原发性膜性肾病自身抗原的研究进展

原发性膜性肾病(PMN)是一种自身免疫性肾小球疾病。目前,研究人员对其自身抗原的研究给予了广泛关注。继M型磷脂酶A2受体和1型血小板反应蛋白域7A后,随着激光显微切割肾小球联合质谱分析等技术的应用,研究者们又陆续发现了5种PMN自身抗原及相关抗体,这些自身抗原及抗体的发现极大地推进了对PMN发病机制和临床实践的认识。本文对PMN自身抗原的研究进展进行综述。

自身免疫性疾病自身抗原的研究进展

自身抗原是自身免疫性疾病(AD)发病进程中的重要因素,诱导针对自身抗原的免疫应答进而破坏自身组织是AD的主要特征。AD治疗一般以对症治疗及控制病情发展为主,可选临床药物存在一定限制。近年人们对自身抗原的研究不断深入,通过抗原特异性免疫疗法精准防治AD能够避免影响机体正常免疫应答,有望为AD诊断、治疗及预防提供新的思路。本文将结合近期研究进展,对AD的自身抗原及针对自身抗原的治疗方法进行概述。

原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A觹0201限制性CD8+CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础。方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4+T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A觹0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A觹0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A觹0201限制性CD8+CTL细胞表位。结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A觹0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A觹0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A觹0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性。结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA穴159～167aa)和LLAEIETDKA穴165～174aa雪是PBC患者体内HLA-A觹0201限制性的CD8+CTL表位。

自身抗原SS-B/La序列结构分析及抗原性预测

目的 :通过计算机分析SS B/La的氨基酸序列及可能的抗原性位点。方法 :将自身抗原SS B/La的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包 ,分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性 ,模拟其二级结构 ,预测其主要抗原位点。结果 :SS B/La的氨基酸 80～ 10 0位、2 2 0～ 2 40位和 30 0～ 340位可能具有较强的抗原性。结论 :通过计算机分析SS B/La的抗原性位点 ,为进一步确定SS B/La的抗原优势表位 。

自身抗原Ro-60 cDNA克隆构建及表达

目的：采用基因工程方法克隆并表达自身抗原Ｒｏ－６０融合蛋白。方法：用ＰＣＲ法克隆Ｒｏ－６０多肽分子的ｃＤＮＡ，经测序证实后定向插入表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ，并经酶切电泳鉴定。进而导入大肠杆菌ＪＭ１０９中表达重组融合蛋白。结果：经蛋白印迹证实，重组融合蛋白具有Ｒｏ抗原性。结论：重组融合蛋白可用于对Ｒｏ抗原表位的精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性及制备重组抗原用于临床检测。

风湿性心脏病自身抗原RHDAG1的获得与鉴定

目的探索用风湿性心脏病患者噬菌体表达文库构建和免疫筛选方法来研究风湿性心脏病的自身抗原候选分子。方法提取风湿性瓣膜性心脏病患者心肌组织总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成长链cDNA,用噬菌体载体构建表达文库,用风湿热患者血清免疫筛选该库,对筛选获得的自身抗原基因进行鉴定、生物信息学分析、体外表达、Western blotting鉴定和免疫反应结合性分析。结果成功构建了风湿性心脏病患者心脏组织噬菌体表达文库,原始文库滴度为3.3×106pfu/ml,重组率为99%,81%外源片段大于1kb。通过免疫筛选方法获得了自身抗原RHDAG1,该自身抗原与人类角蛋白18同源,能与活动性风湿热患者血清和风湿性心脏病患者血清结合,而与体检健康人血清无结合。结论构建噬菌体展示文库方法可以有效地用于筛选和获得风湿性心脏病患者自身抗原;本研究提示自身抗原RHDAG1可成为风湿热和/或风心病的候选分子标志物。

自身抗原52 kD-Ro/SSA的序列分析及抗原性预测

目的：分析自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的序列结构，预测其抗原位点。方法：将自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的氨基酸序列输入“蛋白质结构预测”软件包，分析蛋白质分子亲水性、表面可及性、柔性，并模拟其二级结构，预测其主要抗原位点。结果：自身抗原５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ是多抗原位点，其氨基酸序列中１２０～１３０、３００～３２０、３６０～３８０位间抗原性较强。结论：确定５２ｋＤＲｏ／ＳＳＡ的抗原优势表位，为研究抗原抗体间相互作用及其疾病机制打下基础。

自身抗原60 kd-Ro/SSA序列分析及抗原性预测

抗自身抗原Ｒｏ／ＳＳＡ的自身抗体出现于系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）、干燥综合征（ＳＳ）等自身免疫病患者血清中，可能参与疾病的发病机制。我们已克隆获得６０ｋｄ－Ｒｏ／ＳＳＡ的基因，并在体外培养中得到表达［１］。我们应用蛋白质数据库与序列分析软件程序包，分析...

类风湿性关节炎新型自身抗原视黄醇结合蛋白1类似蛋白相关分析研究

目的:类风湿性关节炎(RA)是一种全身性自身免疫性疾病,但其发病原因尚不清楚。因此,迫切需要找到诱发此病的相关抗原,但国内外鲜有关于新的自身抗原的报道,本课题组运用克隆技术发现新型自身抗原。方法:从滑膜细胞中提取mRNA,构建c DNA文库,取类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的抗体作为探针,筛选c DNA基因库,得到阳性克隆后测序分析,寻找已知相似基因,进而分析蛋白质的构造和Northern印迹杂交(Northern blotting)。结果:发现新型自身抗原c DNA克隆,其与视黄醇结合蛋白1(RBP1)有36.5%的氨基酸序列相同,并发现AT-rich interaction domain,chromo domain,A+T-hook以及TAF homology domain这些特殊的蛋白质构造。因此将其命名为视黄醇结合蛋白1类似蛋白(RBP1 like protein,Rbik)。Rbik RNA不仅表达于滑膜,也表达于心脏、小肠、肌肉等多个器官组织中。结论:此自身抗原的发现可为类风湿性关节炎的实验诊断和治疗提供新的可能指标和靶点。

自身抗原gp210融合蛋白的重组表达及其临床应用研究

目的重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的临床诊断和病情监测。方法针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a(+),构建重组表达载体PET28a(+)-gp210,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2+亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a(+)-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。

人细胞核自身抗原精子蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:获得纯化的人细胞核自身抗原精子蛋白(hNASP)及其多克隆抗体,为其功能研究做准备。方法:提取人睾丸组织总RNA,用自行设计的引物,PCR扩增hNASP的一段序列,PCR产物经TA克隆后,通过BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆到pET-28 a(+)中。在E.coliBL21中,用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达H is融合蛋白。样品超声处理后,经镍离子亲和树脂进行亲和层析纯化。用纯化的重组蛋白免疫家兔获取多克隆抗体。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及表达的重组蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA证实免疫家兔后获得高效价的抗体。结论:用上述原核生物表达的方法可以得到纯化的hNASP蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔也能获得高效价的抗体。

自身抗原胰岛素皮下注射诱导1型糖尿病模型小鼠的免疫耐受作用

目的探讨自身抗原诱导免疫耐受防治1型糖尿病(IDDM)的方法及机制。方法将32只8周龄BALB/c小鼠随机分为4组:空白对照组、模型对照组、皮下注射给药组和灌胃给药组,各8只。各组小鼠每日腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40 mg.kg-1,连续5 d,建立IDDM模型。皮下注射给药组于造模前1 d每只皮下注射胰岛素100μg,以后每周给药1次,连续4周。灌胃给药组于造模前1 d每只灌胃给予胰岛素150μg,以后每周给药2次,连续4周。每周测定血糖值。6周后处死小鼠,取胰腺组织HE染色观察胰岛组织变化,四唑盐比色法(MTT法)测定小鼠脾淋巴细胞增殖反应。另取脾细胞采用荧光激活细胞分类技术(FACS)分析CD4+CD2+5T细胞亚群比例。结果与模型对照组比较,皮下注射给药组血糖值明显降低(P<0.05),而灌胃给药组则差异无显著性。胰腺HE染色发现模型对照组胰腺有明显的炎性细胞浸润,而皮下注射给药组胰岛基本无浸润。与空白对照组和模型对照组比较,皮下注射给药组脾淋巴细胞增殖能力降低(P<0.05)。FACS显示皮下注射给药组CD4+CD2+5T细胞亚群比例明显高于空白对照组和模型对照组。结论皮下注射自身抗原胰岛素可以诱导免疫耐受防治糖尿病,其机制与促进体内CD4+CD2+5T细胞亚群产生相关。

自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析

探讨自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位，为疾病机制的研究提供依据，根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析。采用ＰＣＲ法克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ多肽片段的ｃＤＮＡ，定向插入表达载体ＰＧＥＸ－５Ｘ－１，并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白，用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化，经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应，结果表明片段Ｒｏ５２３具有较强的抗原性。

树突状细胞和调节性T细胞在自身抗原所致小鼠免疫耐受模型中的作用

目的:探讨树突状细胞(DC)及CD4+CD25+调节性T细胞在胰岛素自身抗原sc所诱导的小鼠胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的免疫耐受中的重要作用．方法:低剂量链脲佐菌素(STZ)(40 mg／kg)ip 连续5次在Balb／c小鼠体内建立IDDM模型,胰岛素(100 μg)与不完全弗氏佐剂(IFA,1:1)混合液sc 1次／wk,连续4 wk．模型建立后每周测定血糖,5 wk时处死动物,取胰腺进行病理组织学检查．分离骨髓DC前体及脾脏T淋巴细胞并进行体外培养．采用流式细胞术测定DC表型和CD4+CD25+调节性T细胞,以同种淋巴细胞刺激实验检测DC刺激淋巴细胞增殖功能．结果:胰岛素sc 4 wk后可明显降低小鼠的血糖,与模型对照组有极显著差异(13．79± 2．71 mmol/L vs 20．98±1．43 mmol／L,P<0．05), 胰岛内炎症细胞浸润减少,组织结构完整． IDDM模型建立后,小鼠骨髓来源树突状细胞CD11c表达为26．4％,DC分化异常,而正常小鼠CD11c表达为47．5％;混合淋巴细胞反应中DC刺激能力减弱,刺激指数分别为1．47± 0．01和1．32±0．01(刺激细胞和反应细胞比例分别为1:10和1:20),与正常小鼠相比,差别具有极显著性意义(P值均小于0．01)．脾脏 CD4+CD25+调节性T细胞减少到1．43％,而正常小鼠为5．09％．与此相反,胰岛素自身抗原连续应用后,不仅使血糖得到控制,表达 CD11c的树突状细胞数量增加,CD86和MHC- Ⅱ表面分子表达降低到26．6％和28．8％,刺激淋巴细胞反应的能力弱于正常DC,但强于模型小鼠的DC,刺激指数分别为2．30±0．06(1: 10)和2．17±0．02(1:20),CD4+CD25+调节性T 细胞数量上升到7．15％．结论:胰岛素sc可预防STZ所致小鼠IDDM的发生,自身抗原可以通过改善功能异常的树突状细胞．诱导CD4+CD25+调节性T细胞分化在模型小鼠体内建立免疫耐受．

类风湿关节炎新自身抗原:磷酸丙糖异构酶的初步研究

目的寻找类风湿关节炎的疾病相关的新的自身抗原。方法从已知的类风湿关节炎滑膜组织中高表达的蛋白分子中,通过淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测,筛选出类风湿关节炎特异性自身抗原,并分析血清中抗原水平与疾病活动度的相关性。结果磷酸丙糖异构酶能特异性刺激RA外周血淋巴细胞增殖并分泌INF-γ、TNF-α及IL-17等细胞因子;RA血清中磷酸丙糖异构酶含量明显高于正常人,且血清磷酸丙糖异构酶水平与疾病活动度评分呈明显正相关。结论磷酸丙糖异构酶是类风湿关节炎新的疾病相关性自身抗原。

人La自身抗原蛋白与肝炎病毒的关系

0 引言 乙型和丙型肝炎呈全球分布,目前全世界有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV),3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV),其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎,少数还发展成肝硬化甚至肝癌,对人类健康造成极大危害,至今缺乏有效的控制.

风湿性心脏病患者瓣膜组织自身抗原变化与IL-10、TGF-β1血清浓度变化之间的关系

目的:探讨风湿性心脏病(RHD)患者瓣膜组织自身抗原细胞变化及外周血指标细胞的检测结果与IL-10、TGF-β1血清浓度间的关系。方法:对63例RHD患者和63例健康志愿者清晨空腹采集抗凝外周静脉血,应用流式细胞检测法对CD4+、CD25+、调节性T细胞的标志性分子(Foxp3 Treg)的比例进行检测,ELISA检测IL-10、TGF-β1的浓度;构建风湿性心脏病基因表达文库筛选相应抗原。结果:自身抗原RHDAG1与对照组间具有明显的差异,RHD患者血清Treg比例低于对照组样本中的相关数据,IL-10、TGF-β1血清浓度的比较具有差异性,组间比较具有统计学差异。结论:自身抗原RHDAG1的表达对RHD的进展有一定作用,对外周血相关指标的浓度及Treg细胞变化的检测对RHD的诊断具有一定的临床意义。

自身抗原PDC-E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

目的用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断。方法针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒。IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白。经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的免疫原性。结论获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具。