利用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响

本试验以茄病镰刀菌(Fusarium solani)为研究对象,探索了Hoechst 33342及PI荧光染剂对病菌不同活性孢子的色泽差异,明确了病原菌经Hoechst 33342染色后的活孢子发蓝色荧光,最佳染色浓度和时间为1μg/mL、20 min;碘化丙啶(PI)染色后的死孢子发红色荧光,最佳染色浓度和时间为3μg/mL、10 min。并由此建立了Hoechst 33342-PI荧光双染技术,应用该技术可快速、清晰地甄别出不同浓度氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性和萌发的影响,结果表明,氰氨化钙对茄病镰刀菌的灭杀效果随着浓度增高而增强,且与处理时间呈正相关。2000 mg/L氰氨化钙处理3 h,孢子致死率高达83.97%;500~1000 mg/L处理3 h,孢子致死率为7.15%~26.80%,孢子萌发率为2.40%~3.59%,处理48 h时,孢子致死率达92.07%~100%。250 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱或没有影响。本研究通过菌丝速率法和生物量法进一步验证了应用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响是可行的。这为突破植物病原微生物药剂室内常规筛选方法提供了新的思路和技术手段。

黄瓜茄病镰刀菌拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及促生效果

茄病镰刀菌(Fusarium solani)引起的根腐病严重影响黄瓜产业的可持续发展,为获得高效拮抗黄瓜根腐病的芽孢杆菌并明确其促生效果,从黄瓜根际分离芽孢杆菌,筛选高抗茄病镰刀菌的菌株,并对其进行形态、生理生化、遗传特性及植株促生特性的评价。结果表明,菌株XY-1、XY-13、XY-53抑制茄病镰刀菌效果显著,抑菌率分别为65.90%、66.13%、60.83%,鉴定XY-1、XY-13为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),XY-53为枯草芽孢杆菌(B. subtilis),3个菌株均具有释磷、固氮能力,产蛋白酶和ACC脱氨酶。幼苗促生试验中,接种菌株XY-1、XY-13、XY-53有效促进黄瓜幼苗生长,与对照相比幼苗株高分别增加了37.17%、27.14%、34.94%,叶绿素含量分别增加了31.37%、40.48%、43.43%,地上部鲜重分别增加了33.03%、38.81%、51.52%,地上部干重分别增加了28.66%、29.03%、46.27%。盆栽防效试验中,接种菌株XY-1、XY-13和XY-53不同浓度发酵液10 d后,108 CFU/mL防治效果最优,对黄瓜根腐病防效分别为65.12%、72.09%和82.86%,此外,病原菌侵染下菌株XY-1、XY-13、XY-53促进了幼苗株高、叶绿素含量的增加。总之,XY-1、XY-13和XY-53可作为防控黄瓜苗期茄病镰刀菌引起的根腐病、促进幼苗生长有潜力的生物防治资源用于黄瓜可持续高效生产。

西藏蜂胶抑菌活性及对金钗石斛茄病镰刀菌抑菌机理探究

为探究西藏蜂胶的抑菌活性及对金钗石斛茄病镰刀菌作用机理,以2种细菌3种真菌为供试菌,采用牛津杯法、菌饼法、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)对西藏蜂胶的抑菌活性进行评价。通过研究西藏蜂胶处理后金钗石斛茄病镰刀菌菌丝形态、生长速率、细胞膜通透性及呼吸强度探究其抑菌机理。结果表明:(1)西藏蜂胶具有广谱抑菌性,其抑菌能力显著强于市售蜂胶。(2)以80%乙醇提取剂在pH为6的条件下提取的西藏蜂胶对5种供试菌抑菌效果最佳。(3)西藏蜂胶浓度为10 mg·mL^(-1)时对金钗石斛茄病镰刀菌抑制率达89%,抑菌中浓度(EC50)为2.552 mg·mL^(-1);菌丝体细胞形态由饱满破裂到干瘪,细胞膜通透性增强,内容物泄漏;呼吸强度增大,能量代谢受阻,抑制菌丝体生长。综上所述,西藏蜂胶为天然广谱抑菌剂,利用其防治茄病镰刀菌所引起的植物性病害具有良好的开发前景及研究潜力。

茄根腐病致病病原——茄病镰刀菌及其蓝色变种的生物学特性研究

对造成天津地区茄根腐病严重为害的茄病镰刀菌F0 2 6[Fusariumsolani(mart.)Sacc.]和茄病镰刀菌蓝色变种F0 12 [Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]进行了系统的生物学特性研究。研究结果表明,不同培养基对 2种病原菌的生长、孢子着生等产生不同程度影响。2 6～ 30℃间适于此两种病原菌的生长,低温( <2 0℃)或高温( >35℃)均会对孢子产生及萌发产生抑制作用,尤其是高温甚至会造成孢子畸形;pH在 5～ 8之间适于病原菌的生长;N、P。

基于FDA-PI双荧光复染法的茄病镰刀菌孢子活性检测

【目的】茄病镰刀菌(Fusarium solani)孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂,耗时费力,需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光复染法和流式细胞术(flow cytometry,FCM)的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度,建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性,一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例(0、25%、50%、75%、100%)的茄病镰刀菌样品,分析实测死亡率和理论死亡率的相关性;另一方面,经物理、化学和杀菌剂处理后,比较FDA-PI复染法和孢子萌发法的检测结果。【结果】确定了FDA和PI的最佳染色参数,其中PI的最佳工作浓度为3μg·m L-1,最佳染色时间为4℃处理10 min;FDA的最佳工作浓度为100μg·m L-1,最佳染色时间为25℃处理20 min。用该技术检测已知死孢子比例样品,各样品实测孢子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关(R2=0.99,P<0.05)。经物理和化学处理后,FDA-PI复染法测得的孢子死亡率与孢子萌发法测得的孢子萌发率之间也呈显著负相关(R2=0.99,P<0.05)。经杀菌剂处理后,随着药剂浓度增高,对茄病镰刀菌杀灭效果增强。其中,氰胺化钙处理后,FDA-PI复染法和孢子萌发法检测孢子死亡率结果一致;而咯菌腈和多菌灵处理后,FDA-PI复染法检测孢子死亡率略低于孢子萌发法检测结果。【结论】建立了基于FDA-PI复染法和流式细胞术的茄病镰刀菌孢子活性检测技术,该技术可以替代传统的孢子萌发方法,大幅度缩减病原菌活性检测时间,提高检测效率,对植物病原真菌活性检测平台的建立具有重要的参考价值,将其应用于杀菌剂的筛选还需要进一步的深入研究。

生防菌与茄病镰刀菌在黄瓜根际动态变化

应用荧光定量PCR和稀释分离法检测了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和木霉菌Trichoderma spp.与茄病镰刀菌Fusarium solani f.sp.cucurbitae在黄瓜根际动态变化及其对黄瓜根腐病的防治效果。结果表明,施用500×木霉菌肥、100×枯草芽孢杆菌7 d后对黄瓜根腐病的防效分别为100%和92.5%,14和28 d的防效分别为96.71%、86.76%和85.35%、79.24%;100×枯草芽孢杆菌初始拷贝数为130787 copys/μL,7 d内枯草芽孢杆菌拷贝数下降到51161 copys/μL,14和28 d时数量开始上升到295139和680556 copys/μL。木霉菌肥的变化趋势与枯草芽孢杆菌相同;用枯草芽孢杆菌和木霉菌肥防治黄瓜根腐病后,茄病镰刀菌变化趋势一致,初始拷贝数分别为2.61和15.34 copys/μL,7 d内茄病镰刀菌DNA拷贝数增加明显,100×枯草芽孢杆菌和木霉菌DNA拷贝数分别为11.22和20.98 copys/μL,之后茄病镰刀菌数量保持平稳。经过稀释分离法分离2种生防菌和茄病镰刀菌的数量,变化趋势与荧光定量PCR检测趋势相似。因此使生防菌快速定殖是提高其对土传病害防治效果的重要因素之一。

茄病镰刀菌产生的环孢菌素H的研究——分离纯化和结构鉴别

从茄病镰刀菌 4- 11(Fusarium solani sp.No.4- 11)的发酵产物中分离纯化到一个环孢菌素的同系物 ,经理化性质研究和光谱解析 ,证实它与由多孔木霉 (Tolypocladium inflatum)产生的环孢菌素

树鼩茄病镰刀菌性角膜炎房水中Th1/Th2炎性因子的变化

目的观察树鼩茄病镰刀菌性角膜炎房水中Th1/Th2炎性因子的变化,了解Th1/Th2炎性因子与本病炎症反应的关系。方法茄病镰刀菌培养7 d后收集真菌混悬液,调整孢子密度为10×109CFU·m L-1。清洁级树鼩40只随机分为实验组30只、对照组10只,右眼为实验眼。实验组将真菌孢子混悬液50μL注入角膜基质中央,对照组注入生理盐水50μL。造模后第3天、第7天、第14天,流式细胞仪分析房水中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-4、IL-10的水平;病理学检查观察浸润细胞类型。结果 Th1型细胞因子IL-1β和IL-6浓度均在造模后第7天达到高峰,造模后各时间点与对照组相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05);Th2细胞因子IL-10浓度在造模后第14天达到高峰,造模后第7天、第14天与对照组相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05);IL-4浓度仅在造模后第7天与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。病理学检查结果示:炎症细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验组各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长。结论促炎因子IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10在树鼩茄病镰刀菌性角膜炎炎症反应机制中发挥重要作用。

茄病镰刀菌致小腿慢性溃疡1例报告及病原真菌超微结构的研究

报道1例55岁男性农民,因右小腿溃疡4个月余就诊。取其溃疡组织作真菌培养和病理检查,真菌培养在含氯霉素、放线菌酮和不含氯霉素、放线菌酮的沙堡弱培养基中27℃都长出白色棉絮状菌落,而在不含氯霉素、放线菌酮条件下生长更好;在马玲薯培养基中长出镰刀状大分生孢子,菌种鉴定为茄病镰刀菌。8d后从溃疡处再取标本培养仍为茄病镰刀菌生长。病理切片经银染色后发现念珠状分隔菌丝,用透射电镜对病变组织内的菌体形态进行了超微结构研究。予伊曲康唑口服治疗,但患者未复诊而失访。

一株茄病镰刀菌的代谢产物研究

一株茄病镰刀菌(Fusarium solani)固体发酵培养物经柱层析分离得到10个化合物。通过波谱分析,分别鉴定为对羟基苯甲酸甲酯(1)、水杨酸甲酯(2)、水杨酸戊酯(3)、香草乙酮(4)、草夹竹桃苷(5)、2-甲氧基-4-乙烯苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S,3R,8E)-2-[(2R)-2-hydroxylpal-mitoylamino]-8-octadecene-1,3-diol(7)、1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S,3R,4E,8E)-2-[(2R)-2-hydroxyhex-adecanoylaino]-8-octadecene-1,3-diol(8)、脑苷脂D(9)和脑苷脂C(10)。所有化合物均为首次从茄病镰刀菌中分离得到,其中化合物6首次作为天然产物报道。

茄病镰刀菌对体外培养小鼠角膜基质细胞TLR4表达的影响

目的通过检测茄病镰刀菌刺激小鼠角膜基质细胞后Toll样受体4(TLR4)的表达分布,探讨TLR4在角膜真菌感染中的作用。方法体外培养小鼠角膜基质细胞,采用茄病镰刀菌液(孢子密度为1×106CFU/mL)来刺激传3代的小鼠角膜基质细胞,于刺激0 h(即未刺激)以及3、6、12 h后应用免疫细胞化学染色、RT-PCR法测定各组细胞TLR4蛋白及mRNA的表达,ELISA法测定各组细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。结果培养的角膜基质细胞1周后融合,波形蛋白荧光染色阳性。TLR4蛋白及mRNA在未刺激角膜基质细胞呈微弱表达,3 h较前明显升高,6 h达到高峰,12 h开始减弱,但与0 h相比,差异均有统计学意义(蛋白:t3 h=0.031,t6 h=0.097,t12 h=0.069,P<0.05;mRNA:t3 h=0.367,t6 h=0.422,t12 h=0.078,P<0.05)。TNF-α分泌量随着刺激时间的延长呈上升趋势,6 h达到高峰,然后逐渐下降,3、6、12 h组与0 h组比较差异均有统计学意义(t3 h=21.152,t6 h=40.854,t12 h=27.713,P<0.05)。TLR4mRNA及蛋白的表达与TNF-α的分泌间均呈正相关(r=0.729,0.751,P<0.05)。结论TLR4可能在角膜识别真菌感染、介导炎性防御反应过程中起到重要的作用。

茄病镰刀菌引起儿童角膜溃疡1例

报告茄病镰刀菌引起的儿童角膜溃疡1例。患儿男,7岁,学生。因右眼红肿、疼痛13天之主诉入院。从皮损处取材做真菌检查,直接镜检发现真菌菌丝,3次培养均为同一菌株生长,依据小培养镜下特征鉴定为茄病镰刀菌。依据临床表现及实验室检查诊断为茄病镰刀菌引起的真菌性角膜溃疡。

茄病镰刀菌发酵液中环孢菌素同系物的分离纯化和鉴定

采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、反相制备色谱等方法从茄病镰刀菌FIM116发酵液中分离得到2个环孢菌素同系物,经理化性质和波谱学方法解析,证实其分别与环孢菌素G和环孢菌素T同质。

茄病镰刀菌性角膜炎2例

茄病镰刀菌性角膜炎２例漆军①虞瑞尧①＊赵华①冯毅②史云玲①谢灵③角膜真菌性感染的发病率逐渐上升，真菌性角膜炎能导致失明的严重后果。我们收治了２例茄病镰刀菌性角膜炎患者，报道如下。例１．女，３１岁，吉林四平市人，农民。患者于今年４月１７日劳动时，麦穗刺...

茄病镰刀菌敏感株系对多菌灵抗药性风险及敏感性影响因素的研究

研究了茄病镰刀菌敏感性株系对多菌灵的抗药性风险和菌株的敏感性影响因素。结果表明,茄病镰刀菌敏感株系极易对多菌灵产生抗药性,经亚致死剂量培养7代后抗药性可提高149.26倍;温度,酸碱度,不同含量的氮、磷、钾营养元素会影响茄病镰刀菌对多菌灵的敏感性。

茄病镰刀菌致皮肤透明丝孢霉病1例

目的报告1例茄病镰刀霉引起的皮肤透明丝孢霉病。方法从患者皮损取材作真菌镜检、培养及组织病理学检查。结果直接镜检及组织病理切片均发现真菌菌丝,3次培养均为同一菌株生长。镜下可见大分生孢子基部细胞短、钝圆,小分生孢子呈假头状着生,可见厚壁孢子。根据以上形态学特征鉴定为茄病镰刀菌。结论对于透明丝孢霉病应早期诊断,并进行体外抗真菌药物的敏感试验,明确并有效控制基础疾病。

温度对茄病镰刀菌生长情况及产孢量的影响

目的探讨不同孵育温度对茄病镰刀菌生长状态的影响,为获得大量孢子寻找较好方案。方法茄病镰刀菌按孵育温度不同分为6组,A组、B组、C组、D组、E组分别于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃温箱黑暗孵育7 d,F组于35℃温箱黑暗孵育3 d再于25℃温箱黑暗孵育至7 d,各组在培养24 h、3 d、5 d、7 d时分别用游标卡尺测量各组菌落直径,在培养3d、5 d、7 d时用血平板计数器计数产孢量。结果在20～30℃范围内茄病镰刀菌菌落生长速度随温度升高而增快,在30～37℃范围内菌落生长速度随温度升高而减慢,F组产孢量较多(为1.025×108 CFU/mL),而菌丝相对较少。结论茄病镰刀菌在20～37℃范围内均可以生长,30℃较适合茄病镰刀菌菌落生长,35℃温箱孵育3 d再于25℃温箱孵育至7 d是获得大量孢子而非菌丝的较好方案。

茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型的建立

目的采用临床分离的茄病镰刀菌感染树鼩角膜,建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。方法茄病镰刀菌接种到沙保氏培养基,26℃培养箱培养7 d,收集真菌混悬液,血细胞计数板调整孢子数量为1×10^(10)CFU/m L。清洁级树鼩40只随机分为实验组(n=30)、对照组(n=10)。实验组用胰岛素针头(29 G)将真菌孢子混悬液50μL注入角膜基中央,对照组注入生理盐水50μL。通过前段照相、共聚焦显微镜检查、病理组织学变化、感染角膜组织培养对模型进行评价。结果真菌浸润范围、角膜上皮细胞和内皮细胞水肿程度、菌丝数量均与时间呈正相关;炎性细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长;感染后角膜组织培养可见茄病镰刀菌生长;造模成功率为86%。结论采用基质注射茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。

番木瓜茄病镰刀菌的生物学特性研究

对番木瓜枯萎病菌茄病镰刀菌的生物学特性研究结果表明,茄病镰刀菌生长的温度范围为20～40℃,最适温度为25～30℃,20℃以下和35℃以上生长缓慢,15℃以下不生长。茄病镰刀菌对pH不敏感,pH为3～10范围内均可生长,最适pH为7～10。茄病镰刀菌菌丝在以葡萄糖为碳源的培养基中扩展最快,淀粉中最慢,葡萄糖与其他碳源之间有显著差异。不同氮源培养基中,病菌在以蛋白胨为氮源的培养基中生长最快,在添加磷酸二氢铵的培养基中生长最慢。