采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。

苯酚羟化酶生物转化吲哚及甲基吲哚研究

利用苯酚羟化酶基因工程菌PH_IND对吲哚及甲基吲哚进行生物转化.结果表明,除了3-甲基吲哚外,PH_IND能将吲哚、2-甲基吲哚、4-甲基吲哚和7-甲基吲哚转化成靛蓝类色素.采用薄层色谱和液相-质谱等手段对转化产物进行鉴定,结果表明,PH_IND转化吲哚和4-甲基吲哚得到的蓝色产物分别为靛蓝和4,4′-二甲基靛蓝,并推测了PH_IND转化吲哚及4-甲基吲哚的反应途径.采用表面响应法对PH_IND转化吲哚、2-甲基吲哚及4-甲基吲哚的条件进行了优化,在最优条件下,菌株PH_IND转化吲哚合成靛蓝的最大产量为93.74mg/L,其吲哚的转化效率为52.63%,且菌株PH_IND对2-甲基吲哚和4-甲基吲哚的最大转化率分别为67.66%和95.61%.

焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因多样性

研究了某焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的苯酚羟化酶大亚基基因(thelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase,LmPH)的多样性。通过温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)对比分析了氧化池4个区段(O1—O4)中降酚菌群LmPH的组成。它们的TGGE图谱完全一样,相似性为100%,表明该处理池中不同区段的降酚菌群的功能基因组成是高度相似的。以O4段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库,从中挑选了49个克隆测序。依据LmPH基因的DNA序列所推测的氨基酸序列完全相同的归为一类的原则,49个克隆被分为16种类型,其中优势LmPH基因主要有5种类型(多于4个克隆),而另外11种类型都只有1个克隆。与已知基因同源性超过90%的有7种类型,低于80%的有2种类型。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明,LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数(low-Ks)的LmPH,占所有克隆的92%。只有一个类型属于高亲和常数(high-Ks)的。因此,处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型,而且以编码低亲和常数的占优势地位,而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。

琼氏不动杆菌GXP04的苯酚羟化酶基因的克隆及序列分析

提取琼氏不动杆菌GXP 04的总DNA,采用限制性内切酶E coRⅠ酶切处理后,构建以pLAFR 3为载体的基因组文库。通过TA IL-PCR扩增出苯酚羟化酶的上游基因,对菌落原位杂交获得的11个转化子进一步鉴定,最终确定其中的8个转化子含有完整的苯酚羟化酶基因,选取其中的pLAFR 3-7对GXP 04的苯酚羟化酶基因的核苷酸序列进行分析,并对其蛋白质基本性质进行预测。

苯酚羟化酶基因工程菌转化4-乙烯基苯酚特性研究

4-乙烯基苯酚广泛用作食品的调味剂及聚4-乙烯基苯酚类聚合物等的合成。近年来,研究发现4-乙烯基苯酚是苯乙烯在小鼠和人体中的次要代谢物,具有肝毒性和呼吸毒性。因此,利用生物定向转化技术降低4-乙烯基苯酚的毒性将具有实际意义。文章考察了含苯酚羟化酶基因的工程菌PH_IND生物转化4-乙烯基苯酚的条件,确定其最优条件为:菌株PH_IND的OD600为2.5,4-乙烯基苯酚的浓度为1 mmol/L,葡萄糖浓度为20 mmol/L,缓冲溶液的pH为8。在该条件下,生物转化呈一级动力学趋势,反应180 min后,转化率为31%。分子对接结果表明,4-乙烯基苯酚可以和苯酚羟化酶大亚基的活性位点结合,液相色谱-质谱联用分析结果表明4-乙烯基苯酚被转化为4-乙烯基儿茶酚。

苯酚羟化酶的功能与调控研究进展

苯酚是一种广泛存在的芳香烃污染物,可以被一些环境微生物降解。苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羟化酶催化为邻苯二酚。苯酚羟化酶的转录主要由XylR/DmpR调控蛋白激活,另外在一些多组分苯酚羟化酶操纵子中也发现了起抑制作用的调控蛋白。综述了苯酚降解菌中苯酚羟化酶的功能和调控机制等方面的研究进展。

谷氨酸棒杆菌中苯酚羟化酶的鉴定及功能研究

【目的】鉴定谷氨酸棒状杆菌中ncgl 2588基因编码的苯酚羟化酶,并验证其在苯酚降解中的作用。【方法】构建谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,比较突变株和野生型菌株利用苯酚能力的差异;同时将ncgl 2588基因克隆到表达质粒pET28a中并转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组菌株原核表达,纯化并测定重组蛋白对苯酚的羟化作用。【结果】成功构建了谷氨酸棒状杆菌ncgl 2588基因缺失突变株,其在以苯酚为惟一碳源和能源的培养基中不能生长,而野生型谷氨酸棒状杆菌能正常生长;pET28a-ncgl 2588重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达分子质量为73ku的目的蛋白,此蛋白酶活为0.37mmol/(min·mg);在以苯酚为惟一碳源和能源培养谷氨酸棒状杆菌时,苯酚羟化酶得到最高表达,用其他芳香族化合物培养则苯酚羟化酶表达较少;进化树分析发现,谷氨酸棒状杆菌中的苯酚羟化酶与酵母Trichosporon cutaneum中的苯酚羟化酶序列同源性高达43%,远远高于与细菌中苯酚羟化酶的同源性。【结论】谷氨酸棒状杆菌中的ncgl 2588基因编码苯酚羟化酶,且该酶为可诱导酶,在苯酚降解中发挥着重要作用。

苯酚羟化酶基因的研究进展

苯酚的生物降解受多组分的基因调控,其中编码苯酚羟化酶的基因为苯酚降解的关键基因。本文主要介绍了苯酚降解菌的高效筛选法,苯酚羟化酶基因的组成调控,以及苯酚降解菌的分类种属,同时介绍苯酚羟化酶基因的研究近况。

苯酚羟化酶基因工程菌表达优化及特性研究

利用表面响应法优化苯酚羟化酶基因工程菌(PH_IND)的生长条件(种龄、接种量)及表达条件(诱导OD600、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度),并对其粗酶特性进行考察.实验结果表明,菌株PH_IND的最佳生长条件及表达条件为:种龄7.19h,接种量1.39%,诱导OD6000.54,IPTG浓度0.19mmol·L-1,诱导时间2.37h,诱导温度35℃,此时,苯酚羟化酶最大酶活力为0.6167U·mg-1.粗酶特性分析表明,苯酚羟化酶的最适pH和温度分别为8.0和40℃.Ba2+、Fe3+、Hg2+、Pb2+对苯酚羟化酶有明显促进作用,而Ca2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+对苯酚羟化酶有抑制作用.底物广谱性实验表明,苯酚羟化酶具有极强的芳香化合物降解能力.

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与Gen Bank中相应酶的序列一致性分别介于92%-100%和87%-100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有Lm PH(Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。

2,4-二氯苯酚羟化酶在大肠杆菌中的表达及靛蓝的生物合成

靛蓝是目前使用量最大的染料,也是具有多种药效的天然药物中的成分,生物合成法生产靛蓝具有广阔的前景。该文首次发现tfd B基因编码的2,4-二氯苯酚羟化酶具有转化色氨酸合成靛蓝的能力,为进一步研究其转化机理、优化转化工艺,作者构建了携带tfd B基因的工程菌E.coli BL21(28a-tfd B),对工程菌进行了培养和诱导表达,并进一步研究了工程菌对色氨酸的转化作用。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,tfd B基因已成功表达(55k),表达产物可将色氨酸转化为靛蓝。对培养基、诱导条件、诱导时间等转化条件的初步研究表明,采用色氨酸培养基(0.2 g/L色氨酸,2 g/L蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L Na Cl),IPTG诱导浓度0.2 mmol/L,诱导16 h,靛蓝浓度可达39.16 mg/L,这为重组E.coli BL21(p ET28a/tfd B)应用于靛蓝工业化生产的后续研究奠定了基础。

苯酚降解菌phen8的分离筛选及其16SrDNA序列分析

为筛选高效苯酚降解菌株 ,从炼油厂排污废水中分离筛选到 1株苯酚降解菌 phen8。利用PCR方法和琼脂糖凝胶电泳技术检测到 phen8菌中苯酚羟化酶基因片段的特异性条带 ,从基因水平上证实了 phen8菌的苯酚降解功能的遗传基础。应用PCR技术克隆到 16SrDNA片段 ,其核苷酸序列分析结果表明 ,该菌株的 16SrDNA全序列与斯氏假单胞菌DSM 5 0 2 2 7和DSM 5 0 2 38的同源性为 98% (在GenBank中的登记号为AF 2 8476 4)。初步确立了该菌在微生物系统发育学上的地位 ,暂定为假单胞菌 (Pseudomonassp .) phen8。

一株Diaphorobacter属细菌对苯酚的降解特性和代谢途径

Diaphorobacter sp.ZW12菌株具有较高的苯酚耐受性和降解能力,通过摇瓶培养在以苯酚为唯一碳源的基本培养基中考察该菌株对苯酚的耐受性和苯酚降解特性。结果表明,该菌株能在苯酚浓度为4.0g/L的培养基中生长,完全降解苯酚的最高浓度可达3.0g/L。其最适生长pH、生长温度和代谢温度分别是pH7.0、33℃和30℃。利用苯酚羟化酶基因(Lph)、邻苯二酚-1,2-加氧酶基因(C12O)和邻苯二酚-2,3-加氧酶基因(C23O)特异性引物对ZW12总DNA进行PCR扩增,结果Lph基因和C23O基因PCR扩增阳性、C12O基因扩增呈阴性,表明ZW12对苯酚的代谢是通过C23O途径进行的。

一株苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究

苯酚是一种严重污染物,目前的化学降解方法存在众多弊端,生物处理方法越来越受到重视。从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离,得到一株能够利用并降解苯酚的菌株P2。该菌株能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长,经BIOLOG细菌自动鉴定系统及16S rDNA鉴定,该菌株为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)。通过苯酚羟化酶特异性引物的设计,从该菌株扩增出苯酚羟化酶大亚基(LmPH)基因,该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽。苯酚降解实验证实,该菌能在30℃192 h内完全降解500mg/L的苯酚,Cu2+严重抑制该菌株对苯酚的降解,但碱性环境有利于其对苯酚的降解。

一株苯酚降解菌(Alcaligenes faecalis BC2001)的PCR检测及其苯酚降解特性研究

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计一对该基因的特异引物。采用该特异引物从粪产碱菌BC2001总DNA中扩增一条大小为684 bp的片段。将该DNA片段进行序列分析,发现其与Proteobacterium L-18菌(登录号为:AY346142)的基因序列的同源性为97%。另降解试验表明BC2001菌在pH=6时(质量浓度为500mg.L-1)其生长最佳,而在苯酚质量浓度为300 mg.L-1时也是菌株具降解能力的有效例子。

电强化磁固定化菌株Cupriavidus sp.JS耦合体系治理含苯酚废水

为进一步提高含苯酚废水处理效果,从活性污泥中分离纯化得到1株具有高效苯酚降解能力的菌株Cupriavidus sp.JS,并构建了电强化磁固定化菌株Cupriavidus sp.JS耦合体系(以下简称耦合体系)。在好氧条件下比较耦合体系、磁固定化细胞及电极体系中的苯酚降解率及苯酚羟化酶活性,同时,考察重复利用中耦合体系的苯酚降解率、苯酚羟化酶活性及菌株Cupriavidus sp.JS浓度的变化。结果表明,耦合体系的最佳降解电压为1.0 V,此时的苯酚羟化酶活性最大,耦合体系对苯酚的降解率(100.0%)明显高于磁固定化细胞(90.6%)和电极体系(2.1%)之和,表明在耦合体系中生物降解和电极降解间存在耦合协同作用。同时,耦合体系中苯酚降解率、苯酚羟化酶活性及菌株Cupriavidus sp.JS浓度随着重复利用次数的增加而逐渐升高。

一株苯酚高效降解菌2N-17的分离鉴定及其降解特性

用苯酚作为惟一碳源进行驯化从化工厂废水样品中分离得到一株具有较强苯酚降解能力的菌株。经过生理生化以及用编码苯酚羟化酶大亚基基因与16SrDNA序列鉴定,初步确认其为假单胞菌。菌株降解苯酚的特性与条件研究表明,该菌株在35℃、pH值7.5、苯酚600mg·L-1以及添加营养物与一定通气量的条件下能对苯酚很好地进行降解处理。

电强化SBR工艺处理苯酚废水及群落动态解析

为了提高苯酚废水的处理效率,构建电强化SBR体系(简称E-SBR体系),考察了E-SBR体系在施加电压和去除电压后对苯酚和COD的降解效率,利用高通量测序揭示了微生物群落的动态变化规律。结果表明,E-SBR体系施加电压和去除电压后对苯酚和COD的降解效率均显著高于单独的电极体系与单独的SBR体系之和,生物降解和电极降解间存在耦合协同效应。相比于单独SBR体系而言,E-SBR体系微生物群落的多样性和丰富度增强。Bacillus、Pseudomonas、Rhizobium以及Sphingomonas为E-SBR体系中优势菌,其含量显著高于单独SBR体系,施加电场促进了优势菌的生长并且提高了处理效率。

两株假单胞菌降解酚类化合物的特性

从焦化废水中分离得到2株可降解对氯酚的假单胞菌(Pseudomonas)CO-1和CO-44.其最适降解温度为35～40℃,最适pH值为6.0～8.0.菌株降解对氯酚的速度与对氯酚初始浓度呈负相关.2株细菌均能较快地降解苯酚和甲酚,其中CO-1还能够降解1-萘酚和萘.在添加对氯酚的焦化废水中,CO-1和CO-44能够在42h内将苯酚、甲酚和对氯酚完全降解.从2株细菌中均检测到了苯酚羟化酶基因,分别从菌株CO-1和CO-44中检测到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因和邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.

一株高效降酚菌的分离鉴定及降酚特性研究

以苯酚为唯一碳源,采用逐量分批的方法从被酚类物质污染的土壤中驯化、筛选、分离降酚菌,利用形态学、培养特性、生理生化反应以及分子手段鉴定所得菌株,研究了该菌株生长与降酚的关系以及其降酚能力,并设计引物检测降酚酶基因。结果表明,获得的一株高效降酚菌GDYW-0027经鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter),它的生长速率与苯酚的降解速率基本同步,48h内对高质量浓度(2.2g/L)苯酚的降解率为86.73%;在菌株GDYW-0027中检测到苯酚羟化酶及邻苯二酚2,3双加氧酶基因片段,推测其采用间位开环方式打开苯环。