靶向FOLR1的脱氧核酶提高鼻咽癌移植瘤对紫杉醇的敏感性

目的:探讨裸鼠鼻咽癌移植瘤能否通过靶向FOLR1的脱氧核酶(DrzE)提高其对紫杉醇的敏感性。方法:取CNE-1鼻咽癌亲本细胞及CNE-1/taxol紫杉醇耐药细胞进行裸鼠成瘤实验,分别予靶向FOLR1的“10-23”型DrzE单用和紫杉醇单用及紫杉醇-DrzE联用后比较各组鼻咽癌移植瘤体的抑制情况。RT-qPCR及Western blot检测用药前后各组瘤体FOLR1 mRNA及蛋白的表达。结果:CNE-1瘤体较CNE-1/taxol瘤体生长速度快,瘤体体积更大(P<0.05);CNE-1瘤体生长能被紫杉醇单药抑制,但紫杉醇对CNE-1/taxol瘤体无效;两种瘤体生长均能被DrzE单药抑制,其中耐药瘤体更显著(P<0.05);紫杉醇与DrzE联用较分别单用两药对移植瘤的抑制作用更显著(P<0.05);给药前CNE-1/taxol移植瘤中FOLR1的表达量显著高于CNE-1(P<0.01),用药后DrzE单药组及紫杉醇与DrzE联用组中两种移植瘤体FOLR1表达量均显著低于对照组(P<0.05)。结论:靶向FOLR1的脱氧核酶DrzE转染裸鼠移植瘤体后可减慢鼻咽癌瘤体的生长,提高鼻咽癌耐药移植瘤体对紫杉醇的敏感性。

一种长时稳定的铅离子响应型脱氧核酶的合成与表征

脱氧核酶作为一类具有酶活性的功能核酸分子,以其不同于蛋白酶和核酶的结构优势而被广泛应用于生物传感等分析检测领域。但核酸结构易受生物酶降解,故而限制了脱氧核酶在该领域应用研究中的推进。化学修饰的方法可改善该问题,但仍存在修饰繁琐且价格昂贵等弊端。该文基于核酸结构改造,利用环形核酸结构的耐酶切能力,设计合成了一种环状结构的铅离子响应型脱氧核酶,并对其性能进行了表征。研究结果表明该环形脱氧核酶在外切酶样、自来水样以及75%胎牛血清(FBS)中具有比传统单链脱氧核酶更好的结构稳定性,其中在75%胎牛血清中稳定存在的时长达6h。此外,环形结构的引入也增强了脱氧核酶与底物序列的相互作用,进而影响基于环形脱氧核酶的生物传感器的信号表达,这一特性有望为脱氧核酶生物传感器的构建提供新思路。

金属离子对二甲亚砜依赖的RNA切割型脱氧核酶催化活性的影响

在高浓度有机溶剂中工作的RNA切割型脱氧核酶(RNA-cleaving DNAzyme,RCD)及其构筑的分子器件不仅拓展了DNA作为酶的能力,还可将功能核酸推进新的应用领域.本文研究了一个需要二甲亚砜才能工作的RCD(命名为E3)对金属离子的需求,发现二价金属离子对其催化活性至关重要,活性顺序为Zn^(2+),Mg^(2+)>Fe^(2+)>Pb^(2+)>Mn^(2+)>Co^(2+).以Mg^(2+)或Zn^(2+)为辅因子,表征了E3的速率-pH值关系及其与二者的结合比例.E3的催化速率-pH曲线在Mg^(2+)存在下为“钟形”,高速率的pH值范围为7.0~9.0;Zn^(2+)存在下为“尖峰”,速率最高时pH=7.0;E3与Mg^(2+)和Zn^(2+)的数量结合比例均为1∶1.另外,E3以Fe^(2+)为辅因子时易失活,Fe^(2+)被氧化成Fe^(3+)是失活的关键,加入还原剂可使其复活.进一步研究发现,Cu^(2+),Fe^(3+)和Ni^(2+)等金属离子可抑制Mg^(2+)或Zn^(2+)的作用,使E3的催化活性急剧降低.本文研究结果为理解E3的性质及催化机制提供了有用信息.

脱氧核酶催化放大效应在微RNA传感中的研究与应用

微RNA(microRNAs,miRNAs)是一种与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关的短序列非编码RNA,其具有丰度低、序列同源性高和易降解等特点,因此,miRNAs的高灵敏、高特异检测面临巨大挑战。具有RNA切割活性的脱氧核酶是新兴的一类功能性单链DNA分子,此类酶能在金属离子的辅助下对核酸底物特异性切割,释放miRNA进行循环再利用,实现信号放大。目前,基于脱氧核酶催化放大检测miRNA的新方法研究是近年来科研人员的重点关注方向之一。本文根据脱氧核酶结合不同的生物传感新技术和新材料,对近年来发展出的基于脱氧核酶催化放大检测miRNAs的新方法进行分类与回顾,归纳为脱氧核酶DNA自组装、脱氧核酶偶联等温扩增以及脱氧核酶结合新型纳米材料的3类方向,并逐一阐述各个方向的基本原理及其在生物传感领域、医学检测方向的最新研究进展与应用实例,旨在为进一步的精准灵敏检测miRNAs新策略研究提供参考。

RNA切割型脱氧核酶在生物医学领域中的研究进展

RNA切割型脱氧核酶(RCD)是一类具有催化活性的单链DNA分子,具有灵活的可编程性、优异的稳定性、强底物特异性和高催化活性等优点,因而在生物医学领域展现出了良好的应用前景.基于RCD对于特定辅助因子的依赖和对于靶标RNA的特异性识别和切割,其被广泛应用于一系列生物分子靶标的检测以及多种临床疾病的基因治疗.文章介绍了RCD的物理化学特性,并对其在生物医学领域的研究现状进行了总结,聚焦于RCD在生物传感和癌症治疗等方面的应用进展.此外,还对该领域面临的挑战及未来的发展方向进行了讨论.

VASN核酸适配体与端粒酶逆转录酶脱氧核酶偶联物的生物学功能研究

目的研究肝癌细胞特异性膜蛋白VASN(vasorin)的核酸适配体V4-2与靶向端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的脱氧核酶(DNAzyme,Dz)偶联形成的偶联物V4-2-Dz在体外和肝癌细胞内的靶RNA切割活性,为脱氧核酶递送提供新策略。方法Mfold网站预测V4-2-Dz的二级结构,通过体外切割实验检测V4-2-Dz的切割活性,通过流式细胞术和激光共聚焦实验检测V4-2-Dz和肝癌细胞HepG2结合的能力,利用RT-qPCR和MTT法分析V4-2-Dz作用于HepG2细胞对h TERT mRNA表达水平和细胞增殖的影响。结果体外切割实验表明,V4-2-Dz具有切割hTERT RNA活性;流式细胞术和激光共聚焦实验结果显示,V4-2-Dz可以特异结合并进入HepG2细胞,V4-2-Dz可显著降低HepG2细胞中hTERT mRNA水平并抑制细胞增殖。结论VASN蛋白的核酸适配体与端粒酶逆转录酶的脱氧核酶偶联物V4-2-Dz具有靶向肝癌细胞递送和切割活性,基于适配体和脱氧核酶的偶联物为肿瘤药物研究提供新的思路。

食品安全检测中脱氧核酶生物传感技术研究进展

脱氧核酶(deoxyribozymes,DNAzymes)是一类具有催化活性的人造脱氧核糖核酸(DNA),因其在生物传感领域存在巨大潜力而受到广泛关注。这些功能性寡核苷酸不仅可以作为特异性的分子识别元件,还能直接通过本身的酶催化活性报告或者传递信号。近年来,基于DNAzyme的生物传感技术在食品安全领域的研究和应用得到了迅速发展。本文重点关注了近3年来的文献资料,综述了DNAzyme的催化机制和生物传感策略以及它们在食品安全快速检测中的研究进展,并讨论了未来该生物传感技术在食品样品分析检测中可能的发展趋势和方向。

RNA切割型脱氧核酶功能化纳米材料荧光生物传感研究进展

脱氧核酶是通过体外筛选得到的一种具有酶活性的功能核酸。其中,具有RNA切割功能的脱氧核酶由于具有特异性强、可编程性高及易于合成修饰的特性,已在生物传感领域得到了广泛的发展,但易受核酸酶降解、胞内传输效率低等问题限制了其在体内的应用。纳米材料尺寸小、比表面积大及生物相容性好,在生物领域展现出了出色的应用前景,RNA切割型脱氧核酶与纳米材料的结合为解决上述问题提供了新思路。综述了基于RNA切割型脱氧核酶功能化纳米材料的荧光生物传感的研究进展,首先介绍了RNA切割型脱氧核酶功能化纳米材料的常见功能化策略,随后详细讨论了基于RNA切割型脱氧核酶功能化纳米材料的荧光传感器在体内和体外检测重要生物分子的最新应用,最后就此类传感器的开发所面临的挑战和未来发展方向进行了展望。

脱氧核酶研究进展

使用体外分子进化技术 ,从一个人工合成的随机多核苷酸单链DNA库中筛选出具有酶活性的DNA分子 ,称为脱氧核酶 .目前已经筛选出具有RNA切割作用、DNA切割作用、金属螯合作用和过氧化物酶活性、DNA激酶活性以及DNA连接酶活性等多种催化功能的脱氧核酶 .特别是脱氧核酶 10～ 2 3,无论在体外应用于RNA限制性内切酶 ,还是在生物系统内作为RNA水平上的基因失活剂 ,都具有很好的应用前景 .

脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的 :探讨乙型肝炎病毒 (HBV) s基因和 c基因特异性的脱氧核酶 (DNAzyme)对 HBV表面抗原 (HB-s Ag)和 e抗原 (HBe Ag)表达的抑制效应。方法 :设计合成针对 HBV s基因 ORF A157UG、e基因 ORF A1816UG的DNAzyme Drz BS、Drz BC,在 2 .2 .15细胞上观察其对 HBV s基因、c基因的表达抑制效应。结果 :Drz BS、Drz BC作用于 2 .2 .15细胞后 ,可显著抑制 HBV s基因、c基因的表达 ,有效浓度为 0 .1～ 2 .5μmol/ L并呈剂量依赖性 ,最高抑制率分别为 94 .2 %和 91.8% ;有效抑制持续时间可达 72 h;Drz BS、Drz BC在细胞内对 Hbs Ag、Hbe Ag表达的抑制效率 ,明显高于作为对照的反义寡核苷酸 As BS、As BC,有效浓度较后者低至少 10倍。其对 2 .2 .15细胞的 HBVDNA复制无明显影响 ,亦未见明显的细胞毒性作用。结论 :在 2 .2 .15 HBV细胞模型系统 ,Drz BS、Drz BC能高效阻断 HBV s基因、e基因的表达 ,是一种特异性的、高效的抗 HBV基因治疗剂。

基于脱氧核酶的新型铅离子荧光探针

将荧光猝灭基团修饰的17E脱氧核酶(17E DNAzyme)与荧光基团修饰的底物链通过6个脱氧核苷酸相连,得到了一种新型的对Pb2+敏感的荧光探针.由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交,荧光基团与猝灭基团相互靠近,导致荧光猝灭.当Pb2+存在时,DNAzyme被激活,底物链被切断后释放出荧光基团标记的DNA片段,从而产生明显的荧光信号.据此可在常温下快速检测Pb2+,检测下限为10 nmol/L.在Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Mg2+和Ni2+等多种二价金属离子中,除Zn2+,Mn2+和Cd2+略有干扰外,其它几种金属离子均无响应,表明该荧光探针对Pb2+具有良好的选择性.

基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)

利用核酸切割酶(Nicking endonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质,构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17E DNAzyme)的Pb2+荧光循环放大检测方法。Pb2+可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物,产生并释放出的单链与分子信标探针(Molecular beacon,MB)杂交,导致其茎环结构被破坏,荧光信号恢复;同时形成含有核酸切割酶Nt.BbvCΙ识别位点的双链区域。在核酸切割酶Nt.BbvCΙ的作用下,分子信标探针被切割释放,游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交,从而触发下一轮酶切,引起荧光检测信号的循环放大。本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰,最低可以检测出水溶液中1.0×10-10mol/L Pb2+,并在2倍浓度的Zn2+,以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对Pb2+显示出良好的选择性。本方法对环境水样中Pb2+的标准加样回收率为96.1%～108.0%。

HCV脱氧核酶在表达荧光素酶HepG2细胞中的活性

目的 对丙型肝炎病毒 (HepatitisCvirus ,HCV) 5′ 非编码区 ( 5′ Noncodingregion ,5′ NCR)靶向性脱氧核酶 (De oxyribozymes ,DRz)在靶基因调控性荧光素酶表达HepG2细胞中的活性进行评价。方法 根据HCV 5′ NCR中符合 5′…Y↓R… 3′(Y =A/G ,R =U/C)特征的位点及 5′ NCR的二级结构选择靶位 ,采用 10 2 3DRz基序 ,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz 2 3 2、DRz 12 7、DRz 84、DRz1以及两端被硫代修饰的DRz(Phosphorothioatedeoxyribozymes ,TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MutantphosphorothioateDRz ,MDRz)。直接将其加入体外培养的受HCV 5′ NCR调控的表达荧光素酶HepG2细胞 (HepG2 970 6细胞株 )中 ,或用脂质体转染法将其导入靶细胞。用化学发光法检测荧光素酶活性 ,计算抑制率。结果 转染终浓度为 0 5 μmol/L的药物 2 4h后 ,DRz 2 3 2 /TDRz 2 3 2、DRz 12 7/TDRz 12 7、DRz 84/TDRz 84和DRz1/TDRz1的抑制率分别约14 3 %/ 14 9%、5 3 2 %/ 5 0 6%、2 5 6%/ 2 3 8%和 44 7%/ 43 3 %,均高于对应的MRz ,其中DRz 12 7/TDRz 12 7与MRz 12 7( 4 1 2 %)相比抑制率有显著性差别 (P <0 0 5 )。直接将TDRz 12 7或MRz 12 7加入细胞培养体系中被动作用 5h和 2 4h ,抑制率无明显差别 ,?

端粒酶催化亚基脱氧核酶抑制A549/DDP耐药细胞生长的实验研究

背景与目的端粒酶在多种肿瘤中均有表达,并且可能参与肿瘤耐药。本研究的目的是观察端粒酶催化亚基脱氧核酶对A549/DDP耐药细胞生长的抑制作用,探讨端粒酶作为耐药肿瘤细胞治疗新靶标的可能性。方法合成针对端粒酶催化亚基mRNA的脱氧核酶,脱氧核酶体外切割端粒酶催化亚基mRNA片段。采用TRAP法检测转染脱氧核酶的A549/DDP细胞端粒酶活性,采用MTT法分别检测脂质体转染脱氧核酶、顺铂及其混合物对A549/DDP细胞生长的作用。结果端粒酶脱氧核酶在体外可以切割端粒酶催化亚基RNA,并具有剂量依赖关系;转染脱氧核酶可抑制A549/DDP细胞端粒酶活性;端粒酶脱氧核酶0.25μmol/L作用72h,A549/DDP耐药细胞生长抑制率可达32.9%,同3mg/L顺铂联合使用时抑制率可达60.5%,两者相互作用指数CDI=0.9。结论端粒酶催化亚基脱氧核酶可明显降低端粒酶活性,显著抑制人肺腺癌A549/DDP耐药细胞的生长,并且与化疗药物顺铂有协同作用,提示端粒酶有可能成为耐药肿瘤细胞新的治疗靶标。

脱氧核酶抑制耐药基因mecR1的表达逆转MRSA耐药性

目的探讨脱氧核酶抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)耐药基因m ecR1的表达对M RSA耐药性的影响。方法设计、合成特异性针对耐药基因m ecR1m RNA的硫代脱氧核酶,将其导入细菌,通过半定量RTP-CR观察脱氧核酶对耐药基因m ecR1及其下游基因m ecA表达的抑制作用,并通过平板克隆形成实验观察脱氧核酶对M RSA耐药性的影响。结果加入脱氧核酶后培养的M RSA,m ecR1与m ecA的m RNA表达水平较对照组显著降低(P<0.01),在含苯唑西林(6m g L/)的M H-琼脂培养基表面生长的菌落单元数也低于对照组(P<0.01)。结论特异性抗m ecR1脱氧核酶阻断耐药基因m ecR1m-ecA的表达,可以部分恢复M RSA对抗生素的敏感性。

EBV-LMP1C端RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选

目的探讨用体外转录方法制备EBV-LMP1C端RNA并用该RNA对其靶脱氧核酶进行初步筛选。方法用巢式PCR方法从绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中扩增EBV-LMP1exonc,重组入pGEM-11zf载体,并用T7RNA聚合酶对其进行体外转录制备EBV-LMP1C端RNA。根据该RNA的一、二级结构设计合成3种靶向10～23脱氧核酶,据体外剪切效率筛选高效特异的靶向脱氧核酶。结果成功地构建含EBV-LMP1exonc基因的重组质粒,用体外转录方法用1μg质粒转录出40.25μg高纯度的EBV-LMP1C端RNA,有1种脱氧核酶DZ1对该RNA体外剪切效率达89%。结论用T7RNA聚合酶体外转录方法成功制备了高纯度的EBV-LMP1C端RNA,经体外剪切筛选出高效特异的1种脱氧核酶,为进一步研究奠定了基础。

结核分枝杆菌ICL mRNA特异性10-23脱氧核酶切割活性的鉴定及其切割特点

为鉴定结核分枝杆菌异柠檬酸裂合梅（ICL）特异性的10-23DRz在无细胞体系切割ICL mRNA的活性，并探讨其在不同条件下以及联合应用时对靶mRNA的切割特点，采用计算机软件模拟ICL mRNA的二级结构，据此选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性10—23DRz（DZ1～DZ5）．PCR法扩增获得纠基因并克隆入质粒pET32a＋．采用T7 RNA聚合酶体外转录法获取ICL全长mRNA后分别用DZ1～DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割，切割产物经变性聚丙烯酰胺凝胺电泳后用银染法鉴定各DRzs的活性．选择切割活性最强的DZ4考察不同10—23DRz剂量、不同反应时间、不同镁离子浓度条件下及不同错配或突变10—23DRz的切割特点．联合应用DZ1、DZ4及DZ5在无细胞体系中对ICL mRNA进行切割。检测10—23DRz联合应用对切割效率的影响．结果表明，DZ1、DZ3、DZ4及DZ5可在无细胞体系中有效地切割ICL mRNA，其切割效率在30．8％～64．5％之间．对DZ4切割活性的检测发现，其对靶mRNA的切割具有剂量和时间的依赖性；在2—20μmol／L范围内，DZ4的切割活性与Mg^2＋浓度呈正相关；DZ4单侧底物结合臂上含一个不与靶mRNA配对的碱基时其切割效率大大降低，两侧底物结合臂上各含一个不配对的碱基或活性中心域第6位出现碱基突变（G—C）时，DZ4完全丧失切割活性．联合应用2种或2种以上10-23DRz可显著增强对底物RNA的切割效率．10-23DRz特异、有效地切割结核分枝杆菌ICL全长mRNA并显示一定的叠加效应，有望用于抗结核分枝杆菌潜伏感染的基因治疗．

脱氧核酶抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的表达

目的 :探讨抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药基因blaR1表达的脱氧核酶对MRSA耐药性的影响。方法 :以耐药基因blaR1的mRNA为靶点 ,设计合成脱氧核酶DrzB ,导入细菌后通过平板克隆形成实验观察DrzB对MRSA细菌耐药性的影响 ,通过RT PCR观察DrzB对耐药基因blaR1表达的抑制作用。结果 :加入DrzB后培养的MRSA ,在含苯唑西林 (6mg·L-1)的M H琼脂培养基表面生长的菌落单元计数低于对照组 (P <0 .0 1) ,blaR1的mRNA表达水平也较对照组降低 (P <0 .0 1)。结论 :导入以blaR1的mRNA为靶基因的DrzB阻断耐药基因表达 ,可以部分恢复MRSA的抗生素敏感性。脱氧核酶DrzB是一种特异性的。

基于脱氧核酶的无标记端粒酶检测新方法

设计了一种发卡型核酸探针,结合脱氧核酶(DNAzyme)与支点介导链置换技术建立了一种检测端粒酶的新方法.该发卡型探针通过阻碍G-四链体的形成来抑制DNAzyme的过氧化物酶活性.当体系中的端粒酶引物TS被催化延伸后,可以通过链置换反应破坏该发卡结构,从而释放出自由的DNAzyme以催化过氧化氢氧化ABTS2-,产生可被检测的吸收信号变化.实验结果表明,应用该方法可以检测低至500个Hela细胞等当量的端粒酶,且该方法操作简单、不需要荧光标记和复杂的表面修饰,有望在肿瘤细胞端粒酶活性分析中获得广泛应用.

10～23脱氧核酶沉默Survivin基因表达诱导人肝癌细胞的凋亡

目的研究脱氧核酶沉默Survivin表达对人肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响。方法合成针对Survivin基因的"10～23"型脱氧核酶及其类似物;转染肝癌细胞;RT-PCR检测脱氧核酶细胞内Survivin mRNA的切割作用;荧光免疫法测定脱氧核酶对Survivin蛋白表达影响;流式细胞术检测脱氧核酶对肝癌细胞凋亡的影响。结果"10～23"型脱氧核酶及其类似物成功转染入肝癌;非修饰脱氧核酶(DzT)和修饰的脱氧核酶(DzTi)能有效抑制肝癌细胞的生长(P<0.05);DzT和DzTi在胞内能有效地切割Survivin mRNA,DzTi比DzT的切割活性更显著;荧光免疫法测的DzT和DzTi能显著的下调Survivin蛋白水平(P<0.01);流式细胞术结果提示,DzT和DzTi细胞凋亡率明显升高出现凋亡峰(P<0.05);DzT和DzTi组细胞出现细胞周期阻滞,表现为G0/G1细胞所占比例上升,S期细胞所占比例下降。结论脱氧核酶能有效沉默Survivin mRNA表达,抑制Survivin蛋白表达和促进肝癌细胞凋亡。