苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

苹果坏死花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

根据GenBank数据库已登录序列设计了12对苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)的检测引物,通过引物筛选和体系优化,建立了以ApN1-F3/R3为引物的ApNMV的TB Green染料法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.3%,相关系数为0.997,灵敏度是常规PCR的100倍。采用q PCR方法对60份田间苹果样品进行检测,结果显示,常规PCR对ApNMV的检出率为51.7%,而qPCR的检出率为56.7%。该技术适用于田间样品的检测。

内蒙古呼和浩特地区苹果坏死花叶病毒的检测与遗传多样性研究

采用RT-PCR方法对从内蒙古呼和浩特地区采集的29份表现花叶症状的海红果(Malus micromalus Makino)叶片样品进行了苹果坏死花叶病毒(ApNMV)的检测,ApNMV的检出率为100%,说明ApNMV在呼和浩特地区表现花叶症状的海红果上普遍发生。分别克隆并测序了29份海红果样品中ApNMV的全长外壳蛋白(CP)基因,结果表明,29个ApNMV分离物CP基因间核苷酸序列一致性为94.1%~99.8%,与NCBI数据库中其他19个ApNMV分离物全长CP基因核苷酸一致性为86.1%~97.1%。利用ApNMV CP基因的全长序列构建了系统发育树,48个ApNMV分离物共分成5个组,本研究中的29个ApNMV分离物与2个日本分离物LC108995和NC040470聚集在一起,形成组Ⅰ;其余ApNMV分离物分别形成了组Ⅱ~组Ⅴ。

苹果坏死花叶病毒烟台分离物的鉴定与序列分析

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对在山东省烟台市采集的31份表现花叶症状的苹果幼叶进行了苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)和苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)检测。结果表明,ApNMV的检出率为87.1%,ApMV未检出,表明ApNMV与烟台地区苹果花叶病高度相关。从‘红将军’苹果和‘长富2号’苹果花叶样品中分别克隆出2条ApNMVRNA3基因组序列,GenBank登录号分别为MN911185和MN911186,这2条分离物核苷酸序列长度分别为1783 nt和1785 nt。序列比对结果显示,2条分离物核苷酸序列相似性为91.71%,与已报道的ApNMV RNA3核苷酸序列一致性为89.88%~96.64%。系统进化分析显示,不同来源的ApNMV亲缘关系较近,分离物之间没有表现出寄主特异性和地域分布规律。研究结果为该病的防治、流行规律的判断以及致病机理研究提供了理论依据。

河北苹果坏死花叶病毒的发生及近全基因组序列的测定与分析

为明确苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)在河北的发生及其基因组特性,本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测,然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明,河北农大果园‘红珍珠’‘锦锈红’‘信侬红’3个品种及保定唐县苹果实验基地富士品种ApNMV检出率分别为9.09%、18.18%、100%和65%。ApNMV阳性果树高通量测序结果显示,果树为ApNMV、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)复合侵染,ApNMV河北分离物(ApNMV-HB)的近全基因组序列包含RNA1~RNA3序列,GenBank登录号分别为OP019626、OP019627和OP019628。RNA1编码120 kD的甲基转移酶/NTP-binding解旋酶(MET/HEL),RNA2编码97 kD的RNA聚合酶(POL),RNA3编码运动蛋白(Movement protein, MP)和外壳蛋白(Coatprotein,CP),4个基因核苷酸和氨基酸序列与代表性分离物相似性分别为89.44%~97.02%、92.14%~98.67%。系统发育关系分析表明,以ApNMV RNA1、RNA2、RNA3(CP和MP)编码的氨基酸为基础构建系统发育树,ApNMV-HB分别与AM95、AM125、XJ、ZZ亲缘关系最近。本研究首次揭示了ApNMV河北分离物的近全基因组序列,丰富了该病毒的基因组序列信息,明确了该分离物与其它分离物的系统发育关系,为进一步了解该病毒的系统发育及遗传进化提供参考。

3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。

中国苹果花叶病病原研究现状分析

我国是世界上最大的苹果生产国,苹果花叶病是苹果栽培中最常见的病毒性病害,在我国各大苹果产区发生普遍。感病苹果叶片常表现花叶、坏死、沿脉形成不均匀分布的条纹等症状,栅栏组织细胞排列松散、叶绿体畸变、膜结构遭到破坏,最终影响叶片光合能力和果实品质形成,严重威胁苹果产业的可持续健康发展。近年来的研究表明,从感花叶病苹果叶片中新鉴定的苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)与我国苹果表现花叶病的相关性较高,可能是引起我国苹果花叶病的主要病原。但也有研究指出,同属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)的苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)也被认为可能是引起我国苹果花叶病的重要病原。为此,笔者依据前人研究基础及本研究室前期研究结果,系统综述了ApNMV与我国苹果花叶病的关系及其研究进展,并分析了ApMV和PNRSV在我国表现苹果花叶病的苹果样品中的侵染状况,旨在进一步明确引起我国苹果花叶病的主要病原,为该病害的科学防控提供参考。

5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。