番茄茄红素β-环化酶基因高效沉默载体构建

番茄茄红素是番茄果实中含量最多的一种类胡萝卜素,也是植物类胡萝卜素代谢过程中的一个重要中间产物。它的环化是在茄红素β-环化酶(Lyc-b)和茄红素ε-环化酶(Lyc-e)催化下完成的,其中茄红素β-环化酶在番茄茄红素转变为β-胡萝卜素的过程中起主要作用。我们利用RT-PCR方法从番茄叶片中克隆出Lyc-b基因,将PCR产物与pGEM-T载体连接后进行测序,扩增的DNA序列与发表的茄红素β-环化酶序列一致。以此为模板,克隆了400bp左右的目的片段,利用Gateway系统构建Lyc-b基因目的片段的pJawoh18-2b ihpRNA表达载体。经PCR与酶切鉴定的阳性克隆转化农杆菌LBA1100,利用农杆菌叶盘法转化番茄获得了抗性愈伤及再生苗,以检测ihpRNA沉默载体能否降低茄红素β-环化酶基因表达,并为进一步了解该基因在番茄类胡萝卜素代谢过程中的作用奠定基础。这些数据未在本文列出。

胡萝卜茄红素β-环化酶cDNA的分离及其在肉质根中的差异表达

利用 5′和 3′RACE技术从胡萝卜 (DaucuscarotaL .)肉质根中分离了茄红素 β_环化酶基因的全长cDNA。该cDNA长 2 0 89bp ,包含一个 15 15bp的开放阅读框架 ,所编码的肽链长 5 0 5个氨基酸 ,其一级结构与番茄 (Lycoper sicumesculentumMill.)、烟草 (NicotianarusticaL .)和辣椒 (CapsicumfrutescensL .)等植物的茄红素 β_环化酶高度同源。茄红素 β_环化酶在胡萝卜肉质根中的表达受品种特异性的调控 ,在CA2 0 1胡萝卜肉质根中表达十分活跃 ,而在“齐头红”胡萝卜肉质根中该基因的表达受到了强烈的抑制 。

茄红素-β-环化酶反义RNA基因对烟草的遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘法 ,用胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对烟草 SRI野生类型种及Xanthi品种进行了遗传转化。 GU S检测结果表明 ,胡萝卜茄红素 -β-环化酶反义 RNA基因对两个不同烟草材料的遗传转化率均为 4 1 .7% ;Xanthi Southern杂交的阳性率为 6 7% ;

茄红素-β-环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响

以根癌农杆菌GV3101为介导,用茄红素-β-环化酶(lycopene bate cyclase-LYC-B)5′端反义基因对胡萝卜(Daucus carotaL.var.sativa)进行了遗传转化,经胚发生途径得到抗性植株。GUS检测和Southern杂交表明目的基因已整合到胡萝卜基因组中,Dot Blot显示目的基因在受体植株中已表达,茄红素和胡萝卜素检测结果表明,转基因愈伤组织茄红素含量高于胡萝卜素含量。