP阳性细胞的比例稍高于对照组,两组细胞胞体均较小,突起均较短较细,无明显差异;3d时,诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组,且胞体较大,突起较粗较长;7d时诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组达到高峰,胞体更大,突起更粗更长交织成网;14d时两组BLBP阳性细胞的比例均稍有降低,但诱导组的比例仍明显高于对照组,两组细胞的胞体稍变小,突起稍变细变短。上述结果提示,切割穹窿海马伞侧海马提取液可明显地诱导BLBP阳性放射状胶质细胞增殖,并使胞体变大,突起变粗变长,呈"激活"状态。

切割穹窿海马伞大鼠海马内BLBP的表达变化

为了观察切割大鼠右侧穹窿海马伞后,切割侧与正常侧海马齿状回内脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化,本研究应用Western blot和免疫组织化学方法检测双侧海马内BLBP蛋白表达水平的变化,以及海马齿状回门区和颗粒下层中BLBP免疫阳性细胞数和灰度值。结果显示:正常大鼠双侧海马各区和颗粒下层细胞BLBP仅有微量表达,切割穹窿海马伞后第1 d双侧差异不明显;3 d时切割侧颗粒下层阳性细胞及染色深度较正常侧加深;5 d时切割侧颗粒下层阳性细胞数量明显增多,染色较深,并达到最高水平;7 d后BLBP免疫阳性细胞的数量和染色深度开始降低,14 d时接近正常侧水平。而切割后3、5 d时双侧门区BLBP免疫阳性细胞的数量差异不大,但切割侧染色较深,7 d后也逐渐降低,14 d时降至正常侧水平。上述结果提示,切割穹窿海马伞阻断了隔区与海马齿状回的纤维联系后,可引起海马齿状回门区和颗粒下层BLBP表达增强,可能引发了放射状胶质细胞的增殖和激活,构成的支架有助于神经干细胞的迁移和向神经元的分化。