科研公共平台膜片钳室建设和仪器管理

中医药是中华文明的瑰宝,是世界人民的宝贵财富,传承和发扬中医药文化是每位中医药人的光荣使命。近年来中医药基础研究越来越得到重视,膜片钳技术作为新兴工具出现了。1976年,德国马普生物物理化学研究所Erwin Neher和Bert Sakmann合作发明了膜片钳技术,推动了神经科学、生理学、细胞生物学等学科的发展。膜片钳技术是利用玻璃微电极与细胞膜表面形成紧密接触,经过放大器等系统记录电压或者电流信号的实验方法[1],其本质是研究细胞膜上离子通道的工具。

手动膜片钳检测盐酸罗哌卡因及其右旋异构体对HEK293细胞hERG电流的影响

目的研究比较盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流的影响。方法用手动膜片钳检测转染后hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞电流,多菲莱德做阳性药,将盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体依次稀释成30.00、10.00、3.33、1.11、0.37μmol·L^(-1),依次作用于细胞,记录电流变化,计算抑制率。结果盐酸罗哌卡因0.37、1.11、3.33、10、30μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(6.12±0.30)%、(13.04±1.20)%、(19.21±0.33)%、(35.56±0.66)%、(65.37±4.17)%,IC_(50)为19.482μmol·L^(-1)(n=15)。盐酸罗哌卡因右旋异构体0.37、1.11、3.33、10.00、30.00μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(4.13±3.43)%、(7.34±5.60)%、(9.49±2.75)%、(16.60±0.87)%、(31.36±1.45)%,IC_(50)>30μmol·L^(-1)(n=15)。阳性对照药品多菲莱德0.00185、0.00556、0.01667、0.05000、0.15000μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(7.81±2.77)%、(19.67±1.88)%、(57.16±4.39)%、(89.71±3.55)%、(99.66±0.89)%、IC_(50)为0.015μmol·L^(-1)(n=15)。结论和阳性对照药品多菲莱德比较,盐酸罗哌卡因对hERG通道为弱抑制作用,盐酸罗哌卡因右旋异构体对hERG通道为无明显抑制作用。

穿孔膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞K^+电流技术初探

常规全细胞膜片钳模式形成的同时,细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失,此现象对小细胞的影响更为明显。穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性,它使细胞内环境保持稳定,利于研究胞内信息传导机制,并可改善常规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏,有望提高实验的成功率。本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上记录的全细胞K+电流和由大电导钙激活钾通道BKCa所介导的自发瞬时外向电流ISTOCs。

膜片钳技术在生物医学研究中的联合应用及其发展趋势

膜片钳技术是研究离子通道电活动的“金标准”,不仅用于研究生理和病理条件下细胞膜离子通道电生理特性和膜电位的变化,还广泛应用于分析药物作用离子通道机制、优化化合物结构以及评价药物毒性等方面。目前,膜片钳技术已成为现代细胞电生理学研究的常规方法,广泛应用于神经科学、心血管科学、药理学、细胞生物学等领域并取得了丰硕的研究成果。近年来,随着基因组学、光遗传学、质谱技术和芯片技术等的不断涌现和日益完善,这些新技术与膜片钳技术的联合应用极大促进了以离子通道为靶点的药物研发和对疾病发病机制的深入理解,进一步拓宽了生命现象的研究维度,促进了生命科学研究的发展。

穿孔膜片钳方法记录L型钙通道及脱氢紫堇碱对其影响的研究

目的比较全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录大鼠心室肌细胞L型钙通道电流随时间经过的变化差异,并观察脱氢紫堇碱对L型钙通道的影响。方法采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录急性分离的大鼠心室肌细胞L型钙通道电流。结果采用全细胞膜片钳法记录到的L型钙通道电流峰值在15 min内衰减了(34±23)%(n=10),采用穿孔膜片钳方法记录到的L型钙通道电流峰值15 min内仅衰减了(2.7±3.4)%(n=9);采用穿孔膜片钳方法能够记录到人参皂苷Re(100μmol.L-1)的抑制效应,而采用全细胞膜片钳方法产生的电流衰减几乎完全掩盖了人参皂苷Re的效应。脱氢紫堇碱(10,100μmol.L-1)能够抑制L型钙通道的电流峰值,抑制率分别为(9±7.5)%(n=5);(28.6±8.5)%(n=5)。结论穿孔膜片钳方法较全细胞膜片钳方法在对L型钙通道电流记录方面更具稳定性和准确性,脱氢紫堇碱能够浓度依赖性的抑制L型钙通道。

膜片钳技术在神经元电信号测试中的进展

介绍了近年来膜片钳在神经元膜离子通道电信号和信号转导测试中的应用 ,给出了它在神经元及相连神经元实验中的进展情况 。

穿孔膜片钳技术在离子通道电流研究中的应用

目的:传统的全细胞膜片钳技术在离子通道电流的记录中存在机械稳定性差,对细胞的损伤大,以及胞内液的被渗析影响与细胞内信号转导和离子通道调控有关的第二信使物质的正常运行。而穿孔全细胞膜片钳技术应用二性霉素B或制霉菌素在细胞膜上形成特定的孔道,选择性地允许一些离子和大分子物质,从而使细胞内环境保持相对稳定,在一定程度上弥补了上述缺陷,实验成功率也相应提高。本文就穿孔膜片钳技术在全细胞离子通道电流记录中的应用进行探讨。

棉铃虫幼虫神经细胞的急性分离培养及其电压门控通道的膜片钳研究

探索了棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫神经细胞的急性分离与体外培养的条件 ,并利用全细胞膜片钳技术首次对棉铃虫幼虫急性分离神经细胞的电压门控性钠、钾和钙通道的基本电生理学特性进行了研究。结果表明 ,棉铃虫幼虫中枢神经细胞在TC 10 0、L 15和Grace培养基中均可贴壁生长 ,在DMEM培养基中基本不能存活。在TC 10 0培养基分别与其它三种培养基按一定比例混合形成的培养液中 ,TC 10 0与L 15等量混合培养液更适合于神经细胞的生长。全细胞电压钳条件下 ,可分别记录到电压门控性钠、钾和钙通道电流。钙电流特征为高电压激活、缓慢失活 ;钠电流对河豚毒素敏感 ;钾电流可被细胞外液中的氯化四乙胺和 4 氨基吡啶抑制。

一种改进的适用于膜片钳记录的成年大鼠海马神经元急性分离法(英文)

本文建立了一种快速、可靠的急性分离成年大鼠海马神经细胞的方法。此法可将实验大鼠的年龄提高到500 d以上,体重300 g以上;不损伤神经细胞膜的电学特性;形态上有差异的细胞易于分辨。用膜片钳技术的单通道和全细胞模式证实,在本实验条件下,约95％左右的健康细胞均能形成高阻抗封接,并成功地记录了电压依赖性钾、钠、钙通道,外向整流氯通道和大电导的钙激活钾通道电流。

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。

小鼠海马神经元急性分离和膜片钳技术的应用

为了获得适用于膜片钳实验技术的单个海马神经元,应用酶消化及机械分离法,急性分离出生10～13 d的昆明小鼠得到单个海马神经元.通过倒置显微镜直接观察和全细胞膜片钳技术分别对分离得到的海马细胞的形态学和电生理学特征进行研究.通过实验可得,急性分离所得活性较好的海马神经元胞体具有锥形胞体和顶树突特征,立体感强.在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流及钠、钾通道电流.由实验结果可知,该方法可以得到形态和生理特征良好的单个海马神经元,证实该方法适用于膜片钳技术的研究,对深入探讨药物、物理因子等对海马离子通道及信号转导机制的作用有重要的应用价值.

海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术

本文较为详细地介绍了海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术 ,对其关键步骤和需要注意的问题进行了重点说明 ,同时对CA1区锥体神经元突触活动的特点、电压门控性Ca2 +通道以及谷氨酸 (glutamate ,Glu)、γ 氨基丁酸 (GABA)受体通道电流性质等进行了观察和分析。实验结果为采用海马脑片盲法膜片钳全细胞记录技术研究海马神经元离子通道动力学性质和中枢神经系统药物对突触活动的影响提供了可靠的依据。

河蟹眼柄神经分泌细胞离子通道的膜片钳研究

采用全细胞膜片钳技术对培养12～24小时不同形态河蟹眼柄视神经节端髓X器官(MTXO)神经分泌细胞离子通道进行了研究。结果表明 ,河蟹眼柄MTXO中分布的A、B、C三种类型神经分泌细胞均可记录到由内向电流和外向电流组成的正常全细胞电流。内向电流由高电压激活钙离子通道电流 (ICa)和对TTX敏感钠离子通道电流 (INa)组成。ICa 的激活电压为 -30mV,在0～ +20mV电压下达到峰值 ,在 -40mV和 -70mV保持电压下记录的ICa 激活阈值、初始峰值及I -V曲线无明显差别。外向电流明显 ,幅值较大 ,包括对4-AP敏感的快速激活、快速失活钾离子通道电流 (IA)和对TEA敏感的缓慢激活、缓慢失活钾离子通道电流 (Ik)。正常蟹种、二龄成蟹和早熟蟹种MTXO神经分泌细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道 ,通道电流和电压特征无明显区别。

膜片钳技术在成年大鼠海马脑片应用的初步研究

目的:制备成年大鼠海马脑片,使其适应于膜片钳全细胞记录,并观察海马锥体神经元的电生理特性。方法:选200 g左右的成年SD大鼠,雌雄不拘,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,四肢固定,剪开胸腔,夹闭下腔静脉,以0℃切片液进行心脏灌注,断头,取下全脑,置入0℃切片液中冰镇3 min,再修块,切片,厚度约350μm,移入37℃预热的人工脑脊液中孵育1 h后,转入23℃水浴中孵育30 min备用。倒置相差显微镜和红外微分干涉相差显微镜观察脑片的神经元形态;全细胞膜片钳记录脑片神经元的电生理学特性。结果:海马CA1区神经元光泽度好,立体感强且突起明显;在进行膜片钳全细胞记录时,封接顺利,并且可以记录到电流和动作电位的变化图形。结论:本方法制备的成年大鼠脑片,可以耐受离体后缺血缺氧造成的损伤,保持电生理活性而适应膜片钳全细胞记录模式。

适用于膜片钳研究的成年大鼠脑神经元急性分离法

研究一种结合酶消化和机械分离的方法，用于快速、可靠地急性分离成年大鼠海马神经元。此法可将实验大鼠的年龄提高到５００－６００ｄ，不损伤神经元的突触结构和细胞膜的电学特性。形态上有差异的细胞易于分辨。用膜片钳技术证实，链霉蛋白酶未破坏神经元上的Ｎ－甲基－Ｄ－门冬氨酸和乙酰胆碱受体通道，约有９５％的神经元可观测到内向电流活动，单通道电流的电导值分为２０ｐｓ和３０ｐｓ。

苦皮藤素IV麻醉机理的膜片钳研究

用膜片钳技术研究了植物杀虫剂苦皮藤素Ⅳ对棉铃虫幼虫离体培养中枢神经细胞钠通道门控过程的影响。结果表明,苦皮藤素Ⅳ对钠通道具有迅速的浓度依赖性阻滞作用,使电流-电压关系(I-V)曲线上移。0.1、1和10μmol/L苦皮藤素Ⅳ作用3min后,分别使钠电流峰值(INaMax)较给药前下降27.35%±4.05%、62.72%±2.81%和88.53%±5.56%(P<0.05),1和10μmol/L苦皮藤素Ⅳ还使钠通道的激活电压和峰电压分别向正电位方向移动了10mV和20mV左右。同时比较研究了利多卡因对棉铃虫幼虫神经细胞钠通道的影响,利多卡因对钠通道也具有阻滞作用,但有效作用浓度明显高于苦皮藤素Ⅳ。1、70mmol/L的利多卡因注射液作用3min后,使INaMax较用药前下降21.21%±2.52%和95.63%±2.10%(P<0.05)。苦皮藤素Ⅳ对钠通道门控过程的影响与利多卡因等局部麻醉剂非常相似,因此,对钠通道的阻滞作用可能是其发挥麻醉作用的重要机制。

通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析

本文介绍了一种膜片钳微电极内插管进行胞内透析的方法。利用通用的微电极夹持器在其抽吸负压的侧管上方钻一斜孔直通夹持器中央管腔。插入由微量移液管头拉制成的细管 (外径约 0 1mm) ,后者与Ag AgCl电极一起伸出夹持器口端。通过相连的注射器 ,可以很方便地进行电极内液置换及胞内药物透析。此法和二次钳压技术及国外介绍的微插管电极内液置换法相比 ,更加简便易行 。

大鼠皮层神经元膜片钳单通道记录模型

目的：介绍我室建立的大鼠大脑皮层神经元膜片钳单通道记录模型。方法：大鼠大脑皮层神经元急性分离和膜片钳单通道记录技术。结果：急性分离的皮层神经元经鉴定成活良好，记录的Ｌ－，Ｎ－和Ｔ－型钙通道的单通道电活动与文献报道基本一致。结论：我室建立的膜片钳实验方法是可靠的。