猪流行性腹泻病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制和应用

为了建立一种快速、高效且灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的现场快速检测技术,本研究以荧光量子点标记鼠抗PEDV单克隆抗体并喷涂到结合垫上,将鼠抗PEDV单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定到NC膜上,分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条,并对其敏感性、特异性及临床样品检测性能进行考察。结果:所制备的荧光试纸条可在20 min内完成临床样品中PEDV的现场检测,最低检测限为3.3×103 TCID50/mL,与猪轮状病毒、猪丁型冠状病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌等常见病原无交叉反应,对50份粪便、粪便拭子和肠道组织等临床样品进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为84.0%。本试验表明该试纸条具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测时间短,操作简便,可用于PEDV的现场快速筛查。

新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A的应用研究

目的探讨新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A(SAA)的应用。方法采用双抗夹心法结合量子点荧光免疫层析技术制备以二硝基苯酚(DNP)-牛血清白蛋白(BSA)系统为质控线的SAA检测试剂盒。通过鸡IgY-羊抗鸡IgY系统作为对照评价了DNP-BSA系统作为质控线的可行性,并通过优化量子点微球与抗体的偶联条件,进一步提高试剂盒的性能,并对试剂盒的空白限、检出限、线性范围、精密度、准确度、特异度、稳定性,以及临床实际样本测定等方面进行了评价。结果以DNP-BSA系统作为质控线的SAA试剂盒受干扰成分浓度的影响小,稳定性高,热稳定性好。量子点微球与SAA抗体偶联比例为100μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L 3-吗啉丙磺酸pH 7.4,与DNP-BSA偶联比例为100μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L吗啉乙磺酸pH 6.0时偶联效果最佳。试剂盒最低检出限为0.5 mg/L;线性范围为1~200 mg/L,R2≥0.99;批内精密度变异系数(CV%)≤5.31%,批间精密度CV%≤15%;在低、高浓度的回收率分别为101.42%、98.83%;在血红蛋白浓度≤5 g/L,胆红素浓度≤0.15 g/L,胆固醇浓度≤15 g/L,甘油三酯浓度10 g/L时,SAA的检测结果无干扰;试剂盒在50℃放置21 d,稳定性良好;试剂盒与Roche的SAA电化学发光试剂盒同步检测67例样本结果具有高度一致性。结论研制的SAA检测试剂盒灵敏度、线性、精密度、准确度、特异度及加速稳定性都满足试剂盒的要求,与鸡IgY-羊抗鸡IgY系统相比DNP-BSA系统作为质控线独立性好,测定临床样本准确度和热稳定性更佳。

口岸快速筛查鲤春病毒血症病毒的超敏量子点荧光免疫层析检测方法的建立

鲤春病毒血症病毒(SVCV)的糖蛋白(G)是最主要的表面抗原,能够诱导机体产生中和抗体,常用作该病毒的免疫诊断抗原。将SVCV G蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备得到G蛋白的单克隆抗体,在此基础上,采用EDC共价偶联标记法将抗体与羧基功能化荧光量子点进行偶联标记,制备成超敏荧光量子点免疫层析快速检测卡。通过建立的SVCV G蛋白超敏荧光量子点免疫层析快速检测体系,检测SVCV G蛋白灵敏度可达到0.1 ng/mL,检测时间为10 min。检测金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)、病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)结果均为阴性,无交叉反应,检测SVCV培养液和鱼类内脏组织样本与实时荧光RT-PCR结果相符合。结论:SVCV抗原超敏荧光量子点免疫层析快速检测卡能达到快速简便、敏感特异的要求,适用于口岸需要提高通关效率的水产品(即检即放)快速筛查,可用于现场诊断及监测防控鲤春病毒血症。

荧光免疫层析技术原理及其在病原微生物检测中的研究进展

荧光免疫层析技术是近年来开发的一种新型免疫检测技术,以荧光微球为标记物,既保留了传统胶体金试纸条检测速度快、价格便宜、操作简单、携带方便等优点,又通过荧光技术提高了检测的灵敏度。荧光免疫层析技术对实验设备、资源的要求低,特别适合在条件有限的实验室及野外开展动物疾病快速诊断。本文详细介绍了荧光免疫层析技术的原理及其在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用研究,以期为病原微生物现场快速诊断技术的开发提供参考。

基于荧光免疫层析法的γ-干扰素释放试验对活动性肺结核的诊断价值

目的 评价荧光免疫层析法(IGRA)的γ-干扰素释放试验对活动性肺结核的诊断价值。方法 回顾性分析2023年1~6月浙江金华广福肿瘤医院疑似或待排肺结核患者758例,均进行IGRA检测。根据最终诊断将患者分为活动性肺结核病组268例和非结核病组490例,探讨IGRA对话动性肺结核的诊断效能。结果 IGRA检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为86.57%、83.06%、73.65%、91.87%。ROC曲线分析得出最佳诊断界值为0.353IU/mL,其检测敏感度及特异度分别为86.57%(95%CI:81.96-90.14)、82.86%(95%CI:79.27-85.94)。结论 IGRA的γ-干扰素释放试验对辅助诊断活动性肺结核具有较好的敏感度和阴性预测值,该检测产品操作简单、报告时间短,非常适用于结核感染的筛查和活动性肺结核的快速辅助诊断。

农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究

【目的】黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,是政府重视、社会关注的一大焦点问题,因此亟需研究建立黄曲霉毒素高灵敏高快速检测方法。目前已研制出高特异性高灵敏度黄曲霉毒素单克隆抗体,本研究旨在应用该抗体,建立黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测技术,为农产品质量监管、风险评估提供技术支持。【方法】本研究通过将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记,利用自主研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行黄曲霉毒素检测,通过检测线T信号值与质控线C信号值的比值和标准溶液浓度的自然对数值实现定量。针对花生、稻米、植物油等不同农产品,研究建立样品粉碎均质提取一体化技术。对铕标记时间分辨荧光免疫层析检测技术进行方法学考核,以花生、稻米、植物油等为例,进行实际样品检测,并与HPLC法进行结果比对。【结果】在花生、稻米、植物油等农产品实际样品检测中,本研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B1得到检测限均为0.3μg·kg-1,线性范围分别为0.8—25、0.8—15和0.8—30μg·kg-1。上述3种农产品对应的标准曲线的线性方程分别为y=0.238x+0.654(R2=0.992)、y=0.321x+0.811(R2=0.990)和y=0.146x+0.173(R 2=0.993),标准偏差分别为0.024、0.039和0.021。该方法的批内准确度和精密度添加回收试验结果表明,添加回收率在81.0%—113.0%,变异系数在7.2%—14.2%;批间准确度和精密度试验结果显示,添加回收率在75.8%—114.9%,变异系数在7.7%—15.3%。说明该检测技术批内、批间均具有良好的准确度和精密度。该方法与HPLC法检测结果相比,相对误差小于10%,说明黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析技术与行业标准方法检测结果具有良好的一致性。【结论】时间分辨荧光免疫层析检测技术灵敏度高、线性范围宽,重复性和稳定性好,是一种适合中国国情的实用快速检测技术,具有广阔的应用前景。

时间分辨荧光免疫层析试纸条在油料饼粕黄曲霉毒素B_1检测中的应用

采用黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条及配套的时间分辨荧光速测仪,对油料饼粕中黄曲霉毒素B1的快速检测进行了应用研究。该时间分辨荧光免疫分析技术是基于时间分辨荧光免疫层析试纸条和载有Eu（Ⅲ）标记特异性单克隆抗体的样品瓶建立的检测技术。时间分辨荧光速测仪可内置标准曲线,直接输出检测结果。对6种油料饼粕做黄曲霉毒素B1添加回收率实验,回收率在70%~120%之间,批间、批内变异系数〈15%。在实际样品的检测中,时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术与液相色谱-串联质谱法相比,检测结果相对误差〈15%。时间分辨荧光免疫层析试纸条检测技术测定快速、准确,技术稳定、可靠,设备经济、小型,适用于大批量油料饼粕样品的快速检测和风险评估。

ELISA法和荧光免疫层析法检测马尔尼菲蓝状菌抗原的应用价值

目的评价双抗体夹心ELISA法和荧光免疫层析法检测马尔尼菲蓝状菌Mp1p抗原的临床应用价值。方法用ELISA法和荧光免疫层析法检测335例住院患者血清中的马尔尼菲蓝状菌抗原,比较2种方法检测结果与血培养结果的一致性。结果以血培养结果为金标准,ELISA与荧光免疫层析法检测马尔尼菲蓝状菌抗原的敏感性分别为75.0%和78.1%,特异性均为100%,准确度分别为97.6%和97.9%,Kappa值分别为0.844和0.866。结论双抗体夹心ELISA法和荧光免疫层析法检测马尔尼菲蓝状菌抗原快速、简便,结果可靠,适用于临床急性期马尔尼菲蓝状菌感染的辅助诊断。

3种β_2-受体激动剂荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究

本研究旨在制备性能优异的克伦特罗(clenbuterol,CLB)、莱克多巴胺(ractopamine,RAC)和沙丁胺醇(salbutamol,SAL)荧光免疫层析快速定量检测试纸条,并对该试纸条的检测范围、检测限、准确度、精确度、假阳性、假阴性及其与仪器方法的符合率进行评价。结果显示,克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇试纸条标准曲线范围分别为0~3.2、0~6.4、0~8.0μg/L;克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇试纸条检测下限分别可达0.2、0.4和0.5μg/L;克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇与其他8种同类药物交叉反应均成阴性,特异性良好;各批添加回收率在60%~120%之间,准确度达到要求;不同克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇浓度下变异系数(CV)均小于15%,符合精密度标准;猪尿中假阳性率和假阴性率均为0;此外与仪器方法的符合率为100%。试纸条适用于猪尿中克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留快速检测,具有灵敏度高、稳定性好和特异性强的特点。

克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究

本研究旨在制备性能优异的克伦特罗（clenbuterol,CLB）荧光免疫层析快速定量检测试纸条,为实现其产业化应用奠定基础。采用荧光胶乳微粒为标记物,以抗原包被浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度及层析时间为单因素优化制备了CLB荧光免疫层析试纸条,并对该试纸条的检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价。最佳制备条件：抗原包被浓度2.0mg/mL,膜干燥时间5d,混匀反应时间1min,反应温度25℃,层析时间15min。评价结果显示,试纸条检测限可达0.35μg/L;CLB与其他8种同类药物交叉反应率均小于0.8%,特异性良好;各批添加回收率在80%-120%之间,准确度达到要求;不同CLB浓度下变异系数（CV）均小于5%,符合精密度标准;此外,稳定性试验验证了该试纸条稳定性良好。

荧光免疫层析法降钙素原检测试剂盒临床性能评估

目的评估荧光免疫层析法试剂盒检测降钙素原的性能。方法参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)EP5-A和EP6-A文件方法,对荧光免疫层析法试剂盒(TEBSUN)检测降钙素原的精密度、线性、方法学比对、相对灵敏度和特异性进行评估。结果荧光免疫层析法试剂盒检测降钙素原精密度较好,低浓度和高浓度样本精密度的变异系数分别为8.3%和4.7%;线性验证试验结果显示,在试剂盒标示的检测范围内具有良好的线性梯度关系(r=0.9989);方法学比对结果显示,荧光免疫层析法试剂盒与梅里埃VIDAS酶联免疫荧光法分析系统的降钙素原试剂盒检测结果一致性良好(r=0.9770);在0.5和2.0 ng/ml两个浓度水平,荧光免疫层析法试剂盒相对于酶联免疫荧光法试剂盒的灵敏度和特异性均大于86%,与其测定结果的总体符合率为93.75%。结论荧光免疫层析法试剂盒检测降钙素原的精密度、线性、方法学比对、相对灵敏度和相对特异性等性能评价较好,适用于临床标本检测。

基于荧光免疫层析法建立甲型流感病毒快速检测技术的研究

目的基于荧光免疫层析技术平台,针对甲型流感病毒抗原,开发甲型流感病毒快速诊断试剂。方法利用荧光微球标记甲型流感病毒单克隆抗体、生物素标记甲型流感病毒单克隆抗体以及包被亲和素和羊抗鼠IgG多克隆抗体的检测卡,构建甲型流感病毒检测体系。通过原料评价、校准曲线、空白限、准确度、线性范围、重复性、热稳定性及临床比对,验证试剂诊断性能。结果本研究得到的荧光免疫层析试剂具有准确度高、检测范围宽、重复性和热稳定性好等优点,其正确率及敏感率均明显高于经典的胶体金试剂。结论本研究应用将为国境口岸或医院的甲型流感病毒快速筛查提供方便、快捷、灵敏的技术手段。

高敏定量荧光免疫层析法、ELISA法检测猪、牛、羊O型口蹄疫病毒抗体的临床对比试验

为了将新型的O型口蹄疫病毒抗体高敏定量荧光免疫层析技术应用于天津市基层检测,将该技术与实验室常用的液相阻断酶联免疫吸附法（ELISA）进行了对比试验,对100份猪血清、100份牛血清、50份羊血清进行检测,猪、牛、羊的O型口蹄疫病毒抗体高敏定量荧光免疫层析法准确度分别为90. 0%、95. 0%、82. 0%,特异性分别为89. 2%、100%、85. 7%,敏感性分别为90. 5%、94. 9%、80. 6%。猪、牛、羊的O型口蹄疫病毒抗体高敏定量荧光免疫层析法与液相阻断ELISA方法的符合率分别达到90. 0%、95. 0%、82. 0%。说明利用高敏定量荧光免疫层析技术可在基层现场对家畜O型口蹄疫病毒抗体进行检测,能够及时有效地评价O型口蹄疫疫苗的临床免疫状况。

二维Otsu和改进区域生长法的荧光免疫层析试条浓度的定量检测

目前荧光免疫层析试条的定量检测方法绝大多数采用光电反射法,该方法需要对试条进行高精度的定位并且需要复杂的传动装置。利用CMOS图像传感器获取荧光免疫层析试条的图像信息,采用图像分割方法用于荧光免疫层析试条检测线和质控线进行自动识别,首先对采集到的原始图像进行增强预处理,并进行初步分割。然后选定处理后图像的种子点并通过改进的二维Otsu法选取生长阈值对图像进行区域生长,以实现对图像检测线和质控线的分割。结果表明该方法能够在目标和背景对比度很低的情况下,将图像检测线和质控线的轮廓清晰的分割出来,且区域一致性测度和对比度都比较理想。该方法检测不同浓度的试条,得到的特征值重复性小于5%,线性度大于0.99,准确度大于0.98。实验证明用该方法对荧光免疫层析试条进行定量检测是可行的,且较对比仪器具有更宽的检测范围。

牦牛肉中阿维菌素残留的时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

为建立定量检测牦牛肉中阿维菌素残留的时间分辨荧光免疫层析方法,以羧基化铕微球作为荧光标记物,与阿维菌素鼠单克隆抗体G10703进行共价偶联后喷涂于释放垫上,将阿维菌素抗原和羊抗鼠免疫球蛋白G分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C),制备免疫层析试纸条;利用牦牛肉样本阿维菌素添加量和对应的T线与C线荧光信号峰值比值(T/C)拟合得到四参数标准曲线,建立牦牛肉中阿维菌素残留的时间分辨荧光免疫层析检测方法,并对所建立方法的灵敏度、准确度、特异性、精密度和稳定性等进行评价,用液相色谱-串联质谱方法对所建立方法的性能进行确证。结果表明:本方法对牦牛肉中阿维菌素的定量限为1.0μg/kg,加标回收率为86.9%~105.2%,与阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素及依普菌素的交叉反应率分别为100.0%、73.1%、42.6%和97.5%,批内变异系数为5.4%~9.5%,批间变异系数为7.5%~11.2%,该方法准确度、精密度、灵敏度均较高,且性能稳定。

CA242荧光免疫层析定量检测试剂的建立

目的为临床研制一种操作简易,灵敏度高的荧光免疫层析试纸条,用于定量检测CA242。方法采用双抗体夹心法和荧光免疫层析技术,将标记抗体L1与荧光微球结合于聚酯膜结合垫上,检测抗体C包被在硝酸纤维素膜上作为检测线(T),另将质控抗体Q1(羊抗鼠IgG)包被在相互平行的硝酸纤维素膜上作为质控线(C),过量的鼠源标记的荧光微球在质控线处聚集产生质控荧光信号,待测样中的CA242在T处形成荧光微球抗体-抗原-抗体的夹心复合物M2并产生荧光信号,通过荧光检测仪计算出定量结果。结果试纸条检测CA242灵敏度最低可达0.52kU/L,与CEA、CA125无交叉反应,批内CV为3.74%,批间CV为6.34%。与TrFIA方法比较相关性较好,R^2=0.9694;同一批试剂4℃放置6个月后,用100kU/L浓度的标准品进行测试,结果显示荧光计数CV为2.43%。结论该荧光免疫层析试纸条,可以提供较高的灵敏度和特异性,操作简单,能适合临床工作的需要。

呋喃西林代谢物单克隆抗体及荧光免疫层析试纸条的制备

为建立一种基于荧光免疫层析技术的呋喃西林代谢物的快速检测方法,采用活性酯法合成呋喃西林代谢物(氨基脲盐酸盐)(semicarbazide hydrochloride,SEM)人工抗原,并获得SEM的单克隆抗体,通过将量子点微球(quantumdot submicrobeads,QBs)与SEM偶联,得到QBs探针,制备荧光免疫层析试纸条。结果表明:SEM免疫荧光层析试纸条检测鱼肉组织的检测限为0.247?μg/L,不同添加质量浓度的回收率均在70%～120%之间,批内、批间变异系数均在15%以下,符合我国动物源食品中兽药残留检测方法相关指导文件的规定,且在2～8℃条件下可以保存6个月以上,稳定性良好。

苯乙醇胺A荧光免疫层析试纸条的制备及特性

为通过荧光免疫层析技术制备一种快速、灵敏、特异性强的尿液中苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PEAA)的检测方法,采用重氮化法合成PEAA人工抗原,并通过免疫、融合、有限稀释法获得特异性抗PEAA的单克隆抗体,通过将量子点微球与PEAA偶联,制备荧光免疫层析试纸条。结果表明:PEAA免疫荧光层析试纸条的检测限为0.496μg/L,回收率在80%~120%之间,批内、批间变异系数均小于10%,与其他类似物的交叉反应率小于5%,特异性良好。说明将荧光免疫层析技术应用到PEAA检测中是可行的,且制备的PEAA荧光免疫层析试纸条灵敏度高、准确性好、特异性好,应用前景广阔。

牛血清淀粉样蛋白A时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒研制

本研究旨在研制一种牛血清淀粉样蛋白A(SAA)时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒,用于牛奶中SAA含量的临床快速检测。采用双抗体夹心法结合荧光免疫层析技术,在结合垫上固定荧光微球标记的抗SAA单克隆抗体及荧光微球标记的鸡IgY的混合物,在硝酸纤维素膜的检测区包被另一株抗SAA单克隆抗体,在硝酸纤维素膜的质控区包被山羊抗鸡IgY。经抗体原料筛选及荧光微球标记抗体的工艺优化后,绘制标准曲线并对试剂盒的空白限、精密度、稳定性及样本测试性能进行初步评估。结果显示,Medix SAA-2单克隆抗体包被与YBX SAA-3单克隆抗体标记为最适抗体配对原料。荧光微球标记抗体的工艺中,荧光微球与抗体的质量投料比为40∶1、偶联剂与荧光微球羧基摩尔比为2∶1的条件为最优组合。试剂盒标准曲线的四参数拟合曲线方程为y=(1.03947-0.00182)/[1+(x/12.08222)×(-0.84692)]+0.00182,线性相关系数R 2=0.9997。研制的牛SAA检测试剂盒空白限为0.052 mg/L。精密度测试结果显示,批内变异系数<15%,批间变异系数<20%。室温稳定性试验表明,试剂盒在室温密封存放6个月的荧光T/C值相对跌幅约15%。自制试剂盒与上海蓝基试剂盒的样本对比测试相关系数R 2为0.97。综上所述,本试验研制的试剂盒具有操作简便、灵敏度高、成本低廉等优点,能满足临床测定需求,可作为一种新型牛SAA检测的快捷、准确的检测手段。

荧光免疫层析试条定量检测仪的研制

为了对AMI疑似患者进行现场快速筛查,研制了一款可对AMI荧光免疫层析试条进行定量、快速检测的仪器。该仪器主要由光路单元、数据采集单元、处理及显示单元组成,激发光聚焦于试条上产生荧光,荧光通过收集光路聚焦于线阵CCD,ARM9芯片通过CCD的灰度值对试条进行判断。测试结果表明,仪器检测得到试条的相对荧光强度与心肌标志物浓度成正比,该仪器可实现对患者心肌标志物浓度的定量检验,为患者病情的诊断和康复提供了有力保证。