猪伪狂犬病病毒变异株传代致弱JS18-150株的获得与鉴定

为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示,在CEF上连续传代后,JS18株的gI、gE、US9基因缺失,获得的JS18-150株毒力已致弱,在CEF上适应性显著提高,与JS18株生长动力学相似;将JS18-150株以107.0TCID50/mL接种仔猪,所有仔猪均未观察到任何临床症状,且体温均未超过40.5℃;JS18-150株以106TCID50/mL接种仔猪后能保护仔猪有效抵御JS18株和HBZL05株的攻击。结果表明,JS18-150株对仔猪安全性良好,可作为PRV弱毒疫苗研制的候选毒株。

化学致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株免疫性能研究

采用化学致弱剂致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株卵囊。将致弱的卵囊分别饲喂3组7日龄AA肉仔鸡进行免疫,免疫剂量分别为4×103,8×103,16×103个/只。首免7日龄,二免14日龄,二免剂量与首免相同。二免后第7 d用吉林野毒株卵囊进行攻虫,剂量为5×104个/只。攻虫后第7 d以存活率、相对增重率、病变值、抗球虫指数(ACI)、卵囊值、粪便计分等指标测定化学致弱剂致弱卵囊后免疫性能。结果表明:采用化学致弱剂致弱杂交F2株卵囊后的免疫效果明显高于非致弱免疫组和对照组,尤其免疫剂量为8×103个/只时致弱杂交F2株卵囊免疫效果最佳。

用反向遗传操作技术产生致弱的H5亚型重组流感病毒

选择一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) ,缺失其HA基因裂解序列的 4个碱性氨基酸、使HA裂解模式由高致病性的PQRERRRKKR↓GL突变为低致病性的PQRESR↓GL ,将修饰的HA基因克隆入转录 表达载体pHW2 0 0 0、构建质粒pHW5 2 4_HA ,将该毒株和H9N2亚型毒株的NA全基因分别克隆入pHW2 0 0 0 ,构建质粒pHW5 0 6_NA和pHW2 0 6_NA。将pHW5 2 4_HA与pHW5 0 6_NA或pHW2 0 6_NA组合、均用A WSN 33(H1N1)提供 6个内部基因 ,两个组合的 8个质粒分别共转染COS_1细胞 ,产生了H5N1和H5N2两个亚型的基因重排病毒。通过在鸡胚中的连续传代和适应 ,2个重组病毒血凝价上升到 1∶2 9、表面基因稳定、对 6周龄SPF鸡不表现致病性 ,H5N2重组病毒对鸡胚的毒力低于H5N1病毒。

日本血吸虫97kDa DNA疫苗与致弱尾蚴疫苗诱导免疫应答特征的比较研究

目的 对比观察日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因疫苗 (Sjc97DNA)与紫外线致弱尾蚴 (UVC)疫苗免疫C5 7BL 6小鼠诱导的抗感染保护力及免疫应答特征。 方法 以Sjc97DNA核酸疫苗经后腿胫前肌免疫C5 7BL 6小鼠共 2次 ,每次间隔 3wk ,末次免疫后 3wk攻击感染日本血吸虫尾蚴 ;UVC疫苗接种同种小鼠后 5wk攻击感染上述等量尾蚴。均于攻击感染后 7wk计数虫负荷及肝卵负荷。并设空质粒对照及感染对照组。用ELISA分析免疫鼠攻击感染前后血清特异性IgG、IgA及亚型抗体水平 ,以及脾淋巴细胞体外诱生的细胞因子水平。 结果 Sjc97DNA疫苗及UVC疫苗免疫小鼠均诱生出以Th1型免疫应答为主的IL 2、IFN γ及特异性抗AWA、SEAIgG2a、IgG2b亚型及IgA抗体 ,UVC疫苗组小鼠各细胞因子及抗体水平均显著高于Sjc97DNA疫苗组 ,但两疫苗组均未测及IL 4。攻击感染后 ,Sjc97DNA疫苗组的减虫率 3 6.3 %、减卵率 42 .4% ,明显低于UVC疫苗组的 66.9%和 75 .6%。攻击感染后 7wk ,两疫苗组小鼠Th2型免疫应答虽有所增强 ,但仍以Th1型免疫应答占优势 ;而空质粒对照组和感染对照组小鼠则以Th2型免疫应答为主。 结论 核酸疫苗与紫外线致弱尾蚴疫苗均能诱导产生抗感染免疫保护力 ,致弱尾蚴疫苗的免疫保护力高于Sjc97DNA。两疫苗诱导的抗感染?

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱 ,揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中 ,其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析 ,发现细胞毒在第 7代以前 ,VP2基因序列没有改变 ,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达 10 0 % ;细胞毒第 8代 ,有个别核苷酸发生了改变 ,但没有影响氨基酸序列 ;细胞毒第 9代是变化复杂的过渡代 ;10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu_1氨基酸序列同源性达 97% ;以后的细胞适应毒至 2 0代 ,其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对 4周龄SPF鸡致死率为 6 4 % ,细胞毒第 5代的致死率为 6 0 % ,而 2 0代毒对鸡无致病性 ,在鸡体内连续传代

鸡传染性法氏囊病超强毒致弱株的生物学特性研究

将vvIBDV国内分离株-G株经SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞连续传代致弱，得到适应细胞的致弱株。暂命名为IBDVGt。其毒价为2.0×108PFU／ml以上，具有较好的抗原性，对鸡无致病性。返祖试验及病理组织学试验证明，致弱株可在鸡体内连续传至4代，未有返强现象。

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。 方法 用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。 结果 筛选出 6种蛋白分子基因 :3 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。

用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJI株

将新城疫病毒ZJI株基因组cDNA全长分成7个片段,依次连接并克隆至TVT7R转录载体中,构建了含ZJI株全基因组cDNA的转录载体(pNDV/ZJI),pNDV/ZJI与3个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了具有感染性的新城疫病毒粒子。设计两对引物,经overlapPCR方法将该毒株F蛋白裂解位点的112、115和117位碱性氨基酸突变成弱毒株特征的非碱性氨基酸后,替换pNDV/ZJI上的对应序列,构建了转录载体pNDV/ZJIFM,将pNDV/ZJIFM与3个辅助表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,成功拯救出了致弱的基因VIId型鹅源新城疫病毒NDV/ZJIFM,获救病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)大于120h,同时该病毒的脑内接种致病指数(ICPI)为0.16,上述结果表明,获救病毒的毒力已被致弱,是一个较为理想的疫苗候选株。

致弱尾蚴免疫血清与日本血吸虫不同发育阶段抗原免疫反应性的研究

目的 通过比较分析日本血吸虫不同发育阶段抗原的异同 ,并以致弱尾蚴免疫血清识别不同发育阶段抗原 ,筛选具有保护性免疫作用的抗原分子。方法 分离制备日本血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵、尾蚴、雄性成虫、雌性成虫等不同发育阶段的抗原 ;采用ELISA分别测定正常尾蚴感染兔血清、紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清抗原的抗体水平 ;通过SDS PAGE电泳和免疫印迹技术 ,分析正常尾蚴感染血清与紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清对不同发育阶段的免疫反应性。结果与结论 SDS-PAGE结果显示未成熟虫卵抗原、成熟虫卵抗原、尾蚴抗原、雄性成虫抗原、雌性成虫抗原蛋白之间互有异同。间接ELISA试验显示致弱尾蚴免疫血清同样能诱导宿主产生高滴度的抗体水平。致弱尾蚴免疫血清共筛选出 2 3种具免疫学活性的抗原分子 ,分子量分别为 :2 4 .5kDa、2 8kDa、36kDa、4 3kDa、4 4kDa、4 8kDa、5 4kDa、5 8.5kDa、6 0kDa、6 2kDa、6 6kDa、6 8kDa、70kDa、75kDa、79kDa、85kDa、87kDa、91kDa、95kDa、97kDa、10 5kDa、10 8kDa、110kDa。其中未成熟虫卵和成熟虫卵抗原各占 11种 ,尾蚴抗原分子 4种 ,雄性成虫抗原分子 3种 ,雌性成虫抗原分子 6种 。

UV致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6小鼠免疫保护作用的研究

目的研究紫外线(UV)致弱日本血吸虫尾蚴诱导C57BL/6小鼠的免疫保护作用。方法分别观察不同UV强度(300、400和500μW/cm2照射的日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤免疫)、不同免疫剂量(8、24和300条UV致弱尾蚴经腹部皮肤免疫)、不同免疫位点(300条UV致弱尾蚴经腹部和耳廓皮肤免疫)和不同免疫次数(100条UV致弱尾蚴经腹部皮肤免疫3次)诱导C57BL/6小鼠抗血吸虫攻击感染(40条正常尾蚴经腹部皮肤感染)的保护力。同时观察免疫后小鼠的体液免疫应答变化。结果300、400和500μW/cm2UV照射的日本血吸虫尾蚴免疫C57BL/6小鼠诱导产生的减虫率分别为2.72%、11.37%和10.38%;8、24和300条致弱尾蚴免疫小鼠诱导产生的减虫率分别为38.67%、7.54%和16.36%;300条致弱尾蚴经腹部和耳廓皮肤免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为16.36%和16.14%;100条致弱尾蚴免疫3次,诱导小鼠产生减虫率为4.88%。对300条UV照射尾蚴免疫后小鼠的体液免疫应答动态观察显示,与感染对照组相比,免疫组血清中可溶性成虫抗原(SWA)和可溶性虫卵抗原(SEA)特异的IgG于免疫后2周开始升高,正常尾蚴抗原(SCA)特异的IgG于免疫1周后开始升高,SWA和SCA特异的IgG随免疫次数的增加而升高。结论UV致弱日本血吸虫尾蚴免疫C57BL/6小鼠能诱导其产生高水平的体液免疫应答,但保护力水平较低,提示C57BL/6小鼠为对UV致弱日本血吸虫尾蚴的低应答品系。

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒 (vvIBDV)Gx株进行培育 ,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱 ,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析 ,从而揭示vvIBDVGx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明 ,细胞毒在第 8代以前 ,VP5基因序列没有改变 ,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达 98%以上 ;细胞毒第 9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变 ;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu_1氨基酸序列同源性达 99% ;细胞适应毒传至 2 0代 ,其VP5基因序列不再改变。从而说明 。

犬细小病毒黑龙江株(CPV-YN)的分离、鉴定及致弱的研究

为研制犬细小病毒(CPV)致弱疫苗,本研究通过将犬的组织样品接种CRFK细胞进行病毒分离,并对分离毒株进行了一系列鉴定。鉴定结果显示,分离的病毒在CRFK细胞上可产生明显的细胞病变(CPE),并且电镜下可以观察到典型的细小病毒粒子;HA效价可达到1∶256。回归动物试验显示该分离株可导致犬出现明显的CPV感染症状,PCR鉴定也进一步确定所分离的病毒为CPV(命名为CPV-YN株)。将CPV-YN株接种CRFK细胞连续传代至110代,在传代过程中,病毒的滴度逐渐提高,由初始的105.5 TCID50/0.1 mL逐渐增加到107.1 TCID50/0.1 mL。同时,CPV对犬的致病力逐渐降低。免疫效力试验结果表明,CPV-YNR可以对用同源强毒攻击的犬提供免疫保护作用,可作为理想的疫苗候选病毒株。

反向遗传操作技术产生全禽源致弱的H5N1亚型禽流感病毒的免疫保护性试验

利用反向遗传操作技术产生致弱的8基因全禽源的H5N1亚型禽流感病毒rgF-H5△N1,经甲醛灭活制成油苗免疫SPF鸡和有母源抗体的商品鸡。比较拯救的重配病毒rgF-H5△N1和野毒H5N1亚型禽流感病毒油苗免疫后的抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标,评价其免疫和交叉免疫保护作用。结果表明:反向遗传操作技术为构建新型的流感疫苗株提供了更好的方法。

致弱日本血吸虫尾蚴感染小鼠皮肤组织中CD11c分子的动态表达

目的 探讨照射致弱的日本血吸虫尾蚴感染后小鼠皮肤组织中 CD11c分子的表达及在感染早期的动态变化。方法 2 4只小鼠分为两组 ,一组感染正常尾蚴 10 0条 ,一组感染紫外线照射致弱的尾蚴 10 0条 ,于感染后的第 1、2、6、8、10天取感染处的皮肤组织 ,应用免疫组织化学技术观察感染处皮肤组织中 CD11c分子的表达 ,并分析其动态变化。结果 小鼠感染处皮肤组织中有 CD11c分子的表达。感染正常和致弱尾蚴的小鼠皮肤组织内 CD11c分子的表达都于第 2天达到高峰 ,且致弱尾蚴组较正常尾蚴组高。感染后第 4～ 10天 ,两组中 CD11c表达都逐渐下降。结论 照射致弱的血吸虫尾蚴感染小鼠的皮肤组织高表达 CD11c分子。

黄瓜花叶病毒致弱卫星RNA对辅助病毒含量的影响

为研究黄瓜花叶病毒 (CMV)弱病毒株的基因组RNA和卫星RNA的含量变化 ,将一个卫星RNA介导的CMV弱病毒株NDM 1与CMV强毒株在 4种寄主系统上进行对照实验 .采用RNA点杂交方法 ,检测从早期接种病毒到大田释放阶段 (病毒接种后 5到 4 0天 ) ,寄主植物叶组织中的基因组RNA和卫星RNA的相对含量变化 .结果显示 :弱病毒株NDM 1基因组RNA和卫星RNA负荷量具有寄主效应和时间效应 ,趋势一致但程度不同 .它们在番茄上的变化规律不同于其他寄主而且病毒的致弱效果最明显 :在接种后的 5～ 10天 (生产上接种育苗的保护期 ) ,基因组RNA和卫星RNA相对含量上升 ,到 4 0天 (大田释放期 )时回落至最低 .比较NDM 1于不同时间在各寄主上的卫星RNA和基因组RNA的相对比值 :在 4 0天时 ,寄主番茄上的相对比值达 15 8,与在其他寄主上和其他时间段比较均有显著差异 ,即此时卫星RNA达到含量优势 .说明弱病毒NDM 1在番茄上的致弱机制为 :卫星RNA的大量复制对CMV基因组RNA产生抑制作用 .

传染性法氏囊病病毒超强毒株致弱的分子生物学特征

为了探索传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)超强毒株致弱的分子特征变化 ,采用 RT-PCR技术 ,从超强毒 ( vv IBDV)及其不同代次细胞传代致弱毒中扩增到编码 VP2蛋白的 c DNA高变区基因 ,并对其序列测定。将 vv IBDV及其致弱毒株 VP2高变区的氨基酸与其它血清 I型毒株比较 ,发现 vv IBDV与其致弱毒株在VP2高变区的 2 2 2、2 4 2、2 53、2 56、2 71、2 79、2 84、2 94、2 99和 3 0 0位氨基酸发生了改变 ,而这些氨基酸的变化使亲水区和七肽区发生了改变 。

I型犬腺病毒黑龙江株(CAV-H)的分离、鉴定及致弱的研究

为研究犬腺病毒(CAV)致弱疫苗的免疫原性,本研究将病犬的组织样品接种于MDCK细胞内,进行病毒分离及鉴定。鉴定结果显示,分离的病毒在MDCK细胞内产生明显的细胞病变(CPE),电镜下可见典型的腺病毒粒子;回归动物试验显示,该分离株可导致犬出现明显的CAV感染症状;PCR鉴定结果表明分离的病毒为CAV,命名为CAV-H株;将CAV-H株接种MDCK细胞连续传代至110代,在传代过程中,病毒滴度由初始105.0 TCID50/0.1 mL上升至107.0 TCID50/0.1 mL,而CAV对犬的致病力逐渐降低;免疫效力试验结果表明,CAV-H可对同源强毒攻击的犬提供完全的免疫保护作用,可作为理想的疫苗候选毒株。

紫外线致弱日本血吸虫尾蚴诱导BALB/c小鼠免疫保护作用研究

目的观察紫外线(UV)致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠免疫保护作用。方法辐照致弱日本血吸虫尾蚴,经腹部皮肤用UV致弱日本血吸虫尾蚴免疫诱导BALB/c小鼠,3周后进行攻击感染,同时设正常感染对照组。攻击感染6周后解剖小鼠,计算减虫率、减卵率,并观察虫体发育情况和肝组织细胞免疫应答情况。结果免疫组的减虫率和减卵率分别为37.90%和51.16%;免疫组小鼠体内虫体发育明显滞后于正常感染对照组内虫体;免疫组小鼠肝脏虫卵肉芽肿较正常组明显减少。结论UV致弱日本血吸虫尾蚴免疫BALB/c小鼠能诱导较好的免疫保护力。

小鹅瘟病毒常州株的鉴定及其致弱研究

从具有小鹅瘟典型症状、病变的病死雏鹅病料中分离到疑似小鹅瘟病毒常州株GPV/JSCZ/2004/01。通过磷钨酸负染经透射电镜观察可见细小病毒样病毒粒子,取死亡胚尿囊液浓缩后与GPV阳性多抗血清作用显示有阳性琼扩线出现,通过GPV特异性引物和相应的PCR试验,扩增出了特异性的DNA条带。研究结果表明分离到小鹅瘟病毒常州株。对常州株第3代毒进行番鸭胚半数致死量(ELD50)测定,为10-3.1/0.2mL。将分离毒GPV/JSCZ/2004/01感染鹅胚成纤维细胞(GEF)并连续传代培养,结果显示该毒株在细胞培养传代到第9代时能用单抗介导的间接免疫荧光试验检测到病毒在GEF的感染,表明产生了细胞适应毒(CZ-ca)。取第14代细胞毒(CZ-ca14)10倍比稀释测定TCID50,同时进行雏鹅致病性试验,结果显示细胞毒的TCID50为10-9.4/0.2mL,对雏鹅的发病率和死亡率为0,但原始分离株的发病率和死亡率为100%。研究结果进一步证明小鹅瘟强毒株通过连续细胞传代培养可以达到致弱效果,为小鹅瘟病毒致弱研究提供了参考。

番鸭新病——花肝病的研究 Ⅱ分离毒的致弱及灭活苗的保护试验

文章通过试验找出能适合于花肝病分离毒生长和繁殖的胚 ,并检测了自制灭活苗对雏番鸭的保护作用。将病料匀浆液接种到番鸭胚、鸭胚和鸡胚上分离病毒 ,并作病毒适应性试验 ,检测继代病毒对雏番鸭的致病性 ;制备了普通灭活苗、油佐剂灭活苗、左旋咪唑灭活苗 ,并分别进行了几种灭活苗的保护试验。结果表明 :分离毒在番鸭胚上能较好地适应并继代 ,随着代次增加 ,其毒力逐步下降 ;灭活疫苗对雏番鸭的保护试验表明 ,灭活疫苗有一定的保护作用 。